NKT細胞免疫治療的現狀和未來
前言
目前，腫瘤免疫治療方興未艾，群雄並起，其中最有效的治療策略之一就是過繼細胞轉移療法（ACT）。嵌合抗原受體（CAR）和工程化T細胞受體（TCR）是近年來主要的過繼性T細胞免疫療法。自然殺傷T（NKT）細胞是脂質反應性T細胞的一個子集，可增強抗腫瘤免疫。基於NKT細胞的免疫治療在臨床前展現出富有前景的治療效果，然而在臨床治療卻沒有取得明顯的效果。目前，一些新的治療策略正在開發應用於NKT細胞療法，有望在未來的臨床治療中取得突破。
NKT細胞
NKT細胞是脂質和糖脂反應性T淋巴細胞的一個子集，共表達與NK細胞相關的標記物（NKp46，NK1.1）。NKT細胞在腫瘤免疫監測和抗腫瘤免疫中起著重要作用。與MHC I或II識別肽抗原的傳統T細胞不同，NKT細胞識別通過MHC I樣分子CD1d呈遞的內源性和外源性糖脂。基於TCR重排和糖脂反應性，NKT細胞可分為兩個主要亞群：I型和II型NKT細胞。I型NKT（又稱iNKT）細胞表達恒定的重排TCRα鏈與限制性的TCRβ鏈。在小鼠中，Vα14Jα18（TRAV11-TRAJ18）與Vβ7（TRB29）、Vβ8.2（TRB13-2）或Vβ2（TRBV1）配對；在人類，Vα24Jα18（TRAV10-TRAJ18）與Vβ11（TRBV25-1）配對。識別糖脂抗原後，iNKT細胞迅速分泌免疫調節細胞因數，包括IFN-γ、TNF和IL-4，以影響下游免疫活性。人類iNKT細胞可以是CD4，CD8雙陰性（CD4-CD8-), 而小鼠的NKT細胞是CD4+或CD4-CD8-。此外，iNKT細胞可分化為NKT1、NKT2和NKT17亞群，與Th1、Th2和Th17 T細胞亞群相似。
II型NKT細胞具有更多樣的Vα重排序列（包括TRAV7、TRAV9和TRAV12），有助於識別自身脂質，如硫酸腦苷脂或溶血磷脂醯膽鹼。多項研究表明，通過給予硫酸腦苷脂啟動II型NKT細胞可增加腫瘤生長並增強轉移，表明其具有促腫瘤作用，而iNKT細胞則表現出強大的抗腫瘤活性。
iNKT細胞介導的抗腫瘤作用
活化的iNKT細胞可通過四種機制提供抗腫瘤免疫：直接腫瘤溶解、招募和啟動細胞毒性固有和適應性免疫細胞、抑制腫瘤微環境（TME）中的抑制細胞以及促進腫瘤靶向免疫記憶。
直接或間接靶向
iNKT細胞可以直接或間接靶向腫瘤細胞。iNKT細胞有能力通過穿孔素、顆粒酶B和TNF相關凋亡誘導配體（TRAIL）途徑介導針對CD1d陽性腫瘤細胞的直接細胞溶解活性。體外和體內研究表明，iNKT細胞介導的細胞毒性與腫瘤細胞表面CD1d表達增加有關，導致腫瘤細胞溶解增強和轉移率降低，而CD1d的下調與iNKT細胞識別降低、腫瘤逃逸和惡性程度增加有關。
在腫瘤細胞上缺乏CD1d表達的情況下，iNKT細胞可能被CD1d+APC啟動，包括樹突狀細胞（DC）、B細胞、髓源性抑制細胞（MDSC）和腫瘤相關巨噬細胞（TAM）。iNKT細胞的反應在很大程度上取決於呈遞糖脂的APC。啟動後，iNKT細胞可分泌大量促炎細胞因數，包括IL-2、IL-4、IL-17、IFN-γ和TNF，這些細胞因數影響廣泛的免疫細胞，包括DC、巨噬細胞、中性粒細胞、NK細胞以及T和B細胞。此外，活化的iNKT細胞可以通過CD40/CD40L和CD1d/TCR相互作用積極招募和誘導DC成熟。
免疫抑制的調節
TAM是在TME中高頻出現的免疫抑制性免疫細胞。TAM有助於腫瘤進展和NK、iNKT和T細胞反應的抑制。在神經母細胞瘤中，iNKT細胞可以通過CD1d依賴機制共定位和裂解TAM。此外，iNKT細胞可以將M2極化TAM重新程式設計為炎性M1巨噬細胞，減少TAM介導的免疫抑制。MDSC誘導NK和T細胞無能，促進免疫抑制和腫瘤生長。此外，它們可以重塑TME，增加轉移率。在甲型流感感染模型中，iNKT細胞可以以CD1d和CD40依賴性方式抑制精氨酸酶-1和NOS2介導的MDSCs抑制活性。此外，NKT細胞可以刺激負載α-GalCer的MDSC轉化為成熟的APC，能夠誘導NK和T細胞免疫反應。此外，II型NKT細胞在TME中出現頻率較高，具有免疫抑制作用，增加腫瘤進展和轉移。iNKT細胞的啟動減少了II型NKT細胞的數量。
腫瘤免疫記憶的形成
免疫記憶的產生對於持久的抗腫瘤免疫反應和預防腫瘤復發至關重要。腫瘤抗原或交叉反應的外源抗原的啟動可誘導幼稚T細胞進行擴增和分化，以獲得適當的效應器功能來靶向癌細胞。CD8α+樹突狀細胞在MHC I交叉呈遞中表現出色，已證明iNKT細胞可直接促使CD8α+樹突狀細胞進行交叉啟動，即使在沒有CD4+T細胞的情況下也是如此。在多種腫瘤模型中，NKT細胞活化被證明能增強CD8+T細胞介導的抗腫瘤免疫。雖然大多數iNKT細胞缺乏CD62L，但最近的一項研究表明，在糖脂刺激後，CD62L+iNKT細胞增加，並且比CD62Lneg iNKT細胞持續時間更長。CD62Lneg iNKT細胞獲得衰竭表型（PD-1，TIM-3，細胞因數產生減少）並迅速發生凋亡，而CD62L+iNKT細胞繼續增殖並產生大量細胞因數。
基於NKT的細胞免疫療法
由於iNKT細胞在免疫監測和抗腫瘤免疫中的重要作用，基於iNKT細胞的免疫治療已成為一個重要的研究領域，目前已經使用多種策略來靶向癌症。
給予游離α-GalCer
在臨床前試驗中，可以預防性地、同時或在腫瘤接種後給予游離α-GalCer。注射游離α-GalCer後，iNKT細胞迅速增殖並產生TNF、IL-2、IL-4和IL-13，隨後出現IFN-γ反應，多次注射偏向Th2反應。雖然在多個小鼠模型中，腫瘤接種後給予游離α-GalCer具有一定的抗腫瘤作用，但抗腫瘤反應有限。因此，游離α-GalCer通常與細胞因數或其他免疫療法聯合使用，以提高治療效果。在I期臨床試驗中，α-GalCer的給藥耐受性良好，沒有劑量限制毒性；然而，它未能產生臨床反應，24名患者中只有7名SD。低療效可能歸因於基線時低iNKT細胞數量，因為只有高iNKT細胞數量的患者表現出NK細胞毒性和穩定疾病。
過繼轉移呈遞α-GalCer的DCs
負載α-GalCer的DC已被用於克服游離α-GalCer的低免疫原性和無能誘導。由於CD40和IL-12的共刺激信號傳導，將α-GalCer載入到DC上會導致iNKT細胞更強的啟動和更少的無能誘導。在多種腫瘤模型中，與游離糖脂給藥相比，α-GalCer負載的DC可減少腫瘤生長和轉移，從而延長生存期。負載α-GalCer的DC增加了iNKT的增殖、活化和IFN-γ的產生。此外，iNKT細胞的活化增強導致NK和CD8+T細胞的活化和IFN-γ產生增加。在骨髓瘤和頭頸癌的臨床試驗中，成熟的負載α-GalCer的APC耐受性良好，無嚴重不良事件。治療增加了IFN-γ的產生和iNKT細胞的擴增，導致許多患者病情穩定，中位生存時間延長。在非小細胞肺癌的I期和I/II期臨床試驗中，負載α-GalCer的APCs治療耐受性良好，僅導致I級和II級不良事件。對治療反應良好的患者表現出IFN-γ產生增加和iNKT細胞擴增。中位生存時間為31.9個月，而所有患者的中位生存時間為18.6個月。
過繼轉移活化的iNKT細胞
癌症患者通常iNKT細胞數量較少和/或功能降低，限制了α-GalCer治療的療效。為了克服這一限制，已從患者來源的PBMC中分離出iNKT細胞，並在體外擴增後過繼轉移回患者體內。在臨床前模型中，過繼轉移活化的iNKT細胞可增加黑色素瘤轉移模型中iNKT細胞的細胞毒性、腫瘤消退和總生存率。相反，在轉移性4T1乳腺癌模型中，NKT細胞單獨過繼或與游離α-GalCer療法或負載α-GalCer的DC聯合使用並不能改善預後。使用iNKT細胞過繼轉移治療非小肺癌和晚期黑色素瘤的臨床試驗未報告嚴重不良事件。患者的迴圈iNKT細胞數量和IFN-γ生成增加，但很少有患者腫瘤進展減少，表明該治療無效。將擴增的iNKT細胞過繼轉移與負載α-GalCer的DC相結合，可提高過繼NKT細胞轉移的效率。與單獨的iNKT過繼轉移相比，聯合治療可使一些患者獲得部分應答。
作為癌症疫苗佐劑
iNKT細胞在識別通過CD1d呈遞的保守脂質抗原方面的作用，以及它們通過細胞因數信號協調抗腫瘤免疫反應的能力，使其成為癌症疫苗開發的誘人靶點。iNKT細胞的配體，如α-GalCer，可與腫瘤抗原共同使用，作為佐劑發揮作用，增加對腫瘤的適應性免疫反應。在臨床前動物模型中，與腫瘤抗原聯用的α-GalCer可提高小鼠的總體存活率。用α-GalCer和OVA進行鼻內接種可誘導體液和細胞免疫反應，導致細胞因數分泌、CTL反應和IgG產生增加。目前，還沒有在癌症疫苗中使用iNKT細胞配體的註冊臨床試驗。
CD1d抗體融合蛋白
CD1d陽性腫瘤或更易受iNKT細胞介導的裂解，而CD1d下調是避免檢測的常見逃避策略。因此，為了增加iNKT細胞對腫瘤的靶向性，研究了將iNKT細胞直接導向腫瘤的CD1d抗體融合蛋白。目前，針對HER2、CEA和CD19的CD1d抗體融合蛋白已經開發出來。在表達HER2的B16黑色素瘤模型中，以HER2為靶點的CD1d抗體融合蛋白治療增加了iNKT細胞炎性細胞因數的產生和腫瘤細胞的靶向溶解，減少了轉移形成。此外，iNKT細胞增強了DC、NK細胞和CD8 T細胞的啟動，增加了腫瘤的整體免疫招募和靶向性。重要的是，CD1d抗體融合蛋白具有靶向特異性，顯示出良好的安全性。
CAR-NKT細胞
CAR-T細胞療法在靶向B細胞惡性腫瘤方面取得了顯著的臨床成功。iNKT細胞已被設計出表達針對糖脂和蛋白質抗原的CARs。此外，除CAR外，CAR-NKT細胞還共同表達恒定的TCR，維持其對糖脂抗原的反應性。相反，CAR-T細胞中的內源性TCR是多克隆的，大多數CAR-T細胞只能通過其CAR進行反應。
靶向CSPG4、GD2和CD19的CAR-NKT細胞已經開發出來，靶向GD2和CD19的CAR-NKT細胞正在進行臨床試驗。一項I期臨床試驗（NCT03294954）已經開始，檢測難治性神經母細胞瘤中的抗GD2 CAR-NKT細胞的療效和安全性。初步結果表明，10名入選患者的治療是安全的，其中1名完全緩解，1名部分緩解，3名患者病情穩定。
目前，CD19 CAR-NKT細胞正在進行一項I期臨床試驗（NCT03774654），檢測復發和難治性B細胞惡性腫瘤中的安全性和有效性。在I期試驗的兩名患者中，一名患者表現出完全回應，另一名患者表現出部分回應，兩名患者都沒有任何CRS或GvHD的跡象。重要的是，本研究中使用的CAR-NKT細胞是同種異體的，證明了“通用”療法的潛力。
基於NKT細胞的聯合療法
改進現有療法的一種方法是將其與產生協同反應的其他療法相結合。聯合療法也可能提高iNKT細胞免疫療法的臨床療效。在臨床前實驗中，iNKT細胞免疫療法已經與化療、溶瘤病毒和其他免疫療法進行了聯合試驗。
聯合化療
迄今為止，來那度胺是臨床試驗中唯一與iNKT細胞免疫療法聯合使用的化療藥物。在一項I期臨床試驗中，無症狀骨髓瘤患者接受載α-GalCer的DC聯合來那度胺治療。治療耐受性良好，僅有一名患者出現3級不良事件。治療導致iNKT細胞、NK細胞、單核細胞和嗜酸性粒細胞的啟動增加，顯示出強烈的先天免疫啟動。此外，NKG2D在NK細胞上的表達顯著增加，表明NK細胞的細胞毒性潛力增加。總的來說，治療導致除一名患者外所有患者的腫瘤相關免疫球蛋白降低，表明治療降低了腫瘤負擔。聯合治療的成功強調了進一步臨床試驗的必要性。
與溶瘤病毒聯合
迄今為止，還沒有臨床試驗將溶瘤病毒與iNKT細胞免疫療法相結合。然而，臨床試驗表明溶瘤病毒可以改善其他免疫療法的效果。溶瘤病毒療法與iNKT細胞活化療法相結合的臨床前的成功結果表明，有必要在臨床試驗中進一步檢查這種聯合療法。
聯合免疫治療
聯合治療的一個有趣的選擇是聯合iNKT細胞治療和免疫檢查點抑制劑。α-GalCer啟動iNKT細胞後，IFN-γ大量釋放，隨後PD-1表達增加，導致無能和抗腫瘤功能抑制。因此，聯合iNKT細胞免疫治療和阻斷PD-1/PD-L1軸的檢查點抑制劑可能提高治療效果。事實上，在臨床前模型中，α-GalCer聯合抗PD-1或抗PD-L1可防止iNKT細胞無能增加iNKT細胞的抗腫瘤活性。此外，iNKT細胞免疫治療可以克服PD-1耐藥腫瘤中的CD8+T細胞無能。臨床試驗正在測試PD-1/PDL-1阻斷劑和iNKT細胞免疫治療的組合（NCT03897543）。
NKT細胞療法面臨的挑戰和應對
iNKT細胞免疫治療面臨的最大挑戰是癌症患者中iNKT細胞的低浸潤和功能降低。再加上腫瘤細胞CD1d的下調，治療效果可能會受到限制。此外，iNKT細胞在用游離α-GalCer治療後誘導無能表型，降低了多劑量治療的療效。另一個挑戰是從免疫抑制的癌症患者中獲得大量自體DC和iNKT細胞，從而限制可擴增和過繼轉移的細胞數量。此外，培養和分化細胞進行過繼轉移需要數周時間，導致一些患者無法接受治療或死於疾病[。為了應對這些挑戰，許多研究對iNKT細胞免疫療法進行了改進。
改進糖脂輸送
由於游離α-GalCer的低效性和難以獲得大量自體DC，一些研究檢測了α-GalCer通過載體（如納米顆粒、人工抗原遞呈細胞、外泌體和脂質體）傳遞的可能性。與游離的α-GalCer相比，載體結合的α-GalCer的遞送增加了iNKT細胞的擴增和細胞因數的釋放，從而降低了腫瘤負荷。這主要是由於DC細胞的攝取和表達增加，以及下游NK和CD8+T細胞反應增加。
選擇糖脂替代物
幾乎所有iNKT細胞免疫治療的臨床試驗都使用α-GalCer（KRN7000）刺激iNKT細胞；然而，越來越多的修飾糖脂可能提供更高的治療效益。例如，α-C-GalCer將α-GalCer中發現的O-糖苷鍵替換為C-糖苷鍵，從而增加IFN-γ和IL-12的產生。7DW8-5是一種候選糖脂，它的醯基鏈較短，末端為氟化苯環。與α-GalCer相比，7DW8-5對iNKT細胞的CD1d和TCR具有更強的親和力，在多種疫苗模型中，7DW8-5刺激iNKT細胞可增加Th1和CD8+T細胞反應。類似地，一種被稱為ABX196的修飾糖脂作為疫苗佐劑已經產生了有希望的結果。在黑色素瘤、結腸癌和膀胱癌模型中，ABX196單獨或與抗PD-1聯合使用可增加腫瘤消退和總生存率。ABX196聯合PD-1抑制劑目前正在進行一期臨床試驗（NCT03897543）。
誘導多能幹細胞衍生的iNKT細胞
癌症患者通常會減少iNKT細胞的數量和功能，從而限制了iNKT細胞免疫療法的療效。此外，很難從免疫抑制的癌症患者獲得足夠的PBMC來體外擴增和輸送iNKT細胞。一種應對策略是使用來自患者組織的誘導多能幹細胞（IPSC）。iPSC誘導的iNKT細胞能夠分泌大量IFN-γ。此外，體內試驗表明，iPSC衍生的iNKT細胞在轉移到小鼠體內時保持了其抗腫瘤功能。
靶向Ⅱ型NKT細胞
iNKT細胞和II型NKT細胞在腫瘤免疫調節中發揮相反的作用，並相互交叉調節。因此，靶向II型NKT細胞可能是緩解腫瘤介導的iNKT細胞免疫抑制並增強抗腫瘤免疫的治療方法。最近發現的II型NKT細胞硫酸腦苷脂抗原的一種亞型C24:2被證明能顯著減少肺轉移的發生。
小結
iNKT細胞在免疫監測和抗腫瘤免疫中起著重要作用。基於NKT細胞的免疫療法具有眾多優勢，相比於CAR-T細胞治療，NKT細胞治療作用時間更久，更能夠抑制癌症的復發和轉移，將可能成為實體瘤等癌症的重要治療方式。
雖然，目前臨床研究仍然沒有取得突破，但一些新的治療策略，包括載體化的α-GalCer、替代性糖脂和聯合療法，正在顯示出改善的臨床前結果。隨著免疫細胞治療實體瘤技術的不斷突破，NKT細胞免疫治療行業將會得到快速發展，相信未來基於NKT細胞的免疫療法將會大放異彩。
參考文獻：
1.The Current Landscape of NKT CellImmunotherapy and the Hills Ahead. Cancers (Basel). 2021 Oct; 13(20): 5174