靶向ADCC：發掘NK細胞癌症治療的潛能

前言

抗體依賴性細胞介導的細胞毒性（ADCC）是一種有效的細胞毒性機制，主要通過自然殺傷（NK）細胞介導。當特異性抗體結合到靶向細胞膜上以後，免疫細胞通過該反應誘導細胞死亡。這是抗體限制和控制感染的幾種主要機制之一。抗體和免疫細胞的相互作用通過一個受體家族發生：Fc受體（FcR）。在人類中，IgG的FcR家族（FcγR）由6個受體組成：FcγRI／CD64、FcγRIIa／CD32a、FcγRIIb／CD32b、FcγRIIc／CD32c、FcγRIIIa／CD16a和FcγRIIIb／CD16b，其中CD16a主要負責觸發NK細胞介導的ADCC。因此，對CD16a作用機制的瞭解，有助於我們通過改善單克隆抗體最大限度地發揮NK細胞的潛力，從而擴大癌症免疫治療的範圍。

ADCC的作用機制

NK細胞是一種天然的淋巴細胞，能夠非常有效地破壞應激細胞，如病毒感染或腫瘤轉化細胞。通常情況下，ADCC效應主要通過結合FCR的抗體啟動NK細胞，NK細胞膜上最具特徵的FcR就是FcγRIII（CD16），其中NK細胞主要表達CD16a，而CD16b僅限於中性粒細胞。人類NK細胞分為兩個主要亞群：CD56bright和CD56dim。CD56brightNK細胞是強有力的細胞因數產生者，但缺乏CD16a；而CD56dim具有高度的細胞毒性，表達CD16a。

當通過CD16a識別IgG調理的靶點時，NK細胞就會釋放不同的細胞毒性分子，從而引發靶細胞的死亡。這種機制依賴於免疫突觸的形成和含有穿孔素和顆粒酶的溶解顆粒的脫顆粒。除了脫顆粒外，NK細胞還可以通過將靶死亡受體（如DR4、DR5或Fas）與其死亡受體配體（如FasL和TRAIL）結合來清除靶細胞。

CD16a的生物學

CD16a是一種跨膜受體，具有短的C－ter胞質尾，並具有兩個細胞外Ig樣結構域。它的細胞內部分不具有任何信號成分，因此，為了傳遞信號，它需要兩條帶有免疫受體酪氨酸基啟動基序（ITAM）的信號鏈。

CD16a與IgG的CH2以1：1的方式相互作用，其中CH2上的N297位的 N－聚糖鏈在這種相互作用中也起著關鍵作用。因此，不僅氨基酸序列，其聚糖組成都可以極大地影響CD16a對Fc的親和力，從而影響ADCC的效力。

CD16a在其細胞質尾部不具有任何ITAM結構域，因此需要兩條含有ITAM結構域的細胞內鏈串聯的幫助，CD3ζ和Fc?RIγ。CD16a結合後，屬於Src家族的激酶Lck被啟動，並磷酸化CD3ζ和／或Fc?RIγ的ITAM結構域。磷酸化的ITAM允許來自Syk家族的激酶招募和磷酸化，例如Syk和ZAP－70，它們反過來負責後續的信號傳導。在它們的底物中，PI3K是高度相關的，因為它將PIP2轉化為PIP3，PIP3經PLC－γ處理後釋放IP3和DAG。DAG啟動PKC家族，這有助於觸發脫顆粒。IP3誘導鈣從內質網釋放，這種鈣內流是ADCC觸發的主要信號之一，也導致核內NFAT易位，誘導其靶基因的轉錄。CD16a參與啟動的其他途徑也有助於ADCC，例如ERK2 MAPK途徑。

CD16a依賴性NK細胞殺傷後，CD16a迅速下調。CD16a脫落的機制之一是由去整合素和金屬蛋白酶17（ADAM17）介導的，後者在NK細胞上表達。ADAM17對CD16a的切割發生在順式結構中，這意味著表達ADAM17的NK細胞不能在另一個NK細胞上誘導CD16a脫落。啟動後CD16a下調的另一個機制是內化，這不僅發生在CD16a上，也發生在其他細胞內信號成分上，如CD3ζ、ZAP－70和Syk。

提高ADCC作用的策略

細胞因數

提高ADCC活性的一個簡單方法是用促炎細胞因數刺激NK細胞。NK細胞移植已在多個臨床試驗中成功進行，例如通過輸注細胞因數誘導記憶樣（CIML）NK細胞，最常用的細胞因數組合包括IL－12、IL－15和IL－18。CIML NK細胞比傳統NK細胞表達更多的IFN－γ，對白血病細胞和原發性急性髓系白血病（AML）母細胞顯示出優越的細胞毒性。

IL－12會增加NK細胞產生IFN－γ和TNF－α，在一項I／II期臨床試驗中，西妥昔單抗與IL－12聯合應用於無法切除或復發的頭頸部鱗狀細胞癌患者。與無進展生存期（PFS）小於100天的患者相比， PFS大於100天的患者NK細胞在體外具有更高的ADCC活性。

IL－15是NK和CD8＋T細胞生存和功能所必需的細胞因數。N－803是一種突變的N72D IL－15超激動劑，在臨床前模型和臨床試驗中顯示出增強的NK細胞體外和體內活性。此外，它還增加了NK和CD8＋T細胞的數量。

抑制ADAM17

ADAM17是啟動後CD16a下調的主要驅動因素。改善NK細胞ADCC的一種策略是通過靶向ADAM17來防止CD16a脫落。研究發現，對NK細胞中使用CRISPR／Cas9技術敲除ADAM17，顯示出更好的IFN－γ生成和體內外ADCC活性。然而，也有研究顯示，阻斷ADAM17降低了NK細胞的存活率以及CD16a介導的連環殺傷，細胞無法與靶細胞分離，阻礙其運動到另一個靶細胞。

總之，ADAM17抑制的益處尚不清楚，結果也有爭議。這一策略是否能夠成功，有待于一項正在進行的臨床試驗（NCT04023071）結果，該試驗將評估攜帶不可切割CD16a的iPSC衍生NK細胞在AML和B細胞淋巴瘤中的應用。

工程化抗體

抗體的Fc部分進行工程化改造，可以增加Fc對CD16a的親和力，並隨後改善ADCC。一些突變非常流行，例如，所謂的GASDALIE，由Fc中的4個替換組成：G236A／S239D／A330L／I332E。該突變顯示對CD16a的親和力顯著增加，而CD32b親和力幾乎沒有增加。

另一個突變稱為突變體18（F243L／R292P／Y300L／V305I／P396L），ADCC顯著增加。這些突變現已作為抗HER2抗體margetuximab進入臨床，並在I期治療各種HER2陽性癌時顯示出良好的效果。

此外，抗體Fc N－聚糖的糖工程化有望增加對CD16a的親和力。研究最多的糖修飾是去糖基化，例如去岩藻糖修飾。這種修飾導致與CD16a的結合增加，ADCC改善。這項技術已被用於抗CD20抗體obinutuzumab。

NK細胞接合器

除了工程化抗體之外，還可以研究抗體的形式。基於雙特異性T細胞接合器（BiTE）策略的成功，為NK細胞開發了一種類似的形式，即所謂的雙特異性殺傷細胞接合器（BiKE）。BiKE由兩個scFv通過連接序列組成，一個單鏈抗體靶向CD16a，另一個靶向腫瘤抗原。

此外，還有三特異性殺傷細胞接合器（TRiKE），有2種腫瘤抗原與CD16a一起被靶向，或者添加IL－15代替第三種單鏈抗體。這種結構的使用允許NK細胞重新定位到腫瘤細胞，並導致針對靶細胞的強大ADCC作用。

AFM13是一種針對CD16a和CD30的雙特異性抗體，目前處於臨床Ⅱ期，用於治療外周T細胞淋巴瘤、轉化型蕈樣變性和霍奇金淋巴瘤。在一項治療復發或難治性霍奇金淋巴瘤的Ib臨床研究中，AFM13與pembrolizumab的聯合治療產生了88％的客觀反應率，總反應率為83％。GTB－3550是一種CD16／CD33／IL－15的TRiKE形式，目前正在進行多種類型白血病的I／II期試驗研究（NCT03214666）。

調節代謝途徑

代謝失調是腫瘤微環境中免疫抑制的關鍵驅動因素，許多研究已經表明，免疫細胞代謝對其功能至關重要。最近，一些代謝藥物在增強NK細胞活性方面顯示出有希望的結果。二甲雙胍，被證明可以增加免疫細胞配體的表達，尤其是ICAM－1的表達。ICAM－1是一種整合素，可以調節淋巴細胞細胞內信號，包括NK細胞。二甲雙胍與UCB聯合使用擴增NK細胞在體外和體內顯示出更高的腫瘤細胞清除率。

此外，另一種策略是直接調節NK細胞代謝。cMyc是調節小鼠NK細胞糖酵解和氧磷代謝機制的關鍵因數，缺乏cMyc會導致NK細胞反應受損。糖原合成酶激酶－3（GSK3）可介導小鼠NK細胞中cMyc的降解。與此一致，在AML患者的NK細胞中檢測到GSK3過度表達，並與針對AML細胞的細胞毒性受損有關，GSK3抑制劑可恢復這些NK細胞的活性。目前，一些臨床試驗正在評估GSK3抑制劑LY2090314對實體癌和血液癌的療效（NCT01632306、NCT01287520和NCT01214603）。

有待解決的問題

靶向CD16a可能有助於解決當前癌症免疫治療治療抗體的一些現有局限性，從而最大限度地提高ADCC促進更有利臨床結果的潛力。然而，依然有一些未解決的問題亟待回答：

靶向CD16a優於其他NK細胞啟動受體的優勢是什麼？

啟動NK細胞觸發ADCC的最有效方法是什麼？啟動NK細胞能在多大程度上觸發適應性免疫以增強總體抗腫瘤活性？

NK細胞接合器能促進NK細胞在腫瘤部位的歸巢和持續存在嗎？

腫瘤內CD16a＋NK細胞和巨噬細胞的表達水準如何？由於CD16a在NK細胞和巨噬細胞上都有表達，因此我們有必要瞭解當特異性靶向CD16a時，不同免疫細胞類型相對於不同腫瘤實體的貢獻。

CD16a脫落對ADCC活性及其臨床療效的影響是什麼？用不可脫落的CD16改造細胞產品有好處還是壞處？

一線治療後NK細胞受體或靶向腫瘤抗原的下調是否會影響NK細胞接合器療法的療效？

NK細胞啟動劑的臨床療效如何受到患者年齡、治療開始時的健康狀況和預處理方案等參數的影響？

小結

自然殺傷細胞是一組獨特的抗腫瘤效應細胞，具有不受MHC限制的細胞毒性、產生細胞因數和免疫記憶等功能，使其成為先天性和適應性免疫反應系統中的關鍵角色。通過CD16a的ADCC作用是NK細胞發揮效應器功能的主要機制之一。因此，對CD16a的生物學的深入瞭解有助於我們找到增強ADCC作用的策略，從而提高NK細胞的抗腫瘤活性。

參考文獻：

1．From CD16a Biology toAntibody－Dependent Cell－Mediated Cytotoxicity Improvement． Front Immunol．2022；13： 913215．

2． Reimaginingantibody－dependent cellular cytotoxicity in cancer： the potential of naturalkiller cell engagers． Trends Immunol．2022 Nov；43（11）：932－946