腫瘤免疫治療的下一個“頂流“NK 細胞

　　隨著新冠疫情防控政策的放開，越來越多人中招進入“羊圈”。有專家根據數學模型測算，中國最終可能有80%至90%的人會感染新冠病毒。這是一場不可避免的戰爭。免疫力是人體自身的防禦機制，是戰勝病毒的終極武器。免疫力的強弱與機體的免疫細胞息息相關。而NK細胞是固有免疫細胞家族中的重要成員，常年奮戰在人體抵抗癌細胞和病毒感染的第一道防線上，是守衛人體健康的生力軍。有科學研究表明：自然殺傷細胞（natural killer cells ，NK細胞）數量充足且活性更好的患者，病毒載量下降更快，症狀或更輕！

　　本文將圍繞NK細胞的發育和分類、NK細胞的啟動和抑制信號、腫瘤微環境中的NK細胞、NK細胞相關免疫治療等方面展開，帶大家認識一下NK細胞~

　　1　　NK細胞的發育和分類

　　目前主流的NK細胞發育模型認為，NK細胞來源於骨髓中的CD34+CD45RA+造血祖細胞(HPCs)。在骨髓中，NK細胞由HPCs通過常見的淋巴樣祖細胞(CLPs)和NK細胞前體(NKPs)發展而來，然後遷移到外周血(Conventional NK cells, cNK細胞)或組織(tissue-resident NK cells, trNK細胞)。trNK細胞的分化發生在不同的組織部位，包括肺、胸腺、肝臟、子宮、皮膚、皮下脂肪組織和腎臟。在這些位點，NK細胞具有不同的表型特徵和功能，構成了NK細胞在不同成熟階段的迴圈。除了不同的組織類型外，即使在同一器官和同一組織中，NK細胞也具有高度的異質性。

圖1. NK細胞的發育和亞群[1]

　　NK細胞通常根據表面蛋白CD56和CD16的相對表達分為兩類：CD56brightCD16-(免疫調節，細胞因數產生)和CD56dimCD16+(細胞毒性)。其中，CD56dimCD16bright占全部NK細胞的90%，CD56brightCD16neg/dim只占約10%。CD56bright NK細胞是強大的細胞因數生產者，除非被IL-15等促炎細胞因數啟動，否則具有弱細胞毒性。相比之下，CD56dim NK細胞群可以介導感染和/或惡性細胞的系列殺傷，主要是通過含有顆粒酶B和穿孔素的預先組裝的細胞溶解顆粒的胞吐作用，最終誘導靶細胞凋亡。

圖2. NK細胞的表型及功能[2]

　　2　　NK細胞的啟動和抑制信號

　　NK細胞作為固有免疫的主要效應細胞類型，能夠在早期殺傷腫瘤細胞和病毒感染細胞。它們依靠“迷失自己”（missing-self）和“誘導自己”（induced-self）模式來識別靶細胞，在啟動信號和抑制信號之間保持精確的平衡。這些相互作用的信號最終決定了NK細胞的啟動和功能狀態。NK細胞啟動信號包括細胞因數結合受體、整合素、殺傷受體(CD16、NKp40、NKp30和NKp44)、識別非自身抗原的受體(Ly49H)和其他受體(如NKp80、SLAMs、CD18、CD2和TLR3/9)。總的來說，根據配體的不同，NK細胞的啟動受體至少可以分為三種類型，包括MHC-I特異性受體、MHC-I相關受體和MHC-I非相關受體。

　　NK細胞抑制信號主要包括識別MHC-I的受體，如Ly49s、NKG2A和LLT1，以及一些MHC-I非相關受體。此外，MHC-I特異性抑制受體根據結構和功能一般可分為三種類型：殺傷細胞免疫球蛋白樣受體(KIRs)、殺傷凝集素樣受體(KLRs)和白細胞免疫球蛋白樣受體(LILRs)。

圖3. NK細胞功能受細胞表面受體和細胞因數的調節[3]

　　3　　腫瘤微環境中的NK細胞

　　腫瘤微環境（tumour microenvironmentm, TEM）高度複雜且不斷發展，其可維持腫瘤生長並影響免疫逃逸和惡性腫瘤進展，除了基質細胞、成纖維細胞和內皮細胞外，TME還包括固有免疫細胞和適應性免疫細胞。NK細胞常見於人類腫瘤的TME，包括原發腫瘤、轉移灶和腫瘤浸潤淋巴結。當NK細胞被整合素、趨化因數受體和選擇素招募時，它們從血液中滲出，穿過ECM和腫瘤間質，到達腫瘤床。在TME中，NK細胞通過脫顆粒、ADCC或 FASL/TRAIL誘導的凋亡消除腫瘤。此外，NK細胞還可以分泌細胞因數或趨化因數來招募其他免疫細胞，並上調其抗腫瘤反應。NK細胞的反應性往往受到腫瘤細胞或其他細胞分泌的抑制因數或細胞與細胞直接相互作用的阻礙。

　　臨床統計資料表明，TME中NK細胞的豐度預示著幾種癌症患者的預後更好，包括肝細胞癌(HCC)、黑色素瘤、乳腺癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、鱗狀細胞肺癌、肺腺癌、腎細胞癌、胃癌。這種浸潤不僅增強了對靶細胞的直接殺傷，而且還提供了免疫調節細胞因數，從而形成適應性免疫反應。

圖4. 腫瘤微環境中的NK細胞[4]

　　4　　NK細胞相關免疫治療

　　NK細胞能夠識別並與腫瘤細胞反應，是一種重要的抗腫瘤免疫療法效應器。近年來，NK細胞相關免疫治療的研究蓬勃發展，最新的進展主要集中在細胞因數療法、過繼性NK細胞療法、基因工程化NK細胞療法、單克隆抗體和NK細胞銜接器等方面。此外，基於NK細胞的治療無論是單獨使用還是與其他治療方法聯合使用都取得了良好的效果，這表明它在惡性腫瘤中具有廣泛而有效的應用前景。

圖5. 基於NK細胞的治療策略[5]

　　1) 細胞因數療法

　　據報導，IL-2可以直接刺激T細胞和NK細胞的增殖和啟動。因此，IL-2經常被用於在體外啟動NK細胞，然而它在體內的使用受到毒副作用和啟動免疫抑制性調節性T細胞（Treg）的限制。為優化IL-2作為免疫治療劑的療效，研究人員對IL-2進行了修飾或工程化處理以誘導NK細胞的更大啟動和擴張，同時減少Treg細胞的擴張。

　　IL-15是有望替代IL-2功能的細胞因數之一，它可以刺激NK和CD8+T細胞，但是不會啟動Treg細胞。目前，多款IL-15重組蛋白正在臨床試驗中接受檢驗。此外，其他可用於啟動NK細胞的細胞因數有IL-12、IL-18、IL-21，以及TGFβ抑制劑。

　　2) 過繼性NK細胞治療

　　大多數以NK為基礎的過繼轉移治療從各種來源獲取NK細胞，通過各種方法增強其體外功能，然後將其注入癌症患者體內。自體和同種異體NK細胞都可以作為過繼性NK細胞療法的來源。目前，同種異體的NK細胞來源多種多樣，包括外周血NK細胞、來自臍帶血或胎盤的NK細胞，以及從誘導多能幹細胞（iPSC）分化生成的NK細胞。有些研究顯示，臍帶血來源的NK細胞更容易培養並且啟動，不過從成人外周血中獲得的NK細胞更具有天然的細胞裂解能力。NK細胞系（比如NK92）和iPSC細胞系可能提供可以重複再生的NK細胞來源。

　　3) 基因工程化NK細胞療法

　　通過嵌合抗原受體(CARs)對免疫細胞進行基因修飾，直接靶向腫瘤細胞是一種很有前途的癌症治療方法。在NK細胞表面表達靶向腫瘤抗原的CAR可以賦予NK細胞靶向特定腫瘤的能力。與CAR-T相比，CAR-NK治療的優勢很明顯，包括識別腫瘤的可能性更高（包括細胞因數和凋亡），細胞因數釋放風暴（cytokine releasing storm , CRS）的發生率更低。而且即使CAR-NK細胞失去了CAR，仍然可以通過內在表達的啟動性受體識別和殺傷腫瘤細胞。

　　4) 單克隆抗體

　　根據抗體的靶向不同，可以分為兩類：

　　一類是靶向腫瘤相關抗原的治療性抗體，例如靶向表皮生長因數受體（Epidermal Growth Factor Receptor, EGFR）的西妥昔單抗（Cetuximab）、靶向CD20的利妥昔單抗（Rituximab），通過NK細胞誘導ADCC效應達到治療目的；另一類是直接靶向NK細胞抑制受體的抗體，例如靶向NKG2A的莫那利珠單抗（Monalizumab），活化NK細胞對腫瘤細胞進行殺傷。

　　5) NK細胞銜接器

　　各種免疫逃避機制限制了NK細胞在體內與腫瘤細胞的結合程度，是實現廣泛有效的NK細胞治療的主要障礙。為了增強腫瘤浸潤性NK細胞的自然細胞毒性，許多研究團隊已經在開發一些分子，使這些細胞以抗原特異性的方式與腫瘤細胞接觸。這些分子通常是由多個抗體（通常為單鏈抗體）組成的雙特異或三特異性接合器，可以同時靶向腫瘤細胞抗原以及NK細胞活化受體，將NK細胞和腫瘤細胞“拉攏”在一起，進而引發NK細胞殺傷腫瘤細胞。

　　5　　NK細胞研究相關小鼠模型

　　基於現有研究，南模生物自主研發了一系列NK細胞相關工具鼠，如Cre工具鼠，螢光報告工具鼠和DTR工具鼠等。Cre工具鼠跟特定的flox小鼠交配，可實現在NK細胞中敲除或者敲入目的基因，完成對基因在NK細胞中的功能研究；螢光報告工具鼠是通過在小鼠marker基因處敲入報告基因構建而成，可以達到在體內標記NK細胞的目的；DTR工具鼠則是在小鼠marker基因位點敲入DTR（diphtheria toxin receptor，白喉毒素受體），可以用於研究巨噬細胞在免疫系統中的作用；NVG-hIL15小鼠模型是對M-NSG小鼠Il15基因進行人源化修飾構建而成，在進行免疫系統重建時，可以得到更高比例的NK細胞，用於CAR-NK細胞治療等方面的藥效研究。

Reference:

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