體內的衰老細胞是生是死？決定權在NK細胞手上

免疫系統被稱為世界上最好的醫生，而NK細胞是人體免疫系統的核心細胞，它是體內負責殺傷老化、受病毒感染、腫瘤等異常細胞的最主要“戰士”。在我們人體內扮演著重要的角色，與我們的健康息息相關。日前，《Journal of Leukocyte Biology》雜誌發表的論文綜述了衰老細胞如何觸發免疫反應，特別是NK細胞識別和清除衰老細胞的能力 [1]。其中提到，NK細胞為基礎的抗癌治療是有希望的，同時NK細胞免疫治療應被視為衰老治療的一部分。

你知道免疫衰老嗎？隨著年齡增長，NK細胞功能下降

隨著年齡的增長，NK細胞失去了功能，從而使我們更容易受到病毒性疾病和腫瘤形成的影響[4]。年齡越大，因流感住院或死亡的風險就越高[5]。當你年輕的時候，NK細胞是你先天免疫系統的一部分，可以摧毀新的病毒毒株[6]。但由於NK細胞功能隨著年齡的增長而下降，因此，很容易感染新的病毒毒株。同樣，由於NK功能下降不能早期破壞惡性細胞，老年人患癌症的風險增加。NK細胞是先天免疫系統的淋巴細胞，具有細胞溶解活性，能夠迅速處理應激細胞。它的工作原理是觸發被病毒或惡性腫瘤轉化的細胞凋亡（程式性細胞死亡）[7]。如果沒有這種關鍵的防禦機制，病毒可能會在全身傳播，而癌症細胞可能會形成侵襲性、轉移性腫瘤。因此，這些細胞的健康對強大的免疫系統至關重要。但是，隨著年齡的增長，NK細胞功能會迅速下降，這是免疫系統自然衰退的一部分[8]。這種免疫功能的退化在醫學上也被稱為免疫衰老。

NK細胞是衰老細胞的哨兵

細胞衰老是一種導致細胞週期停滯的細胞應激反應，在組織穩態和癌變過程中發揮著關鍵作用。衰老是一種基於複製、基因毒性或致癌損傷後細胞週期長期停滯的細胞程式[9]。衰老細胞具有抗凋亡和代謝活性，產生大量可溶性因數，統稱為衰老相關分泌表型（SASP）。SASP的組成包括細胞因數、趨化因數、生長因數和蛋白酶。通過這種方式，衰老細胞參與胚胎發生[10]、創傷癒合[11]、和癌症期間的組織重塑[12]。衰老細胞在衰老組織中積累，從而導致組織功能障礙。在衰老過程中免疫系統的減弱可能是造成這種累積的原因，免疫細胞不再能夠有效地識別衰老細胞。研究發現，在老年人中， NK細胞和CRP水準(被評估為炎症標誌物)之間呈負相關，從而推測NK細胞有助於控制炎症，並執行衰老細胞免疫監視任務。NK細胞通過一種機制殺死衰老細胞，該機制涉及穿孔素和含有顆粒酶的顆粒胞吐作用，並在衰老細胞相互作用後產生IFN-γ，這導致了NK細胞介導的衰老細胞免疫清除不僅依賴於直接殺傷，還依賴於細胞因數的產生，從而促進巨噬細胞的活化。NK細胞和巨噬細胞已被證明可以在衰老細胞免疫監測中發揮重要作用，啟動受體NKG2D和DNAM-1能夠迅速識別應激細胞，使NK細胞成為衰老細胞的哨兵。

當衰老遇上腫瘤，NK細胞同樣一拳“掃清”

衰老腫瘤細胞被NK細胞識別和殺死的第一個證據源於Scott Lowe小組的發現，即小鼠肝癌中p53的恢復導致腫瘤消退，這是由於包括NK細胞在內的先天免疫反應清除了衰老腫瘤細胞[13]。這項研究改變了人們對衰老的看法，細胞衰老不僅是一種對細胞增殖施加障礙的細胞自主機制，而且是一個涉及免疫系統對衰老細胞的識別的過程。衰老細胞和免疫系統的細胞相互作用，深入塑造組織穩態，在致癌和腫瘤進展過程中進行組織重塑。從機制角度來看，肝癌細胞中p53再啟動的模型已經表明，雖然NK細胞耗竭導致腫瘤根除延遲，但NK細胞在識別清除衰老細胞後，同時也會促進腫瘤消退。

NK細胞與巨噬細胞在衰老細胞免疫監視中起主要作用，並及時清除衰老細胞。當前，許多研究致力於使腫瘤細胞更容易被NK細胞殺死，但研究發現，衰老細胞優先被NK細胞識別和清除，這些發現擴展了NK的應用領域。關於衰老的研究從最初的關注衰老的增殖抑制，到如今的細胞衰老的研究，人們對於衰老的認知越來越全面。由於衰老細胞優先被NK細胞識別和清除，那麼是否可以設想一種聯合治療，使腫瘤細胞被迫衰老，然後通過NK細胞去除衰老的腫瘤細胞，以達到治療腫瘤患者的目的。由於NK細胞的抗癌療法很有前景，相信隨著研究的逐漸增加，實現這一設想造福更多患者不是夢。

【參考文獻】

[1] Senescent cells: Living or dying is a matter of NK cells

https://jlb.onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/JLB.MR0718-299R

[4] Natural killer cells and cancer.https://xueshu.baidu.com/usercenter/paper/

show?paperid=195k0cc0ew030xv0ar2j0xc09f314694&site=xueshu_se

[5] Influenza-associated hospitalizations in the United States.

https://xueshu.baidu.com/usercenter/paper/show?paperid=1u5n0410dx760e70317f0xw09v521098&site=xueshu_se

[6] Innate immunity and inflammation–two facets of the same anti-infectious reaction.https://xueshu.baidu.com/usercenter/paper/show?paperid=1a3q0c60241p0m50623u0670gn165137&site=xueshu_se

[7] NK cell-based immunotherapy for malignant diseases. https://xueshu.baidu.com/

usercenter/paper/show?paperid=1j170ac05u6u08v0254t0v40u5373075&site=xueshu_se

[8] Clinical effects of probiotic Bifidobacterium longum BB536 on immune function and intestinal microbiota in elderly patients receiving enteral tube feeding.

https://xueshu.baidu.com/usercenter/paper/show?paperid=228dec995e86ed4d8791434bc6ecbe3f&site=xueshu_se

[9] Senescence in health and disease.https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/28575665/

[10] Programmed cell senescence during mammalian embryonic development.

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/24238962/

[11] An essential role for senescent cells in optimal wound healing through secretion of PDGF-AA.https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/25499914/

[12] Cellular senescence: the sought or the unwanted? https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/30153969/

[13] Senescence and tumour clearance is triggered by p53 restoration in murine liver carcinomas.https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/17251933/

Nature | CAR免疫細胞：設計原理、耐藥性及下一代方向

Nature | CAR免疫細胞：設計原理、耐藥性及下一代方向

原文連結：https://www.nature.com/articles/s41586-023-05707-3

嵌合抗原受體（CAR）療法在B細胞和漿細胞腫瘤中表現出顯著的臨床活性，驗證了該療法類別在液態癌症中的使用，然而，耐藥性和應用範圍的限制仍是廣泛應用的難題。這篇綜述回顧了當前CAR的免疫生物學和設計原則，並介紹了預計將推動未來臨床進展的新興平臺。該領域正在快速擴展下一代CAR免疫細胞技術，這些技術旨在提升療效、增強安全性和可接入性。在提升免疫細胞適應性、啟動內源性免疫、武裝細胞以抵抗腫瘤微環境的抑制，以及調節抗原密度閾值的方法上已取得了實質性的進展。越來越複雜的多特異性、邏輯門控和可調節CAR顯示出克服耐藥性和提高安全性的潛力。隱蔽式、無病毒和體內基因傳遞技術的初步發展為降低細胞療法的成本和提高其廣泛應用提供了可能性。CAR T細胞在液態癌症中持續的臨床成功正在推動越來越複雜的免疫細胞療法的發展，這些療法預計在未來幾年內將轉化為用於治療實體瘤和非惡性疾病的治療方法。

引言

嵌合抗原受體（CAR）是合成模組化蛋白，可重定向免疫細胞以應對在惡性腫瘤細胞上表達的目標抗原。這種靈活的平臺在治療B細胞和漿細胞惡性腫瘤方面已經顯示出了顯著的臨床效果，因此，這種療法的應用潛力正推動著科技的快速發展以及來自學術界和生物製藥行業的大規模投資。美國食品和藥物管理局（FDA）已經批准了六種CAR T細胞產品，包括用於大B細胞淋巴瘤（LBCL）、B細胞急性淋巴細胞白血病（B-ALL）、濾泡狀淋巴瘤和其他12種病症的治療。在關鍵的臨床試驗中，CD19-CAR療法在LBCL的二線治療中表現優於標準護理療法（SOC），並且作為一線治療非常有效，為其在早期疾病階段的應用鋪平了道路。現在，針對CD19的CAR療法已經不再是唯一選擇。有兩種針對BCMA（又名TNF受體超家族成員17）的CAR T細胞療法已經獲得了美國食品藥品監督管理局（FDA）的批准，用於治療多發性骨髓瘤。此外，還有針對其他目標的CAR療法在治療其他類型的白血病和淋巴瘤中也展示了很高的效果，包括CD22、CD30、CD7、CD20和GPRC5D。為了降低CAR T細胞治療的風險，現在已經有標準的毒性評估和管理流程，使得與CAR T細胞治療相關的死亡率得以降低雖然我們在CAR-T細胞療法上取得了一些進展，但仍有很多問題需要解決。對於接受商業化CAR-T細胞治療的B細胞癌症患者來說，只有不到一半的人能得到持久的疾病控制。在實體腫瘤的治療上，CAR-T細胞療法雖然顯示出一些有效性，但是持久並且一致的高效反應的證據仍未明確。此外，從患者體內提取細胞製備CAR-T細胞的過程既耗費時間又需要大量資金，而現在的商業化生產能力還無法滿足所有的臨床需求。該綜述闡述了對CAR-T細胞免疫生物學的當前理解，強調了癌症中的耐藥機制、設計原則，以及增強療效的新興方法。我們主要關注開發用於癌症治療的CAR T細胞，但許多原則與其他用於癌症的免疫細胞療法和開發用於非惡性疾病的細胞療法的新興嘗試有關。

CAR-T免疫生物學及其耐藥機制

許多團體長期廣泛地致力於為癌症開發免疫細胞療法，這些努力對於CAR-T療法的成功至關重要（圖1）。CAR是由Eshhar和他的同事們發明的，目標是利用自然T細胞的擴張、殺傷和持久性，同時克服T細胞受體（TCR）的主要組織相容性複合體（MHC）限制，以實現更廣泛的治療適用性。經過許多集團的反復優化，一個融合了scFv作為抗原結合域、鉸鏈/跨膜域、TCRζ和CD28或4-1BB共刺激末端結構域的受體，最終成為了CAR的原型（圖2）。這種結構被FDA批准的六種藥物中的五種採用，而第六種藥物則在保持同樣的結構的基礎上，使用兩個納米抗體重鏈（Vhh）作為抗原結合區。1.5-2.2千基對（kb）的受體的抗原結合過程在很大程度上複製了自然T細胞中由TCR-CD3複合體介導的抗原特異性啟動和殺傷，然而，CAR T細胞和自然T細胞的生物學之間存在顯著差異，這為這些治療劑的應用提供了機遇和挑戰。

 

 

由於抗原調節產生的耐藥

CAR和TCR信號傳導之間的一個主要區別是，CAR需要更高的抗原密度才能完全啟動T細胞。儘管單鏈變數片段（scFvs）與TCRs相比具有更高的親和力，並且CAR的表達密度通常比TCR-CD3複合體高，但TCRs對每個抗原呈現細胞中不到100個肽就可以完全引發啟動，而CAR則需要每個目標細胞上有超過1000個目標分子。這種差異的原因包括CAR對近端激酶招募的減少，免疫突觸的發展程度較低，共受體的參與程度減少，以及對下游負調節因數的更大誘導，其中部分與強直信號有關，其中CAR的聚集，通常由scFv驅動，誘導抗原無關的啟動。CAR原型設計的修改在一定程度上可以調整抗原密度閾值，其中調節信號強度、scFv親和力、CAR表達密度、鉸鏈/跨膜結構和突觸間距的特徵都會產生重要影響（圖2）。由於更大的信號強度降低了抗原密度閾值，因此增強T細胞適應性的特徵，無論CAR設計如何，也會降低CAR抗原密度閾值。這些見解對於開發安全有效的CAR T細胞療法至關重要，因為毒性和有效性與靶向抗原的表達特性密切相關。靶向那些對生命至關重要的組織中不存在的分子的CAR，例如B細胞系列抗原，應被設計為在低抗原密度下啟動，以降低低抗原復發的風險，而靶向那些在癌症中高度表達但在重要的組織中表達低的分子的CAR，應被設計為具有更高的抗原密度閾值，以利用基於差異抗原密度的治療視窗。

抗原調節是B細胞惡性腫瘤中CAR T細胞失去作用的主要原因，而在實體瘤中，大部分可靶向的抗原都表現出顯著的異質性，這可能會帶來更大的挑戰。在兒童和青少年的B細胞急性淋巴細胞白血病(B-ALL)中，約50%的復發與CD19喪失有關，而在大B細胞淋巴瘤(LBCL)中，約30%的復發為CD19陰性，另有30%的復發在商業化CAR的抗原密度閾值以下表達CD19。多發性骨髓瘤中BCMA-CAR T療法對抗原變化的抵抗作用定義不明確。基礎的BCMA表達水準在患者中異質性大，且與臨床反應無關。BCMA喪失 — 與基因突變和缺失相關 — 是抵抗的罕見原因（不到5%的病例），然而，在BCMA-CAR治療後可觀察到抗原調節。抗原密度可以通過各種機制進行調節，包括基因突變、RNA選擇性剪接、細胞譜系轉換、表觀遺傳、轉錄後機制、胞啃作用、超糖基化以及抗原脫落。一些目標的下調可以通過小分子藥物進行治療干預，如用bryostatin來上調CD22，用 azacitidine來上調CD70，以及用γ-分泌酶抑制劑來上調BCMA，這些藥物能抑制抗原脫落。

T細胞功能低下導致耐藥

CAR T細胞抵抗的第二個主要原因與T細胞的效能、持續性、功能持久性和/或功能障礙不足有關，這通常與在沒有抗原調節的情況下疾病復發有關。功能障礙通常是由T細胞耗竭引起的，這是通過全域轉錄和表觀遺傳重程式設計引導的終末分化的結果。在T細胞收集、製造的CAR T細胞產品中，有時可以觀察到T細胞耗竭，而經過高腫瘤負荷後也會誘導耗竭。CAR結構中的內部因素也會導致耗竭，其中共刺激領域起主要作用。與4-1BB和第一代CARs相比，CD28協同刺激的CARs表現出更快更大的擴增，分泌更多的炎性細胞因數，而且由於T細胞耗竭，其存在的時間相對較短。在某些情況下，4-1BB和第一代CARs可能可以持續存在數年。在存在強直信號（tonic signalling）的CARs中，CD28協同刺激結構域對於加速T細胞耗竭的影響尤為顯著。強直信號的影響取決於信號的強度，並且與環境有關，一些CARs在存在強直信號的情況下可以表現出更好的功能和持久性。通過在CD3ζ或CD28結構域中進行突變，降低基於CD28的CARs的信號強度，可以減輕其對T細胞耗竭的傾向，從而提高其持久性。值得注意的是，最近一項長期跟蹤研究表明，長壽的CARs都是CD4陽性的，這引發了一個設想：這一亞群可能更不容易耗竭，從而展示出更高的持久性。

CD28與4-1BB協同刺激的CARs存在時間較短的臨床效應因疾病而異。在大B細胞淋巴瘤（LBCL）中，腫瘤的消除發生得非常快，CD28和4-1BB協同刺激的CAR T細胞表現出類似的療效。然而，在B細胞急性淋巴細胞白血病（B-ALL）中，CAR T細胞的存在時間超過6個月與復發率增加有關——因此，除非患者在CAR治療後接受骨髓移植以鞏固緩解狀況，否則CD28協同刺激的CAR T細胞的效果較差。在多發性骨髓瘤中，抗BCMA-CAR T細胞的功能持久性與回應時間的延長相關。目前還不清楚對於實體瘤來說，是更偏好CD28還是4-1BB的協同刺激，因為強烈的信號強度和持久性都是desirable。同時包含CD28和4-1BB協同刺激結構域的CARs並未表現出優勢，這使得研究人員開始嘗試整合新的或者合成的協同刺激結構域，目標是賦予最大的信號強度和持久性。通過CAR的合併篩選，已經用來識別最佳的CAR信號結構域和設計，並闡明CAR設計原則。全基因組CRISPR篩選已經確定CD2-CD58軸作為T細胞效能的介導者，並已證明IFNγR信號傳導在實體瘤中（而非液態瘤）對於CAR T細胞的粘附和細胞毒性是必需的。CAR T細胞的效能也受到腫瘤微環境（TME）中的免疫抑制分子（TGFβ、IL-10、IL-6和檢查點分子）的限制，目前正在進行的工作包括將CAR T細胞療法與免疫調節劑結合，旨在啟動TME內的免疫應答，並賦予免疫細胞抵抗特定的免疫抑制介質的能力（見box1）。

 

 

轉運受損與局部給藥

另外，受損的到達腫瘤部位的運輸可能也會限制CAR T細胞的效果，特別是在實體瘤中。在中樞神經系統腫瘤的預臨床模型中，腫瘤內或腦室內（ICV）給藥已經顯示出改善療效，局部劑量大約降低十倍就能達到與靜脈給藥相同的效果。幾項臨床試驗已經證明了將CAR T細胞局部區域性地輸入到中樞神經系統的安全性，對於一位多形性膠質瘤患者，ICV輸送的IL-13Rα2 CAR T細胞誘發了完全反應，而腫瘤內給藥則未見有效。在一項對彌漫性中線膠質瘤患者的研究中，ICV輸送的GD2-CAR T細胞誘發了抗腫瘤效果和臨床反應，並且重複給藥與持續的益處相關，這提出了一個可能性，即向中樞神經系統的輸送可能消除免疫敏化，這可能限制了多劑量靜脈CAR T細胞方案的有效性（ In a study of patients with diffuse midline gliomas, ICV delivery of GD2-CAR T cells induced antitumour effects and clinical responses, and repeated dosing was associated with sustained benefit, raising the prospect that delivery to the central nervous system may abrogate immune sensitization, which has probably limited the effectiveness of multidose intravenous CAR T cell regimens.）。在涉及胸膜的肺癌患者中，間皮素-CAR T細胞的區域遞送與PD-1阻斷相結合，介導穩定的疾病和代謝反應。另外，正在研究的策略是讓T細胞自身產生IL-7和CCL19，以改善它們對腫瘤微環境的定位和在其中的持久性。

下一代CAR-T細胞

本節將討論用於克服腫瘤抗性機制、增強免疫細胞活力、提高特異性、調整CAR信號、提高安全性和增加抗原敏感性的各種下一代平臺。

減少抗原逃逸

雙特異性CAR靶向可通過施用混合細胞產品、兩個受體的雙區表達、兩個scFvs併入一個受體或多個CAR的共同轉導來實現，每種方法都帶來了機遇和挑戰。共同輸注（co-infusion）在經濟、人力和細胞資源上都需要大量投入，而共同轉導（co-transduction）會生成多樣性的產物，這種情況下可能會出現某一亞群體在輸注後主導整個細胞群體，從而產生風險。雙區表達可能會導致蛋白表達降低，在一項臨床試驗中，雙區表達的CAR-T顯示出有限的持久性。已經報告了幾項針對CD19加CD20或CD22的雙特異性受體的試驗，在其中一項中，該受體對CD22的效力降低，而且腫瘤細胞變種顯示出CD19的表面表達量低或無表達。FDA近期批准的BCMA-CAR（雙特異性駱駝抗體胞外域結合部位抗原受體）cilta-cel，包含在一個受體中的兩個串聯Vhh結合物，它們可以結合到BCMA上的兩個不同的表位。cilta-cel的臨床結果顯示，83%的患者達到了嚴格完全緩解（sCR），並且在27個月的無進展生存率（PFS）為55%，這是到目前為止使用CARs治療多發性骨髓瘤報告的最高值（表1）。總的來說，多特異性CARs的臨床資料還處於初期階段，但已經展示出安全性和通過減少抗原逃逸來提高效果的潛力。

為降低抗原密度閾值而設計的新型受體也在開發中。Katsarou和他的同事已經表達了一種嵌合的共刺激受體(CCR)，它缺乏cd3ζ結構域，並報告說，CCR的參與在非常低的抗原密度下啟動了CAR-T細胞，防止了臨床前模型中的抗原低逃逸。對非CAR T細胞抗原產生抗腫瘤反應–如在一位患有橫紋肌肉瘤的患者接受CAR T細胞治療後所報導的–可能會減少由抗原調節引起的抗性。有幾種方法正在開發中，以增強先天和適應性免疫（box1），包括CAR介導的免疫刺激RNA RN7SL1的傳遞，共同表達配體或重塑TME的細胞因數，如IL-12、IL-18、CD40L或Flt3L、 設計CAR T細胞以分泌雙特異性T細胞誘導劑（BiTEs），利用CAR T細胞在腫瘤部位的積累，避免BiTE的全身毒性，或使用可能介導更有力的內源性抗腫瘤活性的非傳統免疫細胞。

增強T細胞功能

大量增強免疫細胞的適應性的研究正在進行中（見圖3和box1）。大部分的工作集中在表觀遺傳調控上，部分原因是在一項針對慢性淋巴細胞白血病的CD19-CAR臨床試驗中，有一位異常反應良好的患者，慢病毒整合破壞了TET2基因，這是DNA甲基化的介導者，導致了大量的克隆性T細胞增殖和持續的抗腫瘤反應。同樣地，DNMT3A基因的敲除在預臨床模型中增強了CAR T細胞的抗腫瘤活性。通過過表達轉錄因數來防止耗竭也顯示出了潛力，包括過表達AP-1因數JUN，這增強了T細胞的擴增和持續性，減少了末端分化，降低了抗原密度閾值，這可能是由於信號強度的增加。類似地，BATF轉錄因數的過度表達已經被報導可以增強T細胞的效力。正在開發製造策略，以優化CAR T細胞的表型，朝向幹細胞樣和中心記憶亞群，包括縮短培養時間，抑制PI3K–mTOR–AKT，BTK或酪氨酸激酶信號，以及在促進記憶的細胞因數中培養。

CRISPR介導的基因編輯首次在採用的T細胞療法中臨床應用，在這種療法中，PD-1被從工程化的細胞中刪除，這些細胞被設計來表達NY-ESO-1，一種癌症特異性的TCR轉基因。這些工程化的細胞並沒有顯示出增強的持久性或效力，但該研究證明了該方法的可行性和安全性，並加速了應用基因編輯技術以增強免疫細胞療法的努力。已經有一些基因被確定為候選基因，以增強T細胞的適應性（box1），並且CRISPR介導的T細胞標誌物如CD7和CD5的破壞使CAR T細胞療法能夠用於T細胞惡性病，同時避免了CAR T細胞的溶解（被稱為‘同類殺伐’）。我們預計將有越來越多的臨床試驗活動，將基因編輯的免疫細胞整合到採用的免疫細胞療法平臺中，以增強其效力，擴大可靶向抗原的範圍，並避免免疫敏感化。

為了增強持久性，一些研究人員已經試圖將細胞因數信號整合到CAR受體中，或者轉基因表達細胞因數，包括一個臨床試驗，其中表達CAR的自然殺傷細胞轉基因表達IL-15顯示出持久的存在。免疫排斥也可能限制CAR T細胞的持久性，因為可以在許多病人體內測量到針對小鼠、人源化或全人scFvs的抗CAR免疫反應。同樣的，臨床經驗顯示，第二次和隨後的靜脈內CAR T細胞的效用有限，可以通過使用淋巴清除方案來改善。這些發現提出了這樣的前景，即正在開發的stealth平臺，能夠通過增強持久性或啟用多次CAR T劑量方案來增強CAR T細胞的效能，從而使現成的異體產品成為可能。

當前正在進行多種努力以解決抑制性的腫瘤微環境（TME）（見Box1），包括基因消融或表達佔優勢的TBGβ、PD-1或Fas受體，以及工程化CAR T細胞分泌檢查點阻斷scFvs。一些研究者已經設計出切換受體，這是一種融合蛋白，能夠將TME中的抑制信號轉換為CAR T細胞中的啟動信號。然而，由這種受體引發的持續啟動信號是否會導致長期的CAR T細胞增強或使它們傾向於耗竭和終末分化，這仍有待確定。此外，也正在探索基於生物材料的方法來增強細胞的擴增和持久性。

 

 

CAR調控與可調節平臺

大量的研究工作正在進行，旨在通過調節或抑制CAR信號傳導來提高安全性和效力，以降低毒性和耗竭。這個概念最初是由Eyquem等人提出的，他們使用CRISPR技術將CAR受體敲入TRAC位點，並觀察到由於內源性TRAC調控元件介導的抗原誘導的CAR下調，CAR-T細胞的效力和耗竭有所改善。韋伯和他的同事們利用合成生物學或小分子技術暫時停止CAR信號，當在製造過程中使用時，這種方法能提高CAR-T細胞的效力，在移植後體內應用時，能提高抗腫瘤效果。

如iCasp9、HSV酪氨酸激酶（HSV-tk）和表位元標籤等”殺手開關”能夠在出現嚴重毒性的情況下清除工程化的細胞，而且，我們已經開發出一種使T細胞對尿苷有需求的無轉基因的安全開關。調節性平臺不僅可以作為可逆的安全開關，還可以調整CAR的信號，從而提供防止T細胞耗竭的休息期，提高T細胞的效力。我們已經開發出眾多的可調節平臺，這些平臺採用了藥物敏感的啟動子、誘導二聚化、分裂式CAR、藥物依賴的啟動劑、蛋白質降解的嵌合物（PROTACs）、化學依賴性降解領域和藥物調控的CAR蛋白質降解等技術。這些系統代表了合成生物學的重大進展，但仍然面臨著關閉狀態下有毒性風險的洩漏活動、開啟狀態下CAR表達或活性減弱以及使用免疫抑制藥物作為調節器的挑戰。

Labanieh等人最近開發了一種蛋白酶調控的Grazoprer誘導的 “藥物ON “平臺，即 signal neutralization by an inhibitable protease (SNIP)，它顯示出無洩漏的活性和完整的功能能力（圖3）。最近，Labanieh等研究者開發了一種新型的受蛋白酶調控的藥物啟動平臺，稱為“SNIP”。該平臺在未被啟動的狀態下沒有殘留活性，並且在被藥物（如Grazoprer）啟動後能全面發揮作用（如圖3所示）。和synNotch系統類似，SNIP能夠降低CAR T細胞的耗竭程度，從而提高其抗腫瘤效果。在一個特定的實驗模型中，通過降低Grazoprer的劑量，研究者能夠調節SNIP-CAR的活性，這樣就能找到一個治療的視窗，在該視窗中，健康的正常細胞可以存活，而表達ROR1的腫瘤細胞則會被消滅。同樣地，Hernandez-Lopez等人改進了synNotch平臺，使其能夠在避免攻擊正常細胞的同時，有效地對付高度表達腫瘤特異性抗原的腫瘤細胞。因此，這種可調節的CAR技術顯示出了在提高療效和減少毒性方面的潛力。

通過布林邏輯增強特異性

B細胞和漿細胞惡性腫瘤特別適合接受CAR-T細胞治療，因為這些細胞高度、均勻地表達的抗原主要在B細胞和漿細胞上共表達，而這些細胞的消耗是可以容忍的。然而，最近的一篇病例報告顯示，一名患者在接受BCMA-CAR T細胞治療後出現了帕金森病症狀，屍檢分析顯示在患者的基底節神經元和星形膠質細胞子集中表達有BCMA。在另一項研究中，單細胞RNA測序分析顯示腦壁細胞上表達有CD19，這提出了一個可能性，即CD19-CAR T細胞治療後的神經毒性可能是由於準確打擊目標細胞所致。這些結果突顯了確定不在重要組織上表達的靶標的挑戰。

到目前為止，由於實體瘤表面缺乏特異性腫瘤標誌物，CAR T細胞療法的應用在實體瘤中仍受限，針對CAIX和CEACAM5的CARs在臨床試驗中觀察到了不可接受的靶向腫瘤外毒性。然而，針對實體瘤的CAR T細胞和其他強效的抗體導向療法的幾項臨床試驗已展現出良好的安全性檔案（表1）。CAR抗原密度高的閾值可能解釋了為何能安全靶向某些已知在重要組織上有表達的抗原，如在神經組織上低表達的GD2。最近一項試驗顯示，針對claudin-18.2的CARs展示了有希望的臨床活性，並與顯著但非劑量限制性的毒性相關，這可能是由於抗原表達局限於胃粘膜中深層的分化上皮細胞，這些細胞對CAR T細胞可能較難接觸。尋找具有足夠差異性表達的可安全靶向的分子，如癌胚表面靶標（oncofetal cell-surface targets），對於將CAR T細胞療法擴展到B細胞和漿細胞惡性瘤以外是至關重要的。然而，隨著實施增強效能和持久性的策略，將需要持續重新評估特定靶標的安全性，如在最近的一項研究中，一個整合了有著優勢負性TGFβ受體的針對PSMA的CAR與致命毒性相關。

包含邏輯門的下一代受體可以通過組合抗原感應更好地區分腫瘤和健康組織，並擴大潛在抗原的範圍（圖3）。Roybal等人開發了synNotch，這是一個IF-THEN電路，包含了一個針對抗原A的受體，一旦接觸，就會觸發針對抗原B的傳統CAR的轉錄。synNotch系統還沒有經過臨床測試，但在臨床前模型中，當腫瘤和易感的重要組織不在一起時，它可以防止目標上、非腫瘤的毒性。Tousley等人開發了一個名為LINK的AND門平臺，它利用了近端TCR信號分子LAT和SLP76，每個分子都融合了一個膜結合的scFv，對一個獨特的抗原進行特異性處理。在一個針對ROR1的模型中，該模型的目標是對腫瘤進行精確定位，但可能對非腫瘤組織產生毒性。在這個模型中，LINK CAR T細胞能夠消除表達兩種抗原的腫瘤，而不會引起與ROR1相關的毒性。然而，接受synNotch T細胞治療的小鼠卻無法承受這種毒性。目前正在開發的其他用於組合抗原定位的方法包括SUPRA和co-LOCKR，它們通過蛋白質開關機制來改變CAR T細胞的靶向性。儘管通過組合抗原識別可能會擴大可供靶向的腫瘤抗原的範圍，但腫瘤因丟失其中任何一種抗原而逃脫的風險可能會增加。另一種提高特異性的方法是使用“與非”邏輯門，該方法包括將啟動性CAR與一種抑制性CAR（iCAR）同時表達，其中iCAR靶向在健康組織上但非腫瘤組織上表達的抗原。目前，“與非”邏輯門的應用尚處於初步階段，且還未在臨床上進行測試。

TCR樣的CAR

以靶向低水準表達的抗原為目標，通過對內源性TRAC基因座進行基因編輯，將內源性TCR的可變區改變為單鏈抗體的不依賴於人類白細胞抗原的TCRs(HIT)。當CD80和4-1BBL以反式形式提供時，靶向CD19的HITS顯示出比原始的CD19-CARS更高的抗原敏感性(圖3)。合成TCR和抗原受體（STARs）具有類似的設計，但沒有敲入TRAC基因座；因此，內源性TCR的特異性得到了保留。其他重定向TCR特異性的方法包括抗體-TCR（AbTCR）平臺，它用Fab片段取代TCRγδ的可變結構域，以及TCR融合構建體（TRuC），它將scFv與CD3亞單位融合。最近對TCR類嵌合受體的比較表明，STAR和HIT受體能重現TCR抗原的敏感性，而TruCs卻不能。與天然T細胞相比，CAR T細胞的一個潛在缺陷是不能靶向細胞內抗原，因為大多數導致癌症的異常蛋白都是細胞內的。Yarmarkovich等人克服了這一點，開發了一種針對MHC(PMHC)呈現的多肽的CAR。他們利用了一種能特異性識別並結合在神經母細胞瘤中過度表達的PHOX2B肽-MHC複合體的scFv結合子，這使得他們能夠針對多種HLA等位基因的pMHC進行靶向。這種策略可能大大擴展CAR T細胞治療的目標範圍，包括關鍵的癌症驅動因素。

增加可及性和效率

人們正在採用各種方式，目的是擴大細胞治療的應用範圍，降低其生產成本，研製出可以抵抗排斥的隱形免疫細胞，並充分利用其他免疫細胞的獨特特性。

分散式製造和同種異體產品

隨著工程技術的進步，自動化封閉系統的製造已經實現，這為現場製造打開了新的可能，從而減少了中心化製造模式（即行業標準）帶來的成本、延誤和物流問題。最近的一項多中心研究證實了現場製造細胞的安全性和效能。目前，確定現場製造的監管要求尤其受到關注，特別是針對罕見病，如兒童癌症的治療。

通過利用來自健康的’超級捐贈者’製造異源性CAR T細胞，我們有可能提升治療效力，避免已存在的T細胞功能障礙，同時降低生產成本和物流難題，從而提高治療的普及性。然而，異源性T細胞療法面臨著要克服TCR介導的GVHD風險以及宿主免疫系統可能對移植細胞產生的排斥反應。雖然基因編輯技術可以消除內源性TCR，從而消除GVHD的風險，但要使細胞具有避開免疫排斥的隱形特性依然是一大挑戰，因為CD8+細胞、CD4+細胞、自然殺傷細胞和巨噬細胞均有可能對異源性細胞產生排斥，每種細胞的調控機制都不同，因此需要進行多種優化措施（詳見Box 1）。例如，敲除β2-微球蛋白可以消除HLA-I類的表面表達，但這反而可能增加自然殺傷細胞的排斥風險。此外，誘導異源性耐受的策略包括敲除CIITA基因消除MHC II類表達，以及通過過表達HLA-E和CD47來減少自然殺傷細胞和巨噬細胞對細胞的排斥。

大量異源性策略都採用了CRISPR-Cas9技術，而當用單一的生產過程製造成百上千的異源產品時，基於CRISPR的突變事件的風險可能會被放大。由於它們很可能因為沒有雙鏈DNA斷裂而降低了風險，基因編輯和primer編輯等替代平臺可能會逐漸成為以核酸酶為基礎的基因編輯的更好選擇。另外，以RNA為目標的CRISPR-Cas系統也可以為多重基因敲除提供機會，與RNA介導的干擾相比，其特異性和效率更高。儘管包含多重基因編輯的異源供體細胞可能具有重大優勢，但這些技術仍處於初期階段，其毒性特性尚未明確。有些研究團隊嘗試通過增強宿主的免疫抑制來防止免疫排斥，他們使用傳統的化療或免疫抑制抗體，而這些抗體的靶點則從CAR T細胞中被編輯掉。這種策略的初期回應率令人充滿希望，但其長期安全性和有效性尚未得到證實，且對於與強烈的免疫清除方案相關的感染風險的擔憂依然存在。

可替代的免疫細胞

包括自然殺傷細胞、iNKT細胞、γδ T細胞和巨噬細胞在內的多種非T免疫細胞顯示出天然的抗腫瘤活性，並且不會誘導GVHD，這為他們可能提供一種減輕毒性、增強腫瘤遷移能力，或者通過天然識別腫瘤來針對抗原陰性變體的即用型細胞源提供了可能性。然而，異源性天然免疫細胞仍容易被排斥，如果這些細胞未經精心設計以降低被識別概率，這就引發了人們對其效果持久性的擔憂。臍帶血衍生的異體自然殺傷細胞結合異位表達的IL-15，在一期試驗中顯示出治療NHL和CLL的前景。在小鼠模型中，iNKT-CAR細胞通過部分激發宿主CD8細胞對腫瘤抗原的反應表現出活性，並且其在一項針對神經母細胞瘤的初級臨床試驗中已經顯示出安全性和可能性。此外，工程改造後能表達CD20-CAR的γδ T細胞在早期研究中也表現出了顯著的活性。儘管在巨噬細胞中表達CAR需要對載體和信號域進行大量調整，但是預實驗模型已經證明其具有增強吞噬、改變腫瘤微環境和吸引T細胞等抗腫瘤效果，其中，以CD3ζ為基礎的CAR與以Fcγ為基礎的CAR顯示出相似的吞噬活性。現在，人們也在努力研發誘導多能幹細胞（iPS）衍生的CAR T細胞、自然殺傷細胞和巨噬細胞。iPS細胞向自然殺傷細胞的分化特別成功，這些即時使用的療法的臨床測試目前正在進行。而相比之下，iPS細胞分化為具有完全功能的T細胞則更為挑戰性。鑒於iPS細胞衍生產品幾乎擁有無盡的擴張潛力，它們可以實現大規模生產具有多種增強特性的均一細胞產品，包括賦予其隱形屬性、安全開關以及有效性。因此，人們對這些新興平臺的長期安全性和有效性結果充滿了期待。

下一代基因傳遞技術

病毒載體的基因傳遞一直被認為是這個領域的黃金標準，然而病毒載體的製造和鑒定過程既花費高昂又耗時。目前，正在研發無病毒的基因傳遞平臺，雖然DNA範本對T細胞具有毒性，且這種方法的效率仍然不如病毒載體，但已經通過在人T細胞中使用基於CRISPR的基因傳遞來證明了這個原理。臨床可行性已被證實，通過將CD19-CAR特異地傳遞到PD-1位點，引發了NHL中的高CR率，儘管這個製造過程並未能滿足相當大一部分患者的劑量要求。改良DNA範本和小分子抑制劑混合液正在提高基因插入的效率和細胞產量。轉座子基因傳遞方法也已經被使用，然而有兩個病例報告使用Piggybac轉座子平臺進行高拷貝數的整合後，CAR工程T細胞發生了惡性轉化。體內基因傳遞是一種新興的方法，能提高可訪問性並降低成本。在這種方法中，DNA或RNA通過病毒載體或納米顆粒進行系統性傳遞，這些納米顆粒能優先靶向並在體內轉化免疫細胞群。但是，由於病毒載體可能引發中和抗體，其免疫原性可能限制其重複使用。已經證明，在小鼠中使用靶向CD3的脂質納米顆粒可以穩定表達CD19-CAR，而且含有優化RNA的T細胞靶向脂質納米顆粒在小鼠模型中減少了心臟纖維化。

用於非惡性疾病的CAR療法

雖然CAR T細胞平臺已經被優化用於癌症治療，但是應用於CAR T細胞的設計原則和廣泛的合成生物學工具箱為將此治療方法擴展到包括自身免疫性疾病、衰老、纖維化和傳染性疾病在內的非惡性疾病提供了可能性。在臨床前研究中，CD19-CAR T細胞已在系統性紅斑狼瘡中顯示出有益效果，且有病例研究報告了CD19-CAR療法在一個難以治療的狼瘡性腎炎患者中的持久效果。嵌合型自身抗體受體（CAARs）是原型CARs，它們中包含針對自身反應性B細胞克隆的特異性決定簇（idiotype）的scFv，或者使用自身抗原作為識別領域。臨床前研究中，CAARs已在天皰瘡治療中展示了療效，臨床測試也正在進行中。採用調節性T細胞（Treg細胞）作為替代方法來治療自身免疫性疾病，這種細胞主要發揮抑制作用，而非毒殺作用。非工程化的Treg細胞在移植物抗宿主病（GVHD）、異種移植、1型糖尿病、系統性紅斑狼瘡和多發性硬化症的小鼠模型中已經表現出了活性，早期臨床資料也顯示了這種方法的可行性和良好的安全性。與非工程化細胞相比，表達針對疾病組織上表達的抗原的CAR的Treg細胞顯現出了更強的特異性和效能。最近的研究資料顯示，無意中擴展CAR Treg細胞的數量已經限制了商業CAR T細胞的效果，這為CAR工程化Treg細胞的實用性提供了原理驗證。目前，人們正在嘗試通過工程化FOXP3表達來強化其譜系穩定性，並引入安全開關以減少相關風險。在血友病小鼠的最新預實驗資料中，研究人員發現表達了針對因數VIII的CAR和FOXP3的Treg細胞能夠阻止中和抗因數VIII抗體的產生。此外，針對尿激酶型纖溶酶原啟動物受體的衰老細胞殺傷CAR T細胞已經被證明能在體外靶向衰老細胞，並在肝纖維化模型中恢復組織的穩態。針對成纖維細胞活化蛋白（FAP）的CARs在心臟纖維化的小鼠模型中已經提高了心臟功能，並且利用裝載有mRNA的CD5導向脂質納米粒子在體內生成的FAP-CARs也顯示出有益效果。在這個模型中，mRNA的非整合特性確保了CAR表達是暫時性的，因此減輕了因廣泛清除活化成纖維細胞所帶來的毒性風險。

CIK細胞及其在肺癌治療中的研究進展

Zhongguo Fei Ai Za Zhi. 2011 Dec 20; 14(12): 954–959.

Chinese. doi: 10.3779/j.issn.1009-3419.2011.12.10

Abstract

肺癌作為惡性腫瘤導致死亡的首要原因, 嚴重影響人類的健康。由於細胞因數誘導的殺傷細胞(cytokine-induced killer cells, CIK)強大的增殖活性和細胞毒活性、非主要組織相容性複合體(major histocompatibility antigens, MHC)限制性以及低毒副作用等優點成為近年研究的熱點。本文旨在介紹CIK細胞的基本特徵及發揮作用的機制, 綜述CIK細胞用於肺癌治療的研究進展, 討論CIK細胞大規模用於臨床前需要解決的若干問題並作出展望。

Keywords: 肺腫瘤, CIK細胞, 過繼免疫

肺癌尤其是小細胞肺癌(small cell lung cancer, SCLC)因其惡性程度高、預後差(5年生存率 < 5%), 已經成為各種癌症中導致死亡的首要原因[1]。由於手術切除的不徹底性、肺癌細胞對化療的多重耐藥性(multidrug resistance, MDR)和對放療的低敏感性以及不可忽視的副作用等原因, 肺癌的復發、遠處轉移等難題長期不能得到有效解決。當傳統治療手段無法為肺癌患者提供滿意的長期生存期, 新的治療方法應運而生。

近年來基於免疫細胞在惡性腫瘤治療方面的巨大潛力, 過繼免疫作為生物治療的有效手段之一已成為近年來腫瘤治療的重要研究方向。到目前為止多種免疫細胞如樹突狀細胞(dentritic cells, DC)[2, 3]、細胞毒T淋巴細胞(cytotoxic T lymphocytes, CTL)[4, 5]、自然殺傷細胞(natural killer cells, NK)[6]、淋巴因數啟動殺傷細胞(lymphokine-activated killer cells, LAK)[7]、抗CD3單克隆抗體誘導的殺傷細胞(anti-CD3 monoclonal antibody-induced killer cells, CD3AK)[8]、腫瘤浸潤淋巴細胞(tumor-infiltrating lymphocytes, TIL)[9]等曾被用於腫瘤治療的實驗研究或臨床治療並顯示出一定的抗癌能力。但由於體外擴增能力受限或安全性方面的問題, 這些免疫細胞在大規模臨床試驗研究中受到一定限制。而Schmidt-Wolf等[10]於1991年首次報導的細胞因數誘導的殺傷細胞(cytokine-induced killer cells, CIK)因其在體內外展現出來的強大抗腫瘤活性而備受關注, 迅速成為腫瘤免疫治療的前沿和熱點。

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1. CIK細胞

研究[11]認為CIK細胞來源於CD3+CD56–T細胞, 是啟動的Ⅱ型T淋巴細胞且同時兼具NK細胞的殺傷特性。但CIK細胞在外周血中含量甚微(約1%-5%)。因此要將CIK細胞用於臨床治療, 首先必須進行大量擴增。CIK細胞的產生過程大致如下:利用密度梯度離心法將患者或健康人外周血中單核細胞分離出來後, 通過添加外源性細胞因數如IFN-γ、IL-2、IL-1、OKT3(抗CD3的一種單克隆抗體)進行體外誘導擴增。體外擴增2周-4周後, 培養基中出現大量具有強抗癌活性的異質細胞群, 即為CIK細胞。CIK細胞主要包括CD3+CD56+T細胞、CD3+CD56–T細胞以及CD3-CD56+T細胞, 其中CD3+CD56+T細胞亞群被認為是發揮抗癌活性的主力軍, 約占CIK細胞數量的40%-75%(也有文獻將CD3+CD56+T定義為CIK細胞)。

各種外源性細胞因數的作用和機制並不相同, 如IL-2的作用機制可能是通過其受體共用鏈IL-2Rβ鏈和γ鏈, 經Jak/Stat信號轉導通路參與細胞增殖, 同時促進NK細胞和T細胞定向分化為效應細胞發揮殺傷作用; OKT3的作用主要是刺激T細胞的增殖, 而對細胞毒活性影響不大; 而IFN-γ和IL-1對提高細胞毒活性非常重要, 並且不同的添加順序對細胞毒活性影響甚大, 將IFN-γ添加在IL-2之前可以明顯提高細胞毒活性, 其機制在於IFN-γ可以誘導IL-2受體(IL-2R)的高表達, 從而更有利於IL-2發揮作用。

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2. CIK細胞基本特徵

2.1. 強大的體外擴增能力

大規模數量的殺傷活性細胞是過繼免疫用於臨床治療的前提條件。LAK細胞在臨床應用方面受到嚴重限制, 其主要原因在於其內在的弱增殖活性, 獲得一定數量的細胞需要大量的IL-2, 因而造成的毒副作用尤其是毛細血管滲漏綜合征不容忽視。CIK細胞不僅具有簡單的體外擴增程式, 其同樣具有強力的體外擴增能力。Jiang等[12]報導CIK細胞的增殖高峰出現在第21-28天, 細胞數量高達上千倍。

2.2. 非主要組織相容性複合體(major histocompatibility antigens, MHC)非限制性的殺瘤活性

MHC限制性要求腫瘤細胞高表達某些信號分子以供自身抗原遞呈細胞識別, 進而啟動T細胞殺傷功能發揮抗腫瘤作用。但是近年研究證實, 腫瘤細胞的免疫逃避機制也是導致腫瘤治療失敗的主要原因之一。CIK細胞是最終效應細胞, 可以通過MHC非限制性途徑[13]發揮對腫瘤細胞的直接殺傷作用, 而對正常細胞沒有影響。

2.3. 強大的細胞毒活性

CIK細胞的抗腫瘤活性主要依賴於CD3+CD56+T細胞的直接殺傷能力。Wang等[14]利用膠質瘤細胞系U87和U251比較CIK細胞和LAK細胞的抗癌能力, 研究證實CIK細胞擁有比LAK細胞更加強大的抗腫瘤能力。而Kim等[15]研究表明, 當CIK細胞與靶細胞比值為30:1時, 98%的NCI-H460肺癌細胞可被殺滅, 進一步證實了CIK細胞強大的細胞毒活性以及應用於臨床的巨大潛力。

2.4. 副作用少, 應用安全

免疫細胞應用於臨床首先必須解決安全性問題, TIL細胞在臨床應用方面受到限制, 主要是因為在細胞製備過程中, 腫瘤細胞的摻入有可能帶來癌變的風險。到目前為止, 大量的動物實驗和臨床研究表明CIK細胞副反應少, 毒副作用低, 臨床應用相對安全可靠。在一項40例病例參與的臨床隨機對照研究中, 研究者[16]利用臍血來源的CIK細胞治療包括肺癌、胃癌、結腸癌等在內的多種實體瘤, 觀察其副作用發現共有4例病例出現發熱、流感樣症狀、乏力、肌痛症狀, 對症處理後可以完全緩解。

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3. CIK細胞作用機制

3.1. CIK細胞直接細胞毒活性

CIK細胞強大的抗癌能力主要歸功於其CD3+CD56+T細胞亞群的直接細胞毒活性。這種直接殺傷機制可概括為:CIK細胞表面表達某些趨化因數或趨化因數受體, 可誘導其定向到達腫瘤細胞, 通過細胞表面的受體和腫瘤細胞表面的配體結合後, CIK細胞被啟動。啟動的CIK細胞釋放穿孔素和細胞毒顆粒如α-氮-甲苯碳醯基-左旋-賴氨酸硫甲苯酯, 這些顆粒能夠直接穿透封閉的靶細胞進行胞吐, 從而導致癌細胞的裂解, 但是整個過程不依賴於T細胞表面受體和Fas受體[17]。同時, 利用MHC Ⅰ類和Ⅱ類抗體不能阻滯CIK細胞對靶細胞的殺傷作用, 整個過程是非MHC限制的。研究[10]證實, 在CIK細胞與靶細胞的接觸過程中利用淋巴因數功能相關抗原(lymphocyte function-associated antigen 1, LFA-1)或其配體細胞粘附分子(inter cellular adhesion molecule 1, ICAM-1)的單克隆抗體均可有效降低CIK細胞的殺傷活性。進一步研究發現, 在CIK細胞與靶細胞的接觸過程中, CIK細胞表面的FcR使LFA-1和ICAM-1的結合狀態從低親和力轉為高親和力狀態是其釋放細胞毒顆粒的前提, 這些均表明細胞表面粘附分子在CIK細胞對腫瘤細胞的識別過程中起到重要作用。另外, 研究[18]認為CIK細胞表面分子如NKG2D、DNAM-1及NKp30等在CIK與靶分子的識別過程中起到重要作用。

3.2. 分泌和免疫調節

CIK細胞兼具T細胞和NK的殺傷活性, 同時作為免疫細胞可以分泌多種炎性因數, 如IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-6和GM-CSF等, 直接或間接參與殺傷腫瘤細胞。Kornacker等[19]在用CIK細胞治療慢性淋巴細胞白血病的研究中發現, CIK細胞分泌的IFN-γ能誘導慢性淋巴細胞白血病細胞上粘附分子ICAM-1的高表達, 進而提高CIK細胞誘導腫瘤細胞凋亡的能力。另外, CIK細胞可以與機體抗原遞呈細胞如樹突狀細胞相互作用, 可提高樹突狀細胞的專職抗原遞呈能力, 刺激機體CTL大量增殖, 從而大大刺激了機體對腫瘤細胞的反應性, 對於機體主動免疫應答起到很好的促進作用。

3.3. 誘導腫瘤細胞凋亡或壞死

加速或誘導腫瘤細胞的凋亡或壞死也是近年來腫瘤治療的重要研究方向。同時, Sun等[20]報導了CIK細胞可以誘導MGC-803胃癌細胞的凋亡並抑制其增殖能力, 免疫組化等方法證實CIK細胞殺傷胃癌細胞的機制為下調p53、C-myc和Bcl-2等基因的表達, 上調Bax基因的表達, 從而起到早期誘導胃癌細胞凋亡, 晚期誘導其壞死的效果。師岩等[21]研究證實, CIK細胞能誘導人肺癌細胞A549出現凋亡的超微結構變化, 流式細胞分析法檢測早期凋亡率發現CIK實驗組明顯高於對照組, 提示體外培養的CIK細胞可明顯誘導人肺癌細胞A549凋亡。

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4. CIK細胞用於肺癌治療的研究進展

近年隨著過繼免疫的迅速發展, CIK細胞也成為一種新的免疫細胞而倍受青睞。大量關於CIK細胞的動物實驗和臨床研究證實了CIK細胞用於腫瘤治療的廣闊前景。到目前為止, CIK細胞用於治療肝癌、食管癌、乳腺癌、胃癌、結腸癌、腎細胞癌以及各種類型白血病[22–25]等取得初步成效, 在肺癌治療方面也有新的進展。

4.1. CIK細胞治療肺癌

Kim等[15]報導在體外實驗中, 當CIK與肺癌細胞數比值為30:1時, 98%的NCI-H460肺癌細胞可被殺滅。在動物實驗中, 當CIK細胞數為3×105個和3×106個時, 利用NCI-H460肺癌細胞接種產生的腫瘤體重可分別減輕57%和77%。李淑豔等[26]研究發現CIK細胞在體內外抑制Lewis肺癌細胞增殖, Fas/FasL途徑在誘導腫瘤細胞凋亡中發揮一定作用, 同時CIK細胞抗腫瘤作用可能與淋巴細胞活化和分泌細胞因數有關。臨床應用方面, Lin等[27]報導了1例伴發肺癌和類腫瘤皮膚病的多發性骨髓瘤病例, 患者在接受CIK細胞治療後可有效控制肺癌進展。劉啟亮等[28]和李文等[29]分別利用自體CIK細胞治療晚期非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)患者取得初步療效。其中, 後者療效評價中總緩解率為78.1%, 臨床症狀評分改善率為86.4%-92.9%, 1年生存期達到80.4%。這些臨床研究證據表明CIK細胞自體回輸可能是治療晚期肺癌良好過繼免疫治療方法, 可延長患者的生存期, 改善患者的生活狀況, 且未見明顯的毒副作用。

4.2. 聯合DC與CIK細胞治療肺癌

CIK細胞在腫瘤治療方面具有巨大潛力, 但是作為一種被動免疫治療並不能長久地控制腫瘤的生長, CIK細胞聯合DC疫苗成為主動免疫作為一種新的治療策略開始湧現。DC是人體內主要的抗原遞呈細胞, 其主要功能是誘導、調節及維持T細胞的免疫應答。另外, DC可以捕獲腫瘤相關抗原, 表達淋巴細胞共刺激分子, 分泌各種細胞因數並啟動細胞免疫和體液免疫。CIK細胞與DC共培養具有相互促進作用[30], 可明顯提高DC特異性的共刺激分子的表達和IL-12的分泌, 進而提高CIK細胞對腫瘤細胞的殺傷活性。體外實驗中鄭秋紅等[31]和呂章春等[32]分別報導了腫瘤抗原致敏的DC誘導的CIK細胞對肺癌細胞的殺傷活性明顯高於單純的CIK細胞, 隨著效靶比的升高, DC-CIK細胞對肺癌細胞的殺傷效應隨之增強(P < 0.05), 並探討DC增強CIK殺傷活性的可能機制為:DC表面的樹枝狀突起可使其負載腫瘤抗原並呈遞給CIK細胞, 啟動後的DC分泌IL-12、IL-18及IFN-γ等細胞因數, 刺激Th0、Th2細胞向Th1細胞分化, 並強烈激發Th1型特異性免疫應答。周永春等[33]利用DC疫苗聯合CIK細胞治療70例NSCLC的臨床觀察顯示, DC-CIK治療組中Ⅱ期、Ⅲ期患者的有效率分別為39.30%和28.60%, 與對照組的相應期別(Ⅱ期26.90%, Ⅲ期22.20%)相比差異有統計學意義(P < 0.05)。體內外實驗均提示腫瘤抗原負載的DC細胞可增強CIK細胞對肺癌細胞的殺傷活性, 具有推廣運用的價值。

4.3. 聯合化療與CIK細胞治療肺癌

儘管MDR的出現導致各種惡性腫瘤對化療的反應不盡人意, 化療仍然是多種肺癌尤其是SCLC患者的首選治療方案。多項研究[4, 34, 35]證實, 化療可以通過殺滅免疫抑制細胞(如髓系抑制性細胞、調節性T細胞)等方式提高機體對抗腫瘤的免疫應答, 增加腫瘤細胞對免疫細胞的敏感性。在一項59例晚期NSCLC患者參與的前瞻性臨床研究中, Wu等[36]報導了與單獨的化療方案相比, 聯合化療和CIK細胞治療晚期肺癌能明顯提高患者機體免疫應答和生存品質, 其無進展生存期(P=0.042)和總生存期(P=0.029)均延長, 且無明顯毒副作用。類似的, Niu等[16]將一線化療失敗的40例惡性腫瘤患者(包括15例肺癌患者)隨機分為兩組後分別予以二線化療和聯合二線化療與CIK細胞治療, 其無進展生存時間分別為2.03個月和3.45個月(P=0.031)。這些研究結果表明聯合化療與過繼免疫可能作為一種新的治療方案為肺癌患者帶來更好的預後。

4.4. 其他

鑒於CIK細胞在臨床應用方面的巨大潛力, 各種用於提高CIK細胞增殖活性或殺傷活性的策略不斷湧現。比如, 王士勇等[37]通過添加重組人纖維蛋白片段能明顯增強CIK增殖活性, 但對CIK細胞的殺傷活性並無明顯影響。多項研究[38–40]報導將DC疫苗、化療和CIK細胞三者聯合治療腫瘤也取得一定成就, 可能成為未來肺癌治療的新趨勢。

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5. CIK細胞存在的問題和未來的方向

儘管CIK細胞在體內外展現出的強大細胞毒活性等優勢給臨床肺癌治療帶來新的希望, 但在CIK細胞廣泛應用於臨床之前仍有許多問題丞待解決。

5.1. 作用機制不夠明確

到目前為止, CIK細胞發揮其強大細胞毒活性的機制還不夠明確, 尤其是其與宿主免疫之間的複雜網路關係需要深入研究, 因為明確的作用機制才能為臨床提供更好的理論基礎和治療靶點。如CIK細胞進入機體後, 其啟動機制和發揮直接殺傷活性的機制有待進一步闡明。另外, 研究發現CIK細胞能夠刺激機體T細胞大量增殖, 分泌各種細胞因數, 起到調整機體免疫的功能, 但是CIK細胞與機體免疫細胞之間的環路關係並不十分清楚。

5.2. CIK臨床應用欠規範

科學、系統的制度和規範有助於CIK細胞臨床研究的開展, 但到目前為止, CIK的製備和臨床使用還沒有形成統一的標準。如CIK細胞的數量和活力是保證臨床療效的關鍵, 但是從肺癌臨床治療的文獻報導看, 各個研究單位使用的CIK細胞的製備方案和輸注數量各有差異。另外, 不同單位對臨床效果評價指標的選擇也不盡相同, 由此導致CIK細胞的實際臨床效果很難得到準確評估。CIK細胞用於肺癌臨床治療的報導主要是個案研究、前瞻性研究和少數的隨機對照研究, 且多為短期療效的評估; CIK細胞在肺癌臨床治療上的橫向比較(肺癌與其他腫瘤的治療效果對比)和縱向比較的(各種類型肺癌的治療效果對比)資料還比較缺乏, 其對腫瘤強大殺傷作用和低毒副作用還沒有足夠的循證醫學證據支持。因此, 大規模的臨床隨機對照研究或高品質的meta分析顯得非常必要。

5.3. CIK的發展趨勢和方向

如前所述, CIK細胞和DC疫苗、化療聯合應用時具有相互促進作用, 進而提高CIK細胞對肺癌細胞的殺傷活性。因此, 聯合化療、DC疫苗和CIK細胞作為一種新的治療方案可能是未來肺癌乃至其他惡性腫瘤的發展方向, 但是, 聯合治療可能產生大量的過敏毒素和細胞因數[41], 因此帶來的副作用必須在應用之前得到更好的研究。另外, 體外實驗[16]發現CIK細胞可以下調A549/CDDP和K562/ADR細胞系中耐藥轉運蛋白ABCG-2和P-gp的表達, 通過高表達CD3、CD56、FasL和CD59發揮對腫瘤耐藥細胞的殺傷活性, 這無疑為以後耐藥相關腫瘤的臨床治療提供了新的思路。最後, CIK細胞在其他疾病如慢性乙型肝炎[42]的治療也見諸多報導, 但其治療效果還有待進一步研究證實。

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6. 總結

肺癌作為癌症導致死亡的首要原因, 嚴重威脅著人類健康。傳統治療方案如手術、化療等往往不盡如人意, 過繼免疫作為一種新的治療方法越來越受到重視, 而CIK細胞由於其強大的增殖活性和細胞毒活性、非MHC限制性以及低毒副作用等優點備受矚目。但是, 在CIK細胞廣泛應用於臨床為肺癌患者服務之前, 還有諸多問題需要解決, 相信隨著對CIK細胞的深入研究和更多循證醫學證據的出現, 過繼免疫治療肺癌將會有新的突破。

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間質幹細胞(hMSC)其外泌體 (Exosome) 的臨床治療潛力

對於部分目前沒有有效療法的疾病來說，間充質乾細胞 (MSCs) 的免疫調節和再生特性使它們成為可能的替代治療選擇，但經過許多臨床試驗的結果發現，間質乾細胞 (MSCs)的注射可能導致輸注毒性和細胞排斥等問題。為瞭解決與基於細胞的治療相關的這些問題，科學家們後續開發了 MSC 外泌體療法，也觀察到有希望的臨床治療效果。

MSC及外泌體 (Exosome)

MSC 外泌體是由 MSC 分泌的納米級囊泡，是一種非細胞治療劑。MSC 外泌體保留了它們起源的細胞的治療特徵，包括遺傳物質、脂質和蛋白質。外泌體與 MSCs 類似，外泌體可以誘導細胞分化、免疫調節、血管生成和腫瘤抑制。因此，MSC 外泌體已被用於多種實驗模型和臨床研究。

間質乾細胞（MSCs）由於其乾性而具有獨特的生物醫學特性：它們可以模擬自身增殖並可以分化成多系細胞。由於主要組織相容性複合體 (MHC) I 類分子的低表達和少數 MHC II 類分子的表達，MSCs 具有低免疫原性。重要的是，MSCs 已被證明在各種疾病模型中具有免疫調節和再生功能。鑑於這些特性，MSCs 已在數十年的臨床試驗中進行了評估 。儘管使用 MSCs 的一些臨床前研究和臨床試驗的結果看似很有希望，但在其他研究中，MSC 治療後臨床結果通常沒有顯著改善疾病嚴重程度，這使得基於 MSC 的治療存在爭議 。

MSCs 影響的這些差異可能是由於注入的 MSCs 植入不良，供體依賴性變異，或由於細胞在微脈管系統中的駐留而可能導致的輸注毒性 。此外，MSCs 在體外擴增過程中的衰老會降低細胞的生產能力，並且會通過引起炎症來增加疾病的嚴重程度。為了保證一致和穩定的治療效果，需要改進 MSC 治療策略，策略應考慮當前的障礙，例如體內存活率低、發炎病變的遞送不准確以及供體間的差異。研究人員試圖通過改善 MSCs 向病灶的遷移並用生物活性分子如 IFN-γ 和 TNF-α對它們進行預處理來增強 MSCs 的治療效果]。此外，包括支架和水凝膠在內的共同給藥策略的使用使疾病治療更加謹慎和準確。改善基於 MSC 的治療的另一種方法是使用細胞外囊泡 (EV) 或外泌體 。

從原核生物到真核生物，在細胞之間藉由釋放的EV來傳遞生物信號參與細胞間通訊。根據它們的生物起源，EV 分為三大類：外泌體( exosomes)、微泡(microvesicles)和凋亡小體(apoptotic bodies) 。外泌體的最小尺寸範圍約為 50 至 150 nm，當多泡體(multivesicular)與細胞膜融合時，外泌體被釋放到細胞外環境中。這些納米大小的囊泡含有許多細胞成分，包括細胞因數和生長因數、信號脂質以及 mRNA 和調節性 miRNA，外泌體的成分根據其細胞來源而有所不同。值得注意的是，MSC 外泌體可能比 MSC 更適合臨床應用。MSC 外泌體可能沒有免疫原性問題，並且不太可能像注入的 MSC 一樣被困在肺或肝臟中，同時仍保持其來源細胞的治療功能。鑑於 MSC 衍生的外泌體在臨床前研究中的治療潛力已得到證實。

MSC 外泌體的治療特性

間充質乾細胞已被評估為多種罕見疾病的替代療法，因為它們具有免疫調節活化免疫細胞和刺激組織再生的能力。兩種主要的細胞行為是其治療效果的基礎：直接細胞介導的作用和可溶性因數釋放引起的環境變化 。MSC分泌蛋白組是指釋放到培養基中的可溶性因數，在釋放的物質中，微泡（MV，直徑 0.1-1 mm）和外泌體（直徑 50-150 nm）作為 MSCs 和靶細胞（包括 MSCs）之間的細胞間介質發揮作用。納米級外泌體(Nanosized exosomes)特別被認為是 MSC 替代品，因為它們具有與 MSC 相似的治療特徵。外泌體可能比 MSCs 具有更大的臨床應用潛力，因為它們具有較低的免疫原性和致瘤性 。因此，MSC外泌體的使用為MSCs的臨床應用開闢了新的途徑。

MSC（間充質乾細胞）外泌體的組成和治療功能。來自 MSCs 的外泌體可能含有生長因數、細胞因數、DNA、脂質、mRNAs、miRNAs 和 mtRNAs。與其起源的細胞相似，MSC 外泌體具有治療特性，包括刺激細胞遷移和細胞外基質合成、抗凋亡作用、免疫調節和抗炎作用以及刺激膠原蛋白沉積。由於這些獨特的治療特徵，MSC 外泌體治療的可行性目前正在幾項臨床研究中進行評估。

MSC 衍生的外泌體最重要的特性是它們的“(載貨cargo)”功能，它們包含多種經過驗證的治療劑，MSC外泌體的內容包括核酸、蛋白質和脂質，描述了超過850個基因產物和150個miRNA 。此外，它們的組成可能會因 MSCs 的分離來源和外部刺激而有所不同，這也是不同來源的 MSCs 表現出不同特徵或治療效果的原因之一 。儘管來自不同 MSC 來源的外泌體的特徵可能有所不同，但它們通常具有治療作用。MSC 外泌體將其內容物（如 mRNA、miRNA 和蛋白質）水準轉移到靶細胞中，以改變這些細胞的細胞功能 。儘管 MSC 外泌體內吞作用的機制尚未完全闡明，但包括囊泡-細胞融合、吞噬作用、微胞飲作用和/或受體介導的內吞作用在內的幾個細胞過程被認為與內化(internalization)有關 。

在臨床前研究中已經描述了 MSC 外泌體的幾個臨床特徵。例如，MSC 外泌體通過調節內源細胞的增殖和凋亡來加速組織再生過程。MSC 外泌體也影響一些免疫細胞的命運決定，從而促進過度炎症的減弱或恢復免疫穩態 。此外，MSC 外泌體通過刺激各種細胞信號通路誘導血管生成。鑑於這些有希望的結果，MSC 外泌體應用的安全性和有效性目前正在針對各種疾病的臨床試驗中進行評估。以下，我們根據疾病類型回顧 MSC 外泌體的治療潛力。

免疫相關疾病

MSCs 和 MSC 衍生的外泌體最重要的臨床特徵是它們的免疫調節功能。免疫相關疾病通常是由於免疫系統的失衡以及隨後身體對特定類型免疫反應的偏向啟動的反應。MSC 外泌體作為 MSC 介導的各種免疫細胞免疫調節的主要介質引起了人們的興趣。來自 MSCs 的外泌體在調節各種免疫細胞亞群和隨後促進免疫穩態中發揮作用，就像它們的起源細胞一樣。MSC 外泌體已被證明對活化的免疫細胞具有抑制功能，包括效應 T 細胞、小膠質細胞 、巨噬細胞和 NK 細胞。相比之下，MSC 外泌體有助於向調節型免疫細胞（如耐受性樹突細胞、M2 巨噬細胞和調節性 T 細胞確定譜系，從而促進免疫系統穩態。臨床前研究證明的調節功能激發了針對各種自身免疫性疾病的臨床試驗。

MSC 外泌體有效抑制 Th1 細胞的過度增殖和活化。例如，在動物移植物抗宿主病 (GvHD) 模型中，表達 CD39 的 CD4 + Th1。此外，針對 GvHD 的治療功能已在人體研究中得到證實 。根據先前使用接觸超敏反應 (CHS) 模型小鼠的研究，輸注來自臍帶衍生的 MSC (UC-MSC) 的外泌體導致 Th1 細胞水準降低，隨後分泌 IFN-γ，同時 Treg 誘導增加。EV 的內化也被證明與信號轉導和轉錄啟動因數 1 (STAT1) 的表達降低有關，STAT1 在 Th1 細胞發育中起著至關重要的作用 。

MSC 外泌體還可以抑製過度的過敏性炎症，據報導，輸注源自脂肪組織來源的 MSC (AT-MSC) 的外泌體通過改善病理症狀和肥大細胞浸潤到皮膚病變中來緩解特應性皮炎 (AD) ，由於抑制第 2 組先天淋巴細胞 (ILC2) 通路或促進 Treg 群 。鑑於這些臨床前發現，MSC 外泌體的臨床潛力目前正在四種不同的免疫疾病中進行評估。

大約 35-50% 的患者在異基因造血幹細胞 (HSC) 移植後患有 GvHD，這是由捐贈的造血幹細胞將受體身體系統視為外來並攻擊它們引起的。慢性 GvHD (cGvHD) 的特徵是皮疹、腹部腫脹、眼睛乾澀、視力改變、氣短、肌肉無力和關節緊繃 。在這些症狀中，乾眼症是最常見的，發生在 40-76% 的患者中，其嚴重程度可以反映疾病的預後。乾燥性角結膜炎是由淚腺周圍的淋巴細胞浸潤引起的，導致組織退化和功能障礙。由於皮質類固醇或環孢菌素 A 等免疫抑製劑非特異性抑制免疫系統，並不適用於所有患者，因此 MSC 已被視為治療 cGvHD 乾眼症的替代療法 。2019年12月註冊了一項評估臍帶間充質乾細胞（UMSC）外泌體緩解乾眼症狀療效的臨床試驗（NCT04213248）。值得注意的是，該試驗的目的是分析疾病指標的反應，例如眼淚量和對組織的損傷程度，以滴眼劑形式應用外泌體而不是血管內註射的外泌體治療。

第一型糖尿病 (T1DM) 是另一種眾所周知的自身免疫性疾病，需要終生管理，症狀包括體重減輕、疲憊、皮膚發癢和視力模糊。體內的免疫細胞以未知原因攻擊胰腺β細胞，對胰島素產生和隨後的葡萄糖代謝產生不利影響。由於目前還沒有特定的治療方法，T1DM 患者需要每天注射胰島素或安裝胰島素泵以維持血糖水準的正常範圍 。為瞭解決缺乏治療 T1DM 特異性藥物的問題，據報導Nojehdehi 等人利用來自 AD-MSCs 的外泌體通過增加脾臟中的 Treg 數量和再生胰島，在鏈脲佐菌素誘導的 T1DM 小鼠模型中具有治療作用 。來自月經 MSCs 的外泌體在大鼠模型中顯示出相似的治療潛力。目前正在進行一項臨床試驗，評估重複靜脈輸注 UCB 血液來源的 MSC 外泌體對 T1DM 的影響（NCT02138331）。

除了這些自身免疫性疾病，MSC 外泌體已被證明可以緩解實驗性牙周炎。牙周腔內的菌群失調會促進牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿菌等病原微生物群的生長，從而在這些自身抗體侵入循環系統和各種器官後促進自身抗體的產生和宿主免疫反應的破壞。據報導脂肪組織來源的 MSC (AD-MSC) 外泌體在牙周韌帶和組織再生中發揮支持作用 。在一項臨床研究中，正在評估自體施用 AD-MSC 外泌體在緩解 18 至 50 歲患者牙齦炎症和組織損傷方面的療效（NCT04270006）。

最後，多器官功能障礙綜合徵 (MODS)，心血管手術後導致死亡的術後並發症，正在用從 UC-MSCs (NCT04356300) 中分離出來的外泌體進行治療。促炎細胞因數 IL-6 通常被用作 MODS 的預後指標，因為 IL-6 是響應組織損傷和炎症刺激而釋放的 。評估 MSC 外泌體的安全性和有效性、短期和長期免疫反應、IL-6 濃度（早期 3 天）和過敏反應，包括皮疹、瘙癢和過敏性休克（長達 6 個月）以及器官衰竭評估分數正在調查中。

傷口癒合

來自各種 MSCs 的外泌體已被證明可以加速傷口修復。儘管傷口癒合是一種複雜的生理現象，但 MSC 外泌體通過促進皮膚細胞成分的增殖、分化、定位 和誘導免疫細胞的分化來促進恢復過程。皮下施用源自 iPSC-MSCs 的外泌體已被證明可通過促進成纖維細胞分泌 I 型和 III 型膠原蛋白和彈性蛋白來加速動物模型中的傷口修復 。此外，移植的 MSC 外泌體不僅在血管生成中發揮關鍵作用，而且在傷口部位血管的成熟以促進癒合過程。

大皰性表皮鬆解症 (EB)是一種以皮膚脆弱和對機械性創傷起水泡為特徵的疾病，有 30 種不同的亞型。在疾病亞型中，由 VII 型膠原 (COL7A1) 基因突變和隨後缺乏蛋白質產生引起的隱性營養不良性大皰性表皮鬆解症 ( RDEB ) 可以通過骨髓來源的 MSC (BM-MSC) EV 得到緩解，因為它們捐贈了自己的類型VII 膠原蛋白並誘導宿主成纖維細胞產生這種蛋白質。鑑於這些有希望的結果，啟動了 I/IIA 期臨床研究，以測試異基因 MSC 外泌體在 EB 中局部應用的安全性和可行性。將在 10 名參與者 (NCT04173650) 中評估劑量限制性毒性和傷口大小衰退。此外，另一項使用 BM-MSCs 的前瞻性臨床研究報告稱，靜脈輸注耐受性良好，長達 12 個月沒有嚴重並發症，並且 EB 症狀在 2 個月內短暫緩解 (NCT02323789)。

除了皮膚和表皮傷口，MSC 外泌體也已應用於其他器官的傷口癒合。特發性黃斑裂孔 (MH) 可導致高度近視眼視網膜脫離 。儘管大多數患者使用通過玻璃體切除術 (PPV) 進行的手術治療來治療這種情況，但那些患有特別大且持續時間長的 MH 的患者在標準 PPV 手術後預後較差。 因此，已經探索了促進 MH 功能和身體恢復的替代或輔助工具。 據報導，七名患者中的六名（兩名接受MSC外泌體治療的患者和五名在手術後通過玻璃體內註射使用臍帶衍生的MSC外泌體治療的患者）顯示出完全的黃斑閉合，而通過最佳矯正視力評估的五名患者顯示出改善的視覺功能。 BCVA) ，臨床研究的主要結果測量 (NCT03437759)。

神經系統疾病

在承認移植細胞難以遷移到現有神經網絡並且其治療效果是由異質 EV 的分泌協調後，幹細胞治療的重點已從直接的細胞間相互作用轉移到旁分泌相互作用 。此外，修飾分子以使它們能夠穿過血腦屏障（BBB）的進展使外泌體成為神經疾病和精神障礙的治療候選者。Alvarex-Erviti 等人開發了載有GAPDH siRNA的神經元靶向外泌體，靜脈注射這些外泌體會導致神經元細胞中的特定基因敲除 。鑑於有證據表明外泌體可以穿過 BBB，Xin 等人通過靜脈內途徑將含有 miR-17-92 的大鼠骨髓來源的 MSC 外泌體施用於中風模型，並顯示出增強少突神經發生、神經發生和神經可塑性以及功能恢復。最近，靜脈內給藥的 MSC 外泌體已被修改以靶向大腦的特定區域。

另一個通往大腦的直接通路是鼻腔，該途徑可用於繞過 BBB 將治療劑輸送到大腦 在毛果芸香鹼(Pilocarpine)誘導的癲癇持續狀態小鼠模型中，MSC 衍生的外泌體經鼻內給藥，據報導在 6 小時內到達海馬體，在那裡它們具有神經保護和抗炎作用。佩雷茨等人，評估了 MSC-外泌體鼻內給藥對 BTBR T+tf/J (BTBR) 小鼠（一種公認的自閉症樣行為模型）的影響，並報告了男性與男性的社會互動增加，重複行為減少和母體行為改善，表明減輕自閉症譜系障礙相關症狀的治療策略。鑑於靜脈內遞送的外泌體可以穿過 BBB，洛杉磯神經病學協會的 Jordan 小組啟動了兩項針對顱面神經痛 (NCT04202783) 和神經退行性疾​​病驅動的抑鬱、焦慮和癡呆 (NCT04202770) 的獨立試驗。

心血管疾病

儘管死亡率在過去 20 年中急劇下降，但心血管和循環系統疾病仍被認為是全球主要的死亡原因 。雖然美國的主要死因是心血管疾病，但在中國，缺血性心髒病是心血管疾病的主要原因，導致死亡率居高不下 。由於缺血性心髒病中的心肌細胞丟失，研究人員將注意力集中在再生醫學對預防心血管疾病的重要性上。MSCs 分化成多種細胞類型的能力導致研究 MSCs 作為心臟組織再生和修復的主要細胞治療劑。

儘管 MSC 幹細胞治療的結果很有希望，但仍不清楚它們是如何工作的。弗雷曼等人在急性心肌梗塞後的豬心臟梗塞區，僅觀察到來自靜脈注射的 50 × 10 6 個移植細胞的 30,000 個細胞，佔0.06% 。蒂默斯等人表明在豬心肌梗塞後 MSC 條件培養基(conditioned medium)處置保留了心臟功能，這表明 MSC 分泌物可能具有血管生成潛力

鑑於分泌性外泌體的功能取決於它們所含的物質，例如細胞因數、蛋白質、mRNA、miRNA 和 rRNA，因此已經進行了研究以確定其參與心臟再生的關鍵因素。安德森等人，鑑定了 MSC 衍生的外泌體中的 1927 種蛋白質並分析了核因數-kappaB；信號傳導作為 MSC 誘導的血管生成的關鍵介質 。在大鼠心肌梗死模型中，發現 MSC 外泌體的心臟保護作用是由 miR-21 介導的，通過 PTEN/Akt 通路增強細胞存活。最近的一項研究報導，含有 miR-25-3p 的 MSC 外泌體通過降低 EZH2、H2K27me3 和 SOCS3 的表達而具有心臟保護作用，通過靶向促凋亡蛋白和炎症基因來減輕心肌梗塞 。根據 MSC 衍生的外泌體促進中風後血管生成重塑和功能恢復的發現，伊斯法罕醫科大學最近的一項臨床研究正在探索使用裝載 miR-124 的 MSC 衍生的外泌體來改善急性中風患者的血管生成（NCT03384433）

癌症

MSC 衍生的外泌體在癌症治療中的應用已經研究了幾年。儘管關於腫瘤進展的功能存在一些爭議，但一些報導顯示MSC EVs在腫瘤轉移中的抑製作用。2014 年，小野等人發現BM-MSC 外泌體可以抑制轉移性癌細胞增殖，從而通過 miR23b 介導的 MARCKS 抑制促進轉移性乳腺癌細胞的休眠 。MSC 外泌體還可以通過鈣/鈣調蛋白依賴性蛋白激酶 (CaM-K) 和 Raf/MEK/ERK 激酶級聯信號介導胃癌細胞耐藥性發展的變化，這將提高化療的效率 。然而，也有研究發現MSC外泌體會加速癌細胞的遷移和癌症相關通路的表達，包括Wnt信號通路。同樣，MSC 外泌體被證明可誘導胃癌細胞中的上皮間質轉化 (EMT)，並通過上調癌症生長和遷移來增強致瘤性 。在促進癌症生長的背景下，它們的血管生成特性也值得關注。因此，MSC 外泌體癌症治療有時被稱為“雙刃劍”。為了克服這一點，研究人員專注於 MSC 外泌體的貨物功能。例如，用紫杉醇（紫杉醇；PTX）處理的 MSCs 衍生的外泌體顯示出改善的腫瘤抑製作用，與紫杉醇單一處理相比，直接抑制腫瘤細胞生長，濃度可降低 1000 倍 。此外，靶向腫瘤相關基因如 polo 樣激酶 1 (PLK-1) 的 siRNA 可以加載到 MSC 衍生的外泌體中用於膀胱內治療。

因此，含有靶向致癌 Kras G12D突變的 siRNA 的 MSC 外泌體正在臨床試驗中用於治療胰腺癌 (NCT03608631)。Kras G12D突變是胰腺癌中常見的突變，是一種很有前景的治療靶點。Kalluri 小組已開發出表達 CD47 和 si- 或 sh-RNA 用於 Kras G12D的工程外泌體 (iExosomes) 。他們證明 iExosomes 抑制致癌 Kras 並提高胰腺癌小鼠模型的存活率。基於這些發現，需要在臨床試驗中評估 iExosomes 在 Kras G12D相關胰腺癌患者中的安全性和可行性。

MSC 外泌體作為 COVID-19 支持性治療

最近，由新型冠狀病毒嚴重急性呼吸系統綜合症冠狀病毒 2 (SARS-CoV-2) 快速廣泛感染引起的 2019 冠狀病毒病 (COVID-19) 已成為對全球公共衛生和世界經濟的最大普遍威脅. 因此，非常需要預防和治療感染的實用方法。與嚴重急性呼吸綜合徵 (SARS-CoV) 和中東呼吸綜合徵 (MERS-CoV) 等其他冠狀病毒類似，SARS-CoV-2 主要針對人類呼吸系統，症狀包括發燒、乾咳、咳痰、疲勞、頭痛, 和呼吸困難。重要的是，與其他冠狀病毒不同，這種病毒會影響下呼吸道，導致肺上葉浸潤和隨後的低氧血症。此外，感染 SARS-CoV-2 的患者偶爾會出現腹瀉作為症狀之一 。SARS-CoV-2 使用其 S 蛋白與宿主肺細胞上存在的血管緊張素轉換酶 2 (ACE2) 受體結合，一旦內化，就會開始自我複制。雖然 CD4 +和 CD8 +分別表達 HLA-DR 和 CD38 的 T 細胞保持啟動狀態，據報導，COVID-19 患者外周血中這些細胞的數量減少了 。SARS-CoV-2 感染會破壞患者免疫系統的功能。失調的免疫效應細胞分泌大量促炎細胞因數（例如，IFN-α、IFN-γ、IL-1β、IL-6、IL-12、IL-18、IL-33、TNF-α、TGFβ）和趨化因數（例如，CCL2、CCL3、CCL5、CXCL8、CXCL9、CXCL10），導致所謂的“細胞因數風暴”。細胞因數分泌增加和隨後被啟動的免疫細胞（如炎性單核細胞和中性粒細胞）浸潤肺組織會引發急性呼吸窘迫綜合徵 (ARDS)，這被廣泛認為是導致 COVID-19 死亡的最關鍵因素之一 ， 因此，迫切需要一種有效的治療方法來預防 COVID-19 誘導的細胞因數風暴。

如上所述，MSCs 或源自 MSCs 的外泌體最突出的特徵是它們的免疫調節能力。MSC 外泌體或 EV 已被用於治療氣道疾病，例如哮喘 、支氣管肺發育不良和ARDS 。MSCs 及其衍生物也被證明可以通過減輕症狀和恢復正常生理功能來有效抑制流感病毒感染。此外，臨床試驗表明，MSC 移植可降低流感病毒引起的肺損傷的嚴重程度並降低死亡率，這表明 MSC 和 MSC EV 在 COVID-19 治療中具有潛在作用。儘管與 MSCs 本身相比，外泌體的生產在技術和經濟上效率低下，但外泌體在治療氣道傳播疾病方面具有優勢，因為與通過靜脈途徑注射的 MSCs 不同，外泌體不會被困在肺部。此外，尺寸約為 100 nm 的外泌體可以通過氣溶膠吸入應用，同時保留其免疫調節功能。由於其獨特的磷脂膜結構，生物活性分子，包括有前途的藥物，可以插入外泌體，通過融合靶細胞膜並將貨物轉移到細胞質中，可以最大限度地發揮其作用。

目前，有四項臨床試驗探索使用 MSC 外泌體作為 COVID-19 感染患者的支持性治療。首例題為“吸入間充質乾細胞外泌體治療重症新型冠狀病毒肺炎的初步臨床研究”旨在探索氣溶膠吸入異基因AT-MSCs衍生的外泌體在重症患者中的治療潛力（NCT04276987）。這種 MSC 外泌體治療的安全性正在另一項臨床研究 (NCT04313647) 中進行評估。由俄羅斯臨床醫生領導的另一項研究正在測試吸入 MSC 衍生的外泌體是否可以抑制免疫系統對病毒的過度反應並刺激再生過程（NCT04491240、NCT04602442）。除了這三項研究之外，使用來自非 MSC 來源的 EV 或外泌體的研究包括供體來源的 COVID-19 特異性 T 細胞 (NCT04389385) 或具有 300 多種來自人類的生長因數、細胞因數和趨化因數的羊膜幹細胞和上皮細胞羊水 (HAF) (NCT04384445) 也在進行中。即使這些正在進行的研究報告了成功的結果，仍然有幾個問題需要解決。值得注意的是，在實際臨床應用之前應解決安全問題，因為據報導 MSC EV 與其來源的細胞一樣具有促凝活性。一項隊列研究表明，重症 COVID-19 患者的症狀之一是高凝狀態; 因此，必須按照血漿交換療法的建議在輸注前去除外泌體貨物中的促凝血因數和過多的促炎細胞因數。此外，為了加快和鞏固臨床前進程，需要完善的疾病模型（例如非人類靈長類動物模型）來評估新療法和潛在疫苗的安全性和有效性。

未來展望

本文根據疾病類型全面回顧了MSC外泌體的治療特點和臨床試驗現狀。儘管臨床前研究報告了許多有希望的結果，但需要對 MSC 外泌體治療進行一些改進才能獲得更好的結果。首先，應在外泌體分離之前評估 MSCs 對特定疾病的適用性。間質乾細胞的基因修飾可以改善來自這些間質乾細胞的外泌體的治療功能。基因改造的主要目標之一可能是 miRNA。miR-143 的過表達提高了 MSC 外泌體對癌細胞遷移和侵襲的抑制功能。除了上面討論的 miRNA 之外，還有許多其他 miRNA 是外泌體遺傳操作的潛在目標。CXCR4 和 GATA-4等具有特定治療作用的蛋白質的過度表達也已被證明可以改善 MSC 外泌體的功能。因此，在對 MSCs 進行基因操作之前，重要的是要確定可以在外泌體中操作以治療特定疾病的精確基因靶點。

其次，通過將靶分子直接遞送到MSC外泌體中來增強MSC外泌體的治療效果。已經開發了多種插入方法，包括被動加載、超聲處理、電穿孔、擠壓和光誘導加載 。正如我們上面所討論的，抗癌藥物已被加載到外泌體中以獲得更好的臨床結果。經研究報導，薑黃素是一種有效的免疫抑製劑，通過將其包裹在外泌體中來提高其抗炎活性。另一種抗炎藥，即 STAT3 抑製劑 JSI124，當通過鼻內途徑以外泌體的形式引入時，可有效抑制神經炎症。除了外泌體介導的藥物遞送，長內源性 RNA 或小幹擾性 RNA 的加載和遞送已被證明可以抑制癌症並導致白血病細胞凋亡。支援材料可用於最大限度地發揮 MSC 外泌體的治療功能。在生物相容性助劑中，各種水凝膠最近引起了人們的關注。在缺血性實驗模型中，含有殼聚醣水凝膠的胎盤衍生的 MSC 外泌體顯示出增強的治療效果，具有體內保留和外泌體內容物（包括蛋白質和 miRNA）的穩定性 。其他水凝膠已被證明可以通過補充物理缺陷來加強傷口修復過程。在類似的情況下，用 MSC 外泌體和支架包裝組織比在骨或子宮內膜再生模型中的初始治療產生更好的結果。此外，用脂多醣等細菌物質預處理 MSCs 可用於開發適用於解決慢性炎症的疾病或類型特異性外泌體。最後，可以與肝細胞受體結合的支鏈澱粉的表面修飾被證明可以通過改善其對受損器官的靶向性來增強 MSC 外泌體的治療效果。

為了使基於外泌體的療法在臨床應用中安全且成功，必須探索所施用的外泌體的生物分佈。目前，有各種研究來評估從不同來源獲得併在不同疾病模型中治療的外泌體的生物分佈。在患有急性腎損傷的小鼠中，5 小時後從損傷部位檢測到靜脈內遞送的 MSC 外泌體，24 小時後檢測不到 。在荷瘤小鼠中，腹腔注射後 24 小時和 48 小時，外泌體在腫瘤區域的積累顯著增加。一般來說，已知靜脈內遞送的外泌體主要在肝臟和脾臟中積累，但是，根據細胞來源和給藥途徑，生物分佈模式可能不同 。在使用外泌體設計治療策略時，必須先仔細考慮 MSC 來源、給藥途徑和生物分佈。

總之，成功的 MSC 外泌體治療各種罕見疾病需要疾病和/或患者定制治療。為此，需要詳細識別每種目標疾病的特徵和發病機制，選擇可行的外泌體貨物，確定調節所選因素的方法，以及改進對病變的遞送。

參考資料: Therapeutic Features and Updated Clinical Trials of Mesenchymal Stem Cell (MSC)-Derived Exosomes

幹細胞移植後復發，癌症晚期患者最終靠CAR-NK療法完全緩解。

要不是患了癌症，JC Cox大概一輩子都不知道自己居然如此有毅力，他居然能在十幾年裡接受了十幾種不同的癌症治療。 他的噩夢最初出現在2006年，作為空調和供暖技術員的他往常都從事長時間的工作，然而在這一年他開始失去動力，下班回家後不吃晚飯只想立即上床睡覺。他痛苦地回憶道：“哪怕是到了早上，我還是很累！” 但是勤奮的JC Cox堅持不懈，直到有一天，他幾乎無法呼吸，不得已他拉響警報前往急診室就醫。 在醫院，醫生發現JC Cox的胸腔中積聚了淋巴液，並且溢出到他的一側肺部，導致其塌陷，在抽取5加侖多餘的液體後，連同他來自腫脹淋巴結的組織一起送到實驗室進行分析。當結果出來時，他驚呆了！濾泡性淋巴瘤！ 這是非霍奇金氏淋巴瘤的一種，是B細胞淋巴瘤中較常見的類型，最常見表現是無痛性淋巴結腫大，典型表現是多部位淋巴組織侵犯。“我以為我感染了病毒，”現年66歲的JC Cox憂愁地說道：“我從未想過會得癌症。” 得知消息後，JC Cox和他的妻子凱西發誓要與癌症搏鬥！“我們絕不會退縮，”凱西說。“我們準備不惜一切代價。” JC Cox的治療開始於6個週期的化療，這讓他緩解了13個月，但是癌症又復發了。然後他又忍受了三輪大劑量化療，這不僅消滅了他的癌細胞，還損傷了他許多健康血細胞，使其更加容易感染病毒和細菌。為了補充因化療而破壞的健康細胞，他接受了幹細胞移植。從其骨髓中收集後來發育成健康血細胞的未成熟細胞並注入他的血液中。治療持續了四個月，但癌症又復發了。來回反復的治療，讓JC Cox的信心一點點消磨，他覺得天快塌了！

疾病轉化為彌漫性大B細胞淋巴瘤，但錯過了CAR-T治療，最終遇到CAR-NK

在沒有其他治療選擇的情況下，JC Cox的醫生給他推薦了一種名為ipilimumab 的免疫治療藥物的臨床試驗 ，商品名為Yervoy。該藥物能夠訓練免疫系統發現並攻擊癌細胞。但在一些患者中，這種藥物也會攻擊健康細胞，造成嚴重的副作用。 這正是發生在JC身上的事情。他發高燒，陷入昏迷，最終接受了生命支持。“他終於康復了，我們松了一口氣，”凱西回憶道。“但我丈夫迫切需要更好的治療選擇。” 糟糕的是，2017年，JC 的濾泡性淋巴瘤轉化為彌漫性大B細胞淋巴瘤，這是一種更具侵襲性的疾病。他忍受了幾次積極的化療，但一次只能緩解癌症幾周。他深知這是一場癌症和自己的比賽，而癌症正在獲勝。

那時，JC 正在等待一項名為嵌合抗原受體 (CAR) T細胞療法的開創性癌症新療法的臨床試驗。作為一種“活的”藥物，CAR-T療法與傳統藥物有著很大的區別。它是一種治療腫瘤的新型精准靶向療法。通過基因工程技術將T細胞啟動，並裝上定位導航裝置CAR（腫瘤嵌合抗原受體），將T細胞這個普通“戰士”改造成“超級戰士”，即CAR-T細胞，專門識別體內腫瘤細胞，並高效殺滅腫瘤細胞，從而達到治療惡性腫瘤的目的。與傳統的化療和造血幹細胞移植相比，它對腫瘤細胞的殺傷更為精准，在提高療效的同時大幅減輕了毒副作用。相關文章：CAR-T療法進入井噴期！盤點2022年11大實體瘤“明星靶點”，癌症患者關注的都在這！

但當時CAR-T細胞療法獲得了美國食品和藥物管理局 (FDA) 的批准，而 JC仍在等待名單上。這意味著臨床試驗不再需要接受新患者，JC錯過了採用CAR-T療法治療的機會！ 那真是一個糟糕的時機，JC再次陷入治療困境。

天無絕人之路，CAR-NK療法最終讓他完全緩解！戰勝了癌症！

這時一項新的臨床試驗CAR-NK療法正在啟動，與最近批准的CAR-T細胞療法類似，新的臨床試驗將CAR添加到自然殺傷細胞（NK細胞）中。這些抗癌細胞不負眾望，潛伏在體內，率先對受損或受壓的組織做出反應。它們能夠識別和殺死癌細胞。 “NK細胞非常擅長及早識別癌細胞並摧毀它們，但癌症可以發展出躲避免疫系統的方法，” 醫學博士Katy Rezvani說道，“給NK細胞裝上“彈頭”CAR，使之成為CAR-NK細胞，能夠擴展其先天的抗癌能力。” 一個供體可以製造多劑量的CAR-NK細胞，然後這些細胞可以用於治療多個患者。 由於其獨特的特性，CAR-NK細胞有可能提前製造、冷凍和儲存，並立即提供給任何有需要的患者。

天時地利人和，JC最終參加了這項臨床試驗，成為世界上第8位接受CAR-NK細胞治療的幸運兒。2018年4月，僅僅30天后，在分析他的後續掃描時，醫生告訴他已經沒有癌症了。JC參與的臨床試驗結果於2020年2月發表在《新英格蘭醫學雜誌》上。Rezvani和她的團隊在臨床試驗中用CAR-NK細胞治療了11名患者。包括JC在內的7名患者實現了完全緩解，這意味著癌症的所有體征和症狀都消失了，1名患者為部分緩解。

“雖然這是一項小型研究，而且我們的隨訪時間相對較短，但我們對有希望的結果感到非常滿意，”Rezvani 說。“我們將繼續在更廣泛的臨床試驗中研究 CAR-NK細胞，我們希望這將成為許多有需要的患者的新治療選擇。” 該療法沒有引起明顯的副作用 ——這也是CAR-NK療法的另一個治療優勢。 “從我的治療中效果是驚人的，”JC說。“就像我從來沒有生過病一樣。”

給NK細胞裝上“彈頭”，CAR-NK殺傷力倍增

上述抗癌故事中，JC Cox最後抗癌成功所採用的療法就是CAR-NK療法。

CAR-NK是利用基因工程給NK細胞加入一個能識別腫瘤細胞，並且同時啟動NK細胞殺死腫瘤細胞的嵌合抗體。嵌合抗原受體能顯著提高NK細胞療效特異性。這個思路和CAR-T的構建類似：CAR包括胞外的識別結構域（如scFv）識別腫瘤特異性抗原；一個跨膜結構域，和一個胞內信號結構域（CD3ζ 鏈）可以誘導NK細胞的活化。

圖為構建CAR-NK細胞免疫療法的過程

CAR-NK細胞比CAR-T細胞具有多個優勢

0 1

與CAR-T細胞不同，CAR-NK細胞保留了通過其天然受體識別和靶向腫瘤細胞的內在能力，從而通過CAR-NK靶向治療時，腫瘤細胞能夠逃脫殺傷的可能性降低。

0 2

CAR-NK細胞在數天至數周內不會發生免疫排斥反應。因此，它們在許多CAR-T臨床試驗中均未表現出相同的安全問題，例如沒有細胞因數釋放綜合征的困擾。

0 3

NK細胞不需要嚴格的HLA匹配，並且沒有引起移植物抗宿主病的潛力，這卻是CAR-T細胞免疫療法一種重要的風險。

有效率73%！CD19 CAR-NK對白血病和淋巴瘤效果顯著

上述抗癌故事的主人公JC Cox所參加的試驗結果曾發表在《新英格蘭醫學雜誌》上。在參與該研究的11名患者中，有8名（73％）對治療有反應，其中7名達到了完全緩解！5名有反應的患者繼續接受緩解後治療。沒有患者出現細胞因數釋放綜合征或神經毒性。這意味著他們在中位隨訪13.8個月時無疾病跡象。

CD19 CAR-NK細胞療法起效快，輸注後1個月內就有明顯反應，並且輸注後1年這些細胞依然持續存在。MD安德森幹細胞移植與細胞療法教授凱蒂·雷茲瓦尼博士表示：“這項臨床試驗的結果喜人，接下來將開展進一步的臨床研究，探索同種異體臍血來源的CAR-NK細胞療法的安全性和有效性。”

這是一種新型的療法，首先需要從臍帶血庫中存儲的臍帶血中分離出NK細胞，並對它們進行基因工程改造，引入可識別癌細胞表面靶標的CAR。這些CAR NK細胞回輸給患者。與CAR-T療法相比，其最大的優勢在於不會引起移植物抗宿主病（GVHD），這是一種在CAR-T療法中常見的由供體T細胞攻擊受體中的健康細胞引起的破壞性疾病。由於NK細胞不會引起GVHD，因此可以將它們從供體提供給接受者，而無需進行匹配。這意味著您可以從一個供體中製備多個劑量的CAR NK細胞來治療多個患者， 從診斷到癌症治療的時間大大縮短。

圖為患者的治療情況（圖片來自NEJM）

大放異彩，CAR-NK療法在實體瘤中的成就不容小覷

1 創新CAR-NK療法FT536獲FDA批准用於臨床試驗

2022年1月10日，Fate Therapeutics公司宣佈，美國FDA已批准FT536的新藥臨床研究（IND）申請。  FT536是一款經過多重工程修飾、誘導多能幹細胞（iPSC）衍生的  “即用型”嵌合抗原受體（CAR）自然殺傷（NK）細胞療法。

FT536表達一種特異性靶向I類主要組織相容性複合體（MHC）相關蛋白A和B（MICA/MICB）α3結構域的新型CAR。 MICA和MICB屬於應激蛋白，在許多實體瘤上高水準表達。癌細胞經常通過MICA/B的α1和α2結構域的蛋白水解脫落來逃逸免疫細胞識別。此前有研究發現，靶向MICA/B的α3結構域的抗體能夠特異性地阻止MICA/B脫落，恢復NK細胞介導的免疫力。

此次FT536獲批臨床應用，表明MICA和MICB正在成為廣泛的實體瘤中令人興奮的癌症免疫療法靶標，而FT536也代表了一種靶向這些應激誘導配體的新型治療策略。關於此款療法的多中心I期臨床試驗開展的腫瘤類型包括：晚期非小細胞肺癌、結直腸癌、頭頸癌、胃癌、乳腺癌、卵巢癌和胰腺癌。

2 “現貨型”CAR-NK療法向“癌王”胰腺癌發起進攻

2022年1月6日，在國際胃腸病領域權威雜誌《Gastroenterology》刊登了希望之城國家醫學中心和細胞療法創新公司CytoImmune Therapeutics合作開發的重磅研究，研究結果顯示，以前列腺幹細胞抗原（PSCA）為靶點的“現成”的CAR-NK療法能夠顯著抑制胰腺癌。

近年來，隨著醫學臨床研究的深入，人們發現大約60%~80%的胰腺癌表達前列腺幹細胞抗原（PSCA），除了胰腺癌，胃癌和前列腺癌等實體腫瘤同樣高表達前列腺幹細胞抗原（PSCA）。為了尋找更有效和創新的實體瘤治療方法，CytoImmune與City of Hope合作開發了一種針對PSCA的嵌合抗原受體（CAR），用於轉導到人類自然殺傷 （NK）細胞中。研究團隊選擇了構建PSCA-CAR，此外還敲入了分泌性IL-15，維持NK細胞的存活。

CYTO NK-203試驗流程

這款被稱為CYTO NK-203的治療方法，是一種現成的同種異體 CAR-NK 細胞療法，源自臍帶血，並具有提高 NK 細胞安全性和殺傷功效的一種潛在的療法。CYTO NK-203在人類轉移性胰腺癌小鼠模型中效果顯著，在小鼠體內持續存活超過90天，顯著延長其壽命，且未顯示出治療相關毒性，這項臨床前研究支持該療法在今年進入人體臨床試驗。

研究團隊認為這種CAR-NK療法對胰腺癌治療充滿希望，原因有兩個：首先，該療法基於精准醫學方法，靶向胰腺癌患者的特殊靶點——PSCA；這是一種免疫療法，使用工程化的人類自然殺傷細胞，被改造為專門攻擊癌細胞。此外，由於前列腺幹細胞抗原（PSCA）在胃癌、前列腺癌中也同樣高表達，因為這款CAR-NK細胞療法同樣對胃癌和前列腺癌的治療充滿希望。

3 首個“現貨型”CAR-NK臨床試驗獲藥監局批准

2021年11月11日，中國國家藥監局藥品審評中心通過了一款自主研發的針對“ 晚期上皮性卵巢癌治療的靶向間皮素（Mesothelin，MSLN）嵌合抗原受體NK細胞（CAR-NK）注射液”（簡稱：CAR-NK注射液）的臨床試驗申請。據無癌家園獲悉，此款產品是國內首例“現貨型”異體來源的CAR-NK產品。這也標誌著中國的免疫細胞藥物治療實體瘤的研究邁入了新的里程碑！

卵巢癌為婦科第二大腫瘤，有70%的卵巢癌患者被診斷時已是晚期。在過去的10年間，我國卵巢癌發病年齡越來越年輕，發病率增長30%，死亡率增加18%。其在婦科惡性腫瘤中5年生存率最低，僅為39%，5年復發率最高，達到70%。

儘管卵巢癌腫瘤細胞減滅術及以鉑類為基礎的術後化療延長了患者生存期，但約60%患者接受一線化療方案後會復發。目前除了PARP抑制劑能夠滿足30%~40%有基因突變的患者外，目前臨床上沒有更好的藥物及療法來滿足臨床需求。此款CAR-NK療法的研發有利於提高卵巢癌的治療效果和改善患者生活品質。而且“現貨型”的產品可進行標準化批量生產，從而擴大治療機會，減少治療成本，臨床普及性較高。

4 1年生存率翻一倍，CAR-NK療法在實體瘤中療效暴增

近期，《臨床腫瘤研究》雜誌發佈了一項針對肺癌的2期臨床試驗。熱休克蛋白70（Hsp70）在70%左右的中晚期肺癌中高表達，NK細胞在體外先用Hsp70啟動，相當於在體外先讓NK細胞與未來的敵人先遭遇、先“結仇”，然後回輸給病人，讓NK細胞在體內正式與癌細胞殊死搏鬥——這樣一種在體外先用抗原肽刺激、賦予NK細胞一定特異性的作法，是近年來研究的熱點。這項臨床試驗一共入組了16例III期非小細胞肺癌患者，一組接受傳統的放化療綜合治療，一組接受放化療聯合Hsp70預激的NK細胞回輸治療。

結果顯示：Hsp70預激的NK細胞回輸治療，配合傳統的放化療，可以將1年的生存率從33%翻倍到67%，初步結果振奮人心。

接下來，小編展示聯合療法中一個典型的成功案例，如圖所示：治療1~2個月後複查，肺部腫瘤完全消失，並且療效已經保持了18個月。

5採用靶向NKG2D的CAR-NK細胞治療結直腸癌，安全且可行！

在2020年一篇廣州醫科大學的碩士學位論文中，中國研究學者採用靶向NKG2D的CAR-NK細胞治療結直腸癌患者，其初步療效值得肯定，且具有安全性。研究中，採用局部輸注 NKG2Dp CAR-NK的方式治療了3 例轉移性結直腸癌患者。前兩例患者腹腔輸注低劑量 CAR-NK 細胞後，可觀察看腹水生成量減慢以及腹水樣本中腫瘤細胞的數量急劇減少。第三例肝轉移瘤患者採用超聲引導下瘤內經皮注射和腹腔內灌注方式輸注 CAR-NK細胞後，多普勒超聲可見肝部腫瘤快速縮小，正電子發射斷層掃描（PET-CT）提示經治療的肝病灶為完全代謝反應。3 例患者在治療過程中均無出現3級或以上的不良事件。

CAR-NK 細胞治療後肝轉移病灶 PEC-CT 結果對比圖

（患者肝Ⅵ段的最大氟去氧葡萄糖（FDG）攝取值從 8.2 降至 0.14，經評估為完全代謝緩解）

本項研究結果初步顯示 NKG2D mRNA CAR-NK細胞局部輸注治療轉移性結直腸癌患者具有安全性和可行性，為腫瘤免疫治療提供了一種新的策略。

除了上述提到的國內外臨床研究外，CAR-NK細胞還對膠質母細胞瘤和神經母細胞瘤、肝癌等的療效頗佳，特異性識別和高效殺傷乳腺癌腫瘤細胞，對多發性骨髓瘤療效顯著。

NK細胞治療臨床研究進行中

CAR-NK細胞療法是一個很有前途的臨床研究領域，對某些癌症患者具有良好的安全性和初步療效。與CAR-T細胞相比，CAR-NK細胞具有自己獨特的優點，但仍面臨著一些挑戰。這些挑戰包括細胞增殖的改善，使細胞毒性的啟動更有效，以及最終找到NK細胞的最佳重建方法。相信解決好這些問題，基於NK細胞優秀的抗腫瘤血統，極有可能在CAR修飾的武裝下為腫瘤治療帶來新的突破。鑒於CAR-T的成功、CAR-NK的快速發展，將CAR工程技術沿襲用

於其他類型免疫細胞的工程化改造引起了研究者們極大的興趣。根據這種基因工程技術，CAR-NKT、CAR-巨噬細胞（CAR-M）、CAR-Treg、CAR-γδT等異軍突起，在腫瘤的免疫治療中展現出廣闊的前景。在未來將會有越來越多的細胞免疫技術和藥物聯合使用的試驗不斷湧現，只要不放棄任何一點希望，攻克癌症指日可待！

相關文章：客觀緩解率高達100%！CAR-NK細胞療法崛起，有望對多種血液腫瘤及實體瘤實現精准打擊！

參考文獻

https://www.mdanderson.org/newsroom/cd19-car-nk-cell-therapy-achieves-73-percent-response-rate-in-patients-with-leukemia-and-lymphoma.h00-159379578.html

NK細胞抗衰有奇效！輸注後，顯著降低血液中衰老標記

NK細胞免疫細胞療法，可以防癌抗癌，抗衰保健、改善亞健康人群的疲勞及睡眠障礙等症狀，提高其生活品質。該方法臨床應用效果確切，實施簡便，無毒副作用，易於接受，幫助亞健康人群儘早恢復健康，避免發展為嚴重疾病。衰老（Aging）是幾乎所有重大慢性疾病的最大危險因素，包括心血管疾病、癌症、阿爾茨海默病等老年神經退行性疾病。 其中，與年齡有關的免疫功能損害(免疫衰老)是與年齡有關的發病率和死亡率的一個重要原因，它可能超出其在傳染病中的作用。例如慢性炎症（chronic inflammation）和免疫衰老（immunosenescence）已被證明是有害的。 一項關於衰老的研究表明，NK細胞是衰老細胞免疫監測的核心參與者，隨著年齡的增長，NK細胞功能障礙與感染、惡性腫瘤、炎症性疾病和衰老細胞的負擔增加有關。自然殺傷細胞（Natural killer cell，NK）是主要的先天淋巴細胞亞群，可以介導多種免疫反應，包括免疫監視和清除衰老細胞。 一項新研究NK免疫細胞對抗衰老有奇效。

近期，國際期刊《Biochemistry and Biophysics Reports》中的一篇研究論文Autologous NK cells propagated and activated ex vivo decrease senescence markers in human PBMCs，發現 經擴增培養的自體NK細胞，除了表現出很強的殺腫瘤細胞和清除衰老細胞的能力，而且在回輸後降低了血液中PBMC的衰老標記物。 在此項臨床研究中，共有5志願者參加，分成兩組 ： 一組三人接受10億NK回輸，分別為41歲、50歲和70歲的男性；一組兩人接受20億NK回輸，分別為50歲的女性和52歲的男性。 研究結果表明：在輸注NK細胞後，5名志願者的p16和β-gal水準都有不同程度的下降。在所有志願者中，均未發現不良反應。 儘管，只有少數志願者參與， 但這項但這項研究表明一次或兩次輸注NK是安全的，會在長達6個月的時間內抑制免疫衰退。NK細胞可以改善慢性炎症，並有延緩免疫衰老的作用。在另一項關於《自體細胞免疫治療對亞健康人群疲勞及細胞免疫功能的效果研究》發現： 運用自身的細胞進行免疫細胞保健，可提高患者免疫功能，整體改善患者機體平衡，從而達到改善和預防亞健康的目的。 研究發現亞健康人群的細胞免疫功能低下，尤其是Ｔ細胞亞群狀態異常和比例失調，如外周CD3+、CD4+細胞明顯減少，CD4+／CD8+比例倒置等。 在相關臨床研究中，根據納入標準確定了受試的物件，採用自體細胞免疫療法對亞健康人群，進行每月1週期，共治療4週期。並分別於研究前、2週期後、4週期後及6個月時進行疲勞自評量表、睡眠品質評定量表、簡明生活品質量表問卷調查及免疫功能檢查；統計治療前後患者疲勞、睡眠品質及生活品質及細胞免疫功能，探討自體NK免疫細胞對亞健康人群的干預作用。 2個月開始有症狀改善4個月至半年效果更顯著。

疲勞程度

亞健康患者經自體NK免疫細胞療法後，疲勞評定量表積分均有所下降，4週期及6個月後，比較差異有統計學意義（P＜0.05）

睡眠品質

亞健康患者經自體NK免疫療法後睡眠品質表積分均有所提高，4週期及6個月後，比較差異有統計學意義（P＜0.05）

生活品質

亞健康患者經自體NK免疫細胞療法後，生活品質積分均有所提高，免疫療法2、4週期後及6個月後，比較差異有統計學意義（P＜0.05）

本項研究顯示：亞健康患者CD3+、CD4+、及CD4+／CD8+ 均偏低，經自體免疫細胞療法後，各指標均上升，顯示出免疫力增強

所有研究物件分別在自體細胞療法前、2週期、4週期和6個月後抽取血標本檢測細胞免疫功能並進行MDI健康評估量表調查 患者通過免疫細胞療法後疲勞分值明顯改善，並且隨著週期的增多疲勞改善的程度也進一步好轉，6個月時與治療4週期時基本相似，說明：免疫細胞可很好的改善機體疲勞，提高生活品質，作用可持續較長時間。 因此，NK細胞免疫細胞療法，可以防癌抗癌，抗衰保健、改善亞健康人群的疲勞及睡眠障礙等症狀，提高其生活品質。該方法臨床應用效果確切，實施簡便，無毒副作用，易於接受，幫助亞健康人群儘早恢復健康，避免發展為嚴重疾病。

1423人參試臨床表明：NK細胞在腫瘤微小病灶治療以及防復發、轉移中發揮關鍵作用

隨著腫瘤免疫研究的進展,今後將會有越來越多利用免疫機制的治療藥物和方法進入臨床, 造福腫瘤病人。NK 細胞作為可以直接殺傷癌細胞的免疫細胞,如何在腫瘤綜合治療中發揮作用,特別是對腫瘤微小病變,以及腫瘤復發/ 轉移中發揮功效,有待深入臨床研究。

義大利國家腫瘤研究所Demichi博士回顧分析了1173名接受了手術治療的乳腺癌病人和250名非手術乳腺癌病人的生存時間，發現手術病人有兩個死亡高峰，分別出現在第3年和第8年，而非手術病人只有一個死亡高峰出現在第4年。因此，部分病人甚至可能因為手術而加速腫瘤的復發和轉移，導致病人生存時間縮短。動物研究表明，手術促進癌細胞轉移，降低生存率，其原因部分與手術本身有關。近年研究表明，免疫細胞功能障礙與手術後復發轉移密切相關。 NK細胞作為先天性免疫細胞，在外傷、手術以及危重狀態時會出現嚴重的功能障礙。NK細胞功能障礙的程度和時間與損傷強度有關。 NK細胞功能障礙可以是一過性的，但其生物學影響則可能長期持續，包括對感染和損傷修復的影響。 研究表明，手術切除實體瘤可能增加腫瘤復發、轉移甚至死亡風險。早在1913年就已觀察到腫瘤手術切除與轉移的關係，但是直到近年的研究才發現細胞免疫功能障礙在其中所扮演的角色。特別是圍手術期NK細胞功能障礙與腫瘤手術後的復發和轉移密切相關。

研究證實，NK細胞功能在手術後第1天已經降低，並與腫瘤的轉移程度相關。 腫瘤病人復發率也與術後NK細胞功能障礙程度密切相關。因此，在圍手術期使用增強免疫功能的細胞因數，如IL-2、GM-CSF、TNFa、IFNα等可以降低手術後腫瘤的復發和轉移。鑒於這些細胞因數都有增強NK細胞活性的功能，進一步驗證了NK細胞在防禦腫瘤手術後復發和轉移中的作用。 手術後NK細胞功能障礙的機制複雜，涉及手術後血液高凝狀態，釋放抗炎性反應因數和免疫抑制性細胞增加等。對這些機制的深入研究，將有利於開發腫瘤圍手術期免疫治療的新方法，降低腫瘤手術後的轉移和復發，提高腫瘤病人治療效果和預後。 總之，鑒於腫瘤病因/ 病理機制的複雜性,使任何單一腫瘤治療方法都有其局限性。因此,需要揚長避短, 綜合治療。手術是實體瘤的重要治療方法,特別是 對減輕腫瘤負荷具有非常重要的作用。 但是,手術本身以及其對機體免疫功能的影響,又可能引起和促進腫瘤的復發和轉移。特別是圍手術期 NK 細胞功能障礙與術後腫瘤復發/ 轉移密切相關,因此,儘量減少手術對機體免疫功能的影 響,以及術後儘早提高和恢復免疫功能,包括開展 NK 細胞等免疫細胞治療,對於預防和控制復發/ 轉移,提高治療效果具有積極意義。

NK細胞抗腫瘤的主要原理穿孔素：
⑴ 穿孔素是一種由NK、CTL、LAK等殺傷細胞胞漿顆粒釋放的殺傷靶細胞的介質，從胞漿顆粒中純化的穿孔素在體外能溶解多種腫瘤細胞。
⑵ NK細胞毒因數： NK細胞可釋放可溶性NK細胞毒因數，靶細胞表面有NKCF受體，NKCF與靶細胞結合後可選擇性殺傷和裂解靶細胞。
⑶ TNF： 活化的NK細胞可釋放TNF-α和TNF-β（LT）， TNF引起細胞死亡過程要明顯慢於穿孔素溶解細胞的作用過程，但這也足以證明它可以攻擊癌細胞。
4、ADCC：

表達IgGFc受體的NK細胞、巨噬細胞和中性粒細胞等，通過與已結合在病毒感染細胞和腫瘤細胞等靶細胞表面的IgG抗體的Fc段結合，而殺傷這些靶細胞的作用。
5、分泌細胞因數：

活化的NK細胞可合成和分泌多種細胞因數，發揮調節免疫和造血作用以及直接殺傷靶細胞的作用。
NK細胞抗腫瘤應用案例
1.緩解率75%，針對EGFR突變的肺癌效果顯著 EGFR突變的肺腺癌患者，往往對化療反應不佳，導致預後不良。而在東亞人中，超過40%的肺腺癌患者具有EGFR突變。目前，靶向治療成為EGFR突變肺癌重要的一線治療方案，如何防止耐藥，提升療效成為研究的方向。 一項發表在《 Precis Clin Med 》上的臨床研究，調查了NK細胞聯合靶向藥治療對有/沒有EGFR突變晚期肺腺癌的有效性，以評估反應率和無進展生存期（PFS）。

結果表明，NK細胞聯合第二代靶向藥阿法替尼顯著提升治療效果，緩解率從16.7%提升到75%，中位PFS從6個月提升到9個月。值得注意的是，該研究納入的EGFR陽性患者之前已使用第一代靶向藥吉非替尼治療，且均已耐藥。NK細胞療法在EGFR突變患者上效果如此顯著，研究人員認為EGFR突變的腫瘤細胞大量增殖，刺激了NK細胞的超活躍狀態，從而可能逆轉了靶向藥物的耐藥性，增加了靶向藥物的敏感性。
2.針對HER2陽性實體瘤的臨床觀察
靶向HER2與化療聯合被認為是治療過度表達HER2的晚期乳腺癌和胃癌的標準護理。近年來已有抗HER2藥物獲得批准，如曲妥珠單抗。雖然曲妥珠單抗治療取得了顯著進展，但同樣面臨耐藥的問題，因此需要尋求增強當前的治療方法。 一項發表在《Clinical Cancer Research》上的研究，NK細胞聯合曲妥珠單抗治療難治性HER2陽性患者，以增強曲妥珠單抗的療效。該研究分Ⅰ期和Ⅰb期進行。

在I期研究中，22名患者中有12人疾病穩定（SD）；其中7名受試者的SD持續到第4週期。 在Ⅰb期研究中，9名患者中有5名達到SD，而佇列B中的1名受試者有PR。 達到PR的是一名55歲女性，患有轉移性激素受體陽性、HER2陽性轉移性乳腺癌，之前曾接受過多種化療、抗HER2和激素治療。她在連續2個週期的NK細胞輸注後達到PR，並在第8週期NK細胞治療後保持PR。

臨床研究總反應及PR患者CT圖像 研究結果表明，NK細胞療法與曲妥珠單抗聯合治療難治性HER2陽性患者是安全的，並且在約四分之一的患者中實現疾病穩定。

3.NK細胞直面肝癌，控制率高達71.4% 目前肝癌的主要治療手段為手術切除，由於患者確診時大多已處於中晚期，預後較差，有時會採用放射治療和介入治療。對部分不適合手術的患者，只能採用保守治療，效果並不理想。 據研究發現， 在原發性肝癌組織中，NK細胞數量明顯比其它正常組織中要低，且NK細胞的活性顯著降低，而體外培養的NK細胞對肝癌細胞表現出明顯的殺傷作用。 因此，NK細胞免疫療法在治療肝癌擁有潛在應用價值。 發表在《 Journal of Modern Oncology 》雜誌上的一項前瞻性研究中，中國研究團隊對2016 年2月~2017年9月收治的17例肝癌患者進行了NK細胞免疫治療，向患者體內注射了在體外增殖的高活性NK細胞，並對患者病情進行了追蹤觀察和檢測。

研究結果表明， 在經過NK細胞治療後，所有患者的客觀緩解率為14.3%，疾病控制率達71.4%。 並且從療效來看，接受療程多的患者療效優於接受療程數少的患者。在治療前後，患者均無不良反應出現，充分說明NK細胞治療的安全性和有效性。NK 細胞具有獨特的抗腫瘤效應，不受MHC限制的細胞毒性、產生細胞因數和免疫記憶等功能，使其成為先天性和適應性免疫反應系統中的關鍵角色。這也就不奇怪為什麼防癌、抗癌、提高免疫力乃至於抗衰老都有NK細胞的身影了，體內的每一個NK細胞都是一個頑強的戰士他們是先天性免疫系統的組成部分，為身體免疫系統的第一道防線。諸多臨床研究表明，在多種腫瘤微環境中如黑色素瘤、神經母細胞瘤、肝細胞癌、腎細胞癌、胃癌、乳腺癌、肺腺癌、肺鱗癌以及非小細胞肺癌等，NK的浸潤與患者更好的總生存率有關。

臍帶血來源免疫細胞療法，穩定且有效的抗癌手段，79%患者實現客觀緩解！

未來免疫細胞的用途越來越廣，健康的免疫細胞是培養擴增的必須條件，因此來源上不斷擴寬，不局限于外周血，臍帶血中同樣含有豐富的免疫細胞。

免疫細胞治療技術發展日新月異，如CAR-T等，有望給腫瘤治療帶來全新的變革。但是，免疫細胞治療技術需要一個基礎——健康的免疫細胞。然而，在治療過程中，部分患者外周血幾乎全是腫瘤細胞，一些久病體虛和經不起反復采血的老年患者，無法從外周血採集到足夠數量的健康免疫細胞。 臍帶血是不錯的免疫細胞來源。臍帶血不僅富含造血幹細胞、間充質幹細胞，還含有豐富的免疫細胞，如T細胞、NK細胞、樹突狀細胞等。臍帶血中的免疫細胞既具有高度的多樣性，也有極強的擴增能力。因此，臍帶血可以作為提取 T 細胞、NK 細胞、樹突狀細胞的資源平臺，用於體外擴增或基因修飾，從而改善細胞免疫療法。

臍帶血CIK細胞增殖速度更快

臍帶血的T細胞與外周血不同，具有更強的抗腫瘤作用、更弱的移植物抗宿主病（GVHD）作用。這主要得益於臍帶血T細胞的活化差異，即腫瘤部位高活化，其他部位低活化。外周血來源的CIK以誘導腫瘤細胞的凋亡為主；而臍帶血來源的CIK則以誘導腫瘤細胞壞死為主。此外，臍帶血來源的CIK相對來說，免疫原性較弱、增殖速度更快、存活時間更長、回輸後移植物抗宿主病（GVHD）發生率更低等特點。

採用流式細胞術對比觀察來自外周血和臍帶血的CIK的表型特徵及其與抗腫瘤活性的關係，發現兩種不同來源的CIK生物學活性存在較大差異，臍帶血來源的CIK體外誘導培養13天后具有較低的免疫原性和較高的增殖率，其中含抗腫瘤活性的CD3+CD56+細胞的百分率較高。裸鼠異種移植模型試驗顯示，臍帶血來源的CIK能顯著抑制體內腫瘤細胞的生長，具有明顯的殺瘤活性，說明無論是體內試驗還是體外試驗，臍帶血來源的CIK均較外周血來源的CIK具有更高的抗腫瘤活性。

臍帶血CIK細胞治療，客觀緩解率提升1倍

通過回顧性的臨床試驗觀察15例接受臍帶血來源CIK治療惡性腫瘤的療效、安全性及體外殺傷活性，結果顯示輸注臍帶血來源CIK後，患者外周血中CD3+ CD4+Ｔ細胞和CD3- CD56+Ｔ細胞比例明顯增加。令人振奮的是，其中１例肝癌和食管癌患者達到完全緩解，２例卵巢癌患者獲得部分緩解，10例病情穩定，這說明臍帶血來源CIK是一種治療多種惡性腫瘤的安全有效方法，特別適宜一些久病體虛和不能承受反復采血的老年患者。 一項發表在國際期刊《Int Immunopharmacol》的臨床研究顯示，臍帶血來源CIK細胞聯合二線化療治療晚期實體瘤，顯著改善一線化療失敗的晚期實體瘤患者的生存期。研究將40例一線化療失敗後晚期實體瘤患者分為臍帶血來源CIK細胞+二線化療組和二線單獨化療組。

結果顯示，臍帶血CIK+二線化療組的客觀緩解率（ORR）和疾病控制率（DCR）分別為30%和80%；而化療組的ORR和DCR分別為15%和70%，客觀緩解率提升了一倍。臍帶血CIK+二線化療組的無進展生存期（PFS）和總生存期（OS）分別為3.45個月和11.17個月，而化療組的PFS和OS分別為2.03個月和7.52個月。與單獨二線化療相比，臍帶血來源的CIK細胞聯合二線化療可顯著改善一線化療失敗後晚期實體瘤的無進展生存期和中位生存期。

NK細胞在臍帶血中更豐富

最新研究發現：相對外周血液和骨髓中，NK細胞和NK祖細胞在臍帶血中最為豐富。臍帶血來源NK細胞易採集、免疫原性低、組織相容性好、細胞較原始狀態，增殖能力更強，靶向殺傷癌細胞的效率更高；此外，細胞收集和冷凍保存更加便捷，細胞活力和殺傷活性不受影響。 McMaster大學的研究人員發現，經過體外擴增的NK細胞可以用於乳腺癌治療，同時，從長期深低溫保存的NK細胞並不影響它的擴增能力和抗腫瘤活性，該項成果發表於 《Journal of immunotherapy》。

研究人員從臍帶血中分離並體外擴增了大量啟動的NK細胞，然後對這些NK細胞殺傷乳腺癌細胞的作用進行了觀察，根據凍存時間長短，將臍帶血分為三個組別：長期組（深低溫凍存1-10年）、短期組（深低溫凍存小於1年）、未凍存組（未經凍存的臍帶血）。實驗結果顯示：長期冷凍保存對臍帶血NK細胞的擴增潛能和抗腫瘤活性都沒有影響。同時，這些細胞在攻擊原發性乳腺癌細胞時特別有效。

臍帶血來源NK細胞治療，79%患者客觀緩解

2017年，美國加州大學三藩市分校研究團隊開展了一項體外擴增臍帶血來源的 NK細胞治療多發性骨髓瘤的臨床試驗。在I期臨床試驗中，10名患者獲得了非常好的部分緩解，其中8名患者接近完全緩解或更好。在II期臨床試驗中，79%患者獲得了完全緩解或很好的部分緩解，3年無進展生存率可達 52%。

另外，在2018年，《Human Gene Therapy》刊登過一篇文章，研究發現，擴增後的臍帶血NK細胞具有較強的體內外抗腫瘤活性，可單獨應用或聯合貝伐單抗用於中晚期結直腸癌的治療。

近年來，隨著嵌合抗原受體（CAR）技術在CAR-T治療中的大顯身手，基於NK細胞的CAR-NK研究也方興未艾。CAR-NK具備顯著的抗腫瘤活性，安全性更高，還可批量生產，應用前景廣闊。 2020年2月，頂級醫學雜誌《新英格蘭醫學雜誌》發表了一項臍帶血來源的嵌合抗原受體NK細胞（CAR-NK）治療CD19陽性淋巴樣腫瘤的1/2期臨床研究。共納入11名復發或難治性CD19陽性癌症（非霍奇金淋巴瘤或慢性淋巴細胞白血病[CLL]），使用來自臍帶血的HLA不匹配的抗CD19 CAR-NK細胞。

研究結果顯示，在接受治療的11名患者中，8名（73%）有反應;在這些患者中，7例（4例淋巴瘤和3例CLL）完全緩解。輸注的CAR-NK細胞擴增並在低水準下持續至少12個月。CAR-NK細胞的給藥，沒有產生重大毒性作用。

11名患者腫瘤治療情況

總結

腫瘤免疫細胞治療正迅速發展，CAR-T、TIL、TCR-T等細胞療法不斷湧現，NK、CIK、DC-CIK療法也在不斷優化反覆運算。未來免疫細胞的用途越來越廣，健康的免疫細胞是培養擴增的必須條件，因此來源上不斷擴寬，不局限于外周血，臍帶血中同樣含有豐富的免疫細胞。 臍帶血來源的免疫細胞為一些無法從外周血上獲取免疫細胞的患者提供了一個選擇。總之，在免疫細胞治療技術加速發展的時代，臍帶血的臨床價值和科研價值也在不斷水漲船高，為腫瘤患者和癌症高風險人群帶來福音。

參考文獻：

1.Cord blood-derived cytokine-induced killer cells biotherapy combined with second-line chemotherapy in the treatment of advanced solid malignancies.Int Immunopharmacol. 2011  2.Phase I study of cord blood-derived natural killer cells combined with autologous stem cell transplantation in multiple myeloma.Br J Haematol. 2017 3.Umbilical Cord Blood-Derived Natural Killer Cells Combined with Bevacizumab for Colorectal Cancer Treatment.Hum Gene Ther. 2019  4.Use of CAR-Transduced Natural Killer Cells in CD19-Positive Lymphoid Tumors.N Engl J Med. 2020

幹細胞與免疫細胞的區別

在人體這座細胞構築的城堡中，身體若是一個王國，幹細胞就是建設者，免疫細胞則是防衛兵。幹細胞與免疫細胞究竟有什麼不同？

Part 1:兩者功能不同

幹細胞是建設者，免疫細胞是防衛兵

幹細胞是建設者

幹細胞是人體生命的源泉，當我們的人體還在成長時，它是整個細胞體系的創造者，通過分化源源不斷地提供新生細胞，增加我們身體細胞的數量；當我們成年後身體不再成長，幹細胞又會扮演細胞王國的維護者，及時替換和更新衰老或受損的細胞。

免疫細胞是防衛兵

消滅“敵人”

當有外敵入侵，如細菌和病毒，免疫細胞就會扮演細胞王國的軍隊，快速反應，將其清除。如果細胞王國中出現叛變分子，如正常細胞突變為癌細胞，免疫細胞就會扮演安保系統，將其識別並清除。

但是，當外敵入侵過多，或王國內叛變分子太多，免疫細胞沒有能力全部清除時，我們的身體就會生病。不幸的是，當我們慢慢衰老，體內幹細胞和免疫細胞的數量及活力均會不斷減弱。幸運的是，科學家開發了基於幹細胞和免疫細胞的生物醫學技術，為我們的健康保駕護航。

兩者如何分類

幹細胞可分為4層

根據分化潛能不同分為：全能幹細胞、亞全能幹細胞、多能幹細胞、單能幹細胞；

發育階段不同分為：胚胎幹細胞、成體幹細胞；

取材來源不同分為：骨髓、牙髓、脂肪、臍帶、臍帶血等；

組織功能不同分為：造血、皮膚、神經幹細胞。

體外可以獲取幹細胞的方法有很多，最安全快捷的是圍產期組織（胎盤、臍帶、臍帶血）中獲取。

免疫細胞包括很多種，主要包括T細胞、B細胞、殺傷細胞（K細胞）、自然殺傷細胞（NK細胞）、單核吞噬細胞等。

NK細胞是固有免疫，可以隨時清除體內衰老、變異的細胞，就像是員警，隨時維持社會治安。CIK是進一步增強自身免疫力，彌補NK細胞的相對不足，就像是壞人太多就需要武警出動。CAR-T是腫瘤蛋白基因修飾的免疫T細胞。在腫瘤細胞被NK細胞和CIK細胞追殺的過程中，有些腫瘤細胞在戰爭中學會偽裝自己，於是就有了CAR-T，可以殺死這些狡猾偽裝的腫瘤細胞。CAR-T用於血液腫瘤治療。需要注意的是，目前CAR-T只能用於治療部分血液腫瘤患者，還不能用於實體腫瘤的治療，如肺癌、肝癌、乳腺癌等。

Part 2:提取方式不同

幹細胞可以從多種人體組織中提取。以間充質幹細胞為例，最初是從骨髓中提取的，後來在血液、脂肪、牙髓等多種人體組織都能提到。研究發現，新生兒出生後帶來的臍帶胎盤中有非常豐富的幹細胞，無論是使用還是提取對新生兒和媽媽都沒有任何傷害，並且在用於治療各類難治重病時，有非常好的效果和潛力。

免疫細胞的來源主要是血液，包括成人的外周血和嬰兒的臍帶血。血液中含有大量功能成熟的免疫細胞，在我們的身體內不停迴圈，時刻保護我們的健康。

Part 3:疾病治療方面的不同

當我們的身體遭受創傷，如燒傷撞傷，器官損傷，其本質是相關部位的細胞受到了損傷，這時就需要幹細胞進行修復和治療。無論身體外傷，或者是發生糖尿病、冠心病，幹細胞都能起到修復這些受損器官中細胞的作用。

免疫細胞發揮4方面的作用：

抗衰老、改善慢病、亞健康調理、病症預防。

當然，免疫細胞和幹細胞也會合作，一起幹掉壞蛋。其實二者都是相輔相成的，少了他們中的任何一個都不行，而他們還有更多的作用沒有發掘出來，我們也相信未來他們能發揮更大的價值！

幹細胞與免疫細胞兩者之間有什麼聯繫？

①幹細胞與免疫細胞的交流

作為防禦入侵病原體的主要防線，免疫細胞被認為是維持體內穩態、促進損傷癒合的關鍵元素。幹細胞還會有規律地同機體中運動擴散的免疫細胞“軍隊”相互作用，從傳統角度來講免疫系統被認為是機體抵禦病原體入侵的最主要的防線。如今科學家們認為免疫系統對於組織恒定和組織癒合非常必要，甚至是在感染不存在的情況下依然如此，研究者認為，多種免疫細胞可以幫助控制幹細胞的行為。不過，在某些情況下，免疫細胞甚至會攻擊正常組織，促進癌變細胞的增殖和擴散。掌握免疫系統對於幹細胞功能發揮的影響，有利於科學家們更好的應用幹細胞治療多種疾病，例如貧血、多發性硬化症、肌肉萎縮症和心臟衰竭。

②免疫細胞參與幹細胞的分化

維持體內平衡的重要分支是細胞的持續更新，而幹細胞巢內的免疫細胞對於細胞更新過程至關重要：骨髓中的巨噬細胞被證實直接與紅血球母細胞（erythroblast）互作。如果這種直接互作過程受阻，紅血球母細胞將不能正常成熟，補充血液中的紅細胞，最終易引發再生障礙性貧血。可以發現免疫細胞會調控幹細胞功能的行使，維持細胞增殖和凋亡的“收支平衡”。

③免疫細胞與幹細胞的合作

越來越多的研究揭示免疫細胞是幹細胞研究領域不可忽視的部分，是啟動組織再生、損傷修復的關鍵元素。科學家還發現了一個暗含幹細胞、免疫細胞互作風雲的有趣場所—毛囊。來自于南加州大學的Cheng Ming Chuong團隊發現，去除老鼠背上所有的毛後，所有受損的毛囊都會分泌 CCL2蛋白。該蛋白作為一種“求救信號”，負責吸引巨噬細胞遷移至毛囊之處，並分泌腫瘤壞死因數（TNF），啟動毛囊幹細胞再生出新的頭髮。

CIK細胞具有T細胞和NK細胞雙重功能，臨床研究中疾病控制率100%！

2022年《CSCO原發性肝癌診療指南2022版》將“CIK細胞療法”寫進肝切除術後輔助治療推薦方案（證據水準：2A類）。指南中還詳細說明了CIK細胞療法的適應症、治療劑量、治療週期、不良反應等相關內容，為臨床醫生提供了可靠的治療參考和指導。實際上，CIK國際註冊中心公佈CIK細胞療法十年臨床研究統計資料，不僅僅是在肝癌上療效顯著，同時涵蓋30多種不同實體瘤，有效提升患者的生存時間。

那麼，CIK細胞究竟有什麼神奇魔法呢？

CIK細胞具有T細胞和NK細胞雙重功能

CIK細胞是一種特殊的免疫細胞，又稱細胞因數誘導的殺傷細胞(Cytokine-Induced Killer，CIK)，是通過體外培養啟動外周血單個核細胞或淋巴細胞得到的，刺激和恢復免疫系統來識別和清除腫瘤細胞。從表型上看，CIK細胞代表了一種異質性細胞群，包括CD3+CD56+細胞，CD3+CD56-效應T細胞和CD3-CD56+NK細胞。NK細胞亞群通過抗體依賴的細胞介導的細胞毒性作用（ADCC），釋放顆粒和細胞毒性、Fas配體和膜結合或分泌的細胞因數來誘導腫瘤細胞死亡；T細胞亞群通過樹突狀細胞抗原呈遞，與MHCⅠ類結合，識別腫瘤細胞的靶標；CD3+CD56+ CIK細胞則同時具有NK細胞和T細胞的雙重功能特性。

CIK三種細胞亞型靶向腫瘤的機制

CIK細胞的抗腫瘤機制

迄今為止，大量研究表明，CIK細胞對卵巢癌、肺癌、肝癌、宮頸癌、結直腸癌等多種實體瘤具有強大的細胞毒性活性。

CIK細胞的抗腫瘤機制包括：

（1）效應細胞–靶細胞接觸，通過將CIK細胞上的表面粘附分子白細胞功能相關抗原-1（LFA-1）與大多數易感腫瘤細胞上表達的LFA-1配體結合，從而導致對腫瘤細胞的細胞毒性。

（2）涉及NK細胞受體與其配體的結合和活性的細胞信號通路，這些配體在腫瘤細胞上高度表達，導致CIK細胞活化，導致脫顆粒和對腫瘤細胞的細胞毒性。

（3）Fas配體通過Fas信號通路誘導腫瘤細胞凋亡。

CIK細胞實體瘤的臨床研究

CIK細胞作為癌症潛在輔助療法的治療潛力已經得到廣泛認可。許多研究表明，CIK細胞的治療方案對癌症患者可能是安全可行的。CIK細胞聯合常規治療如手術、放化療等，降低腫瘤負荷，清除殘餘腫瘤細胞，從而延長腫瘤患者的生存時間，改善患者的生存品質。

01 中晚期肺癌：疾病控制率100%

一項單中心、開放標籤、1b臨床試驗，入組了34例 IIIB/IIIC/IV 期無 EGFR/ALK/ROS1 突變的鱗狀或非鱗狀NSCLC患者。所有患者均接受 Sintilimab（PD-1抗體）、鉑類雙藥化療和 CIK 細胞治療。

研究結果顯示，在34名患者中，2名達到CR，5名CMR和21名PR。34名患者的疾病緩解率為82.4%，疾病控制率為100.0%。在15個非鱗狀細胞癌中的14個評估了客觀反應，19例鱗狀細胞癌患者中的14例。3例腦轉移患者中，2例達到CR和1為SD。截至截止日期，3例患者仍在持續緩解，無新患者發生腦轉移。34例患者中有32例（94.1%）腫瘤縮小，其中15例（44.1%）腫瘤縮小超過50 % 。

02 乳腺癌術後：5年生存率為95.2%

夏建川教授團隊進行了一項乳腺癌患者術後綜合治療後接受CIK細胞免疫治療的臨床研究。共納入300例接受根治性手術的乳腺癌患者，150例患者接受輔助性CIK細胞治療，150例單純接受常規治療。研究結果顯示，乳腺癌組織中表達高水準PD-L1的乳腺癌患者術後患者接受免疫細胞治療的療效更好。在CIK治療組，PD-L1陽性患者預後較好，即PD-L1陽性患者傾向于從CIK治療中獲益更大。PD-L1陽性佇列患者的5年OS率為95.2%，5年RFS率為87.6%。而在對照組中，PD-L1陽性患者預後較差，這與先前的研究結果一致，即PD-L1與不良預後相關。

03 肝癌術後：1年復發率顯著降低

夏建川教授團隊的一項單中心、Ⅲ期、開放、隨機對照試驗，在中山大學腫瘤防治中心進行研究，共納入200名接受治癒性肝切除術的患者，100名（研究組）接受4週期CIK治療，另外100名（對照組）則不接受。CIK組的中位TTR為13.6個月，而對照組為7.8 個月；與對照組相比，CIK組的一年復發率顯著降低。CIK組一年、三年和5年無病進展期（DFS）分別為83.8%、59.9%和51.8%，對照組分別為69.9%、55.9%和44.9%。CIK組一年、三年和5年總生存期（OS）分別為91.7%、82.2%和69.3%，對照組分別為87.0%、76.3%和56.2%。

04 轉移性腸癌：提高總生存期30個月

夏建川教授團隊的一項CIK聯合一線化療藥物治療轉移性結直腸癌患者療效回顧性研究，共納入252例轉移性結直腸癌（CRC）。126例（治療組）接受一線標準治療聯合CIK細胞治療，126例（對照組）僅接受一線標準治療。CIK細胞治療聯合一線化療方案治療轉移性結直腸癌（CRC），可顯著改善mCRC患者的總生存期（OS）和 無進展生存期（PFS），差異有統計學意義（P < 0.0001），與對照組相比可提高mOS 30.6個月、mPFS 11.1個 月。

總結

CIK細胞具有增殖快、殺瘤活性強、殺瘤譜廣等優點，尤其對化療耐藥的腫瘤細胞也有效。基於CIK細胞的過繼性細胞療法在改善臨床腫瘤治療和改善各種惡性腫瘤患者的生活品質方面具有巨大潛力。手術不能解決腫瘤細胞的擴散、轉移問題，而放療和化療在殺傷腫瘤細胞的同時也對正常細胞和機體免疫、造血功能造成損害。CIK細胞療法具有低毒副作用，與常規療法聯用，有效降低常規療法的副作用，提高患者的生活品質及機體的免疫和造血功能。

參考文獻：

1.The dual-functional capability of cytokine-induced killer cells and application in tumor immunology. Human Immunology.2015

2.A randomized controlled trial on patients with or without adjuvant autologous cytokine-induced killer cells after curative resection for hepatocellular carcinoma. Onco.2016

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