Zhonghua Xue Ye Xue Za Zhi. 2022 May; 43(5): 400–407.

Chinese. doi: 10.3760/cma.j.issn.0253-2727.2022.05.009

Abstract

目的

比較不同擴增體系NK細胞生物學特性的差異以及治療異基因造血幹細胞移植後（allo-HSCT）白血病復發的療效。

方法

分別採用CD3/CD52單抗擴增法和飼養層細胞擴增法誘導供者來源NK細胞大量擴增，檢測擴增前後NK細胞表型、因數分泌、細胞毒的變化規律；選取16例allo-HSCT後復發白血病患者，8例輸注CD3/CD52單抗擴增NK細胞，8例輸注飼養層細胞擴增NK細胞，觀察患者的治療反應和長期生存情況。

結果

①與CD3/CD52單抗擴增體系相比，飼養層細胞擴增體系NK細胞純度較高、NK細胞表面活化性受體DNAM-1及NKp30表達較高、抑制性受體CTLA-4表達較低，而兩種NK細胞NKG2D/CD25/CD69/Trail/PD-1/TIM-3/TIGIT表達差異無統計學意義。②兩種擴增體系NK細胞Ki-67指數均明顯增加，以飼養層細胞擴增NK細胞尤為明顯；飼養層細胞擴增NK細胞穿孔素及顆粒酶B表達水平均明顯高於CD3/CD52單抗擴增NK細胞。③16例allo-HSCT後復發白血病患者NK細胞輸注過程中均未觀察到明顯不良反應。NK細胞輸注後中位隨訪時間為2554（917～2583）d，CD3/CD52單抗擴增組中3例患者無白血病存活，5例死亡；飼養層細胞擴增組中6例患者長期存活，2例死亡。5例患者在NK細胞輸注前存在移植物抗宿主病，NK細胞輸注後移植物抗宿主病未加重甚至緩解。

結論

CD3/CD52單抗擴增與飼養層細胞擴增體系NK細胞的生物學特性具有明顯差異；NK細胞輸注對allo-HSCT後復發白血病患者的療效仍需要進一步驗證。

Keywords: 白血病, 復發, 擴增, NK細胞

異基因造血幹細胞移植（allo-HSCT）是白血病的有效治療手段，移植後復發是影響移植療效的主要原因。目前，移植後白血病復發的常規治療方法包括化療及供者淋巴細胞輸注（DLI），但DLI可使移植物抗宿主病（GVHD）的發生風險增加[1]。因此，探討新的復發後治療方法是提高白血病患者移植療效的關鍵。

自然殺傷（NK）細胞是構成機體重要的天然免疫屏障之一，無需致敏即可殺傷腫瘤細胞或感染的細胞，通過分泌穿孔素、顆粒酶等介導靶細胞殺傷[2]–[3]，另一方面可通過分泌IFN-γ、TNF-α等活化適應性免疫系統而發揮協同免疫防禦作用[4]。除此之外，抗體依賴的細胞介導細胞毒性作用（ADCC）也是NK細胞效應功能發揮的重要途徑。

NK細胞效應功能強度受NK細胞活化性受體與抑制性受體的平衡、NK細胞的成熟度及對細胞因數的回應體內外多種因素調控。內源性NK細胞往往受疾病及自身HLA分子抑制等多方面影響，數量及效應功能受損，但研究證明來自健康供者的NK細胞具有殺傷腫瘤細胞功能[5]。然而，若輸注的NK細胞數量少、療程短，患者仍面臨腫瘤復發的風險。目前，CD3/CD52單抗法和K562飼養層細胞法是臨床應用較多的兩種NK細胞體外擴增方法[6]–[7]。本研究比較了以上兩種擴增體系NK細胞的生物學特性，並回顧性分析比較了兩種擴增體系NK細胞過繼性輸注治療allo-HSCT後白血病復發患者的安全性及初步療效。

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物件與方法

一、NK細胞擴增方法

採集健康供者外周血，提取單個核細胞，CD3/CD52單抗擴增法參照文獻[6]，飼養層細胞擴增法參照文獻[8]。

二、NK細胞採集時間點

NK細胞擴增前采外周血檢測表型及功能，體外擴增2周後檢測擴增後NK細胞表型及功能各項指標。

三、NK細胞表型及功能評估方法

1. 表型評估：外周血來源的單個核細胞及擴增後的NK細胞，加入膜表面抗體標記，避光孵育30 min，溶血並PBS洗滌後上機檢測。抗體選擇見表1。

表1

流式細胞術評估NK細胞表型及功能所用抗體

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2. 功能評估：對於NK細胞擴增前後細胞增殖及細胞毒的評估，則在膜表面抗體標記後，按照Cytofix/Cytoperm試劑盒（美國Becton Dickinson公司產品）說明固定破膜後標記細胞內免疫因數。抗體選擇見表1。

四、入組病例及移植方案

1. 病例：16例患者納入本研究。8例患者輸注CD3/CD52擴增NK細胞，均為2011年2月至2014年2月在北京大學血液病研究所進行allo-HSCT且移植後白血病復發患者；8例患者輸注K562飼養層擴增NK細胞，為2016年8月至2018年6月在北京大學血液病研究所進行allo-HSCT且移植後白血病復發患者。所有患者均簽署知情同意書。
2. 預處理方案：全部採用常規的改良BU/CY（白消安/環磷醯胺）方案，HLA配型不合患者移植預處理方案中加用抗胸腺細胞球蛋白（ATG）[9]。
3. 幹細胞的動員和採集：全部患者採用骨髓聯合外周血幹細胞移植，所有患者均以G-CSF動員5～6 d（−3 d開始），劑量為5 µg/kg[10]–[11]。
4. 急性GVHD的預防：採用環孢素A（CsA）聯合黴酚酸酯（MMF）及短程甲氨蝶呤（MTX）方案。
5. 植活標準：連續3 d中性粒細胞絕對計數（ANC）≥0.5×10⁹/L為粒細胞植活，PLT≥20×10⁹/L連續7 d且脫離血小板輸注為血小板植活[12]。

五、患者移植後微小殘留病（MRD）監測

多參數流式細胞術（MFC）和即時螢光定量PCR（RT-PCR）用來檢測MRD[13]。MRD陽性：①MFC連續兩次陽性或者WT1連續兩次陽性抑或是在同一標本中MFC或WT1陽性各1次；②移植後出現基因重排或突變。MRD緩解：在NK細胞輸注後達到MRD陰性狀態並維持至少1個月[14]。對於骨髓中原始細胞>5％定義為血液學復發。

六、隨訪

通過查閱住院/門診病歷及電話隨訪方式獲取患者生存資料。

七、統計學處理

採用GraphPad Prism8分析資料，採用非配對t檢驗進行單因素分析，P<0.05為差異有統計學意義。

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結果

一、兩種擴增體系NK細胞生物學差異

1. 兩種擴增體系NK細胞活化性受體的表達：CD3/CD52單抗擴增組NK細胞在CD45陽性淋巴亞群中的中位占比為18.9％，而飼養層細胞擴增的NK細胞中位數比例為85.0％，純度更高。通過對不同體系擴增前後NK細胞活化性受體的表達評估，我們發現滋養層擴增的NK細胞的活化性受體DNAM-1及NKp30的表達都明顯高於CD3/CD52單抗擴增組（P＝0.016，P＝0.006），而NKG2D、Trail占NK細胞的百分比在兩組間差異無統計學意義（P>0.05）（圖1、圖2）。CD25及CD69分別被認為是NK細胞早期活化和晚期活化的重要指標[15]。在我們的佇列中，CD25及CD69占NK細胞百分比在CD3/CD52單抗擴增組及飼養層擴增組均無明顯差別（P>0.05），提示兩種擴增NK細胞儘管在活化性受體表達方面存在差異，但兩者綜合的活化程度相當（圖1、圖2）。圖1兩種不同擴增體系NK細胞活化性受體表達

   1、2、3分別為擴增前組、CD3/CD52單抗擴增組、飼養層細胞擴增組。ns：差異無統計學意義；^a P<0.05

   圖2

   兩種不同擴增體系NK細胞活化性受體平均螢光強度（MFI）

   1、2、3分別為擴增前組、CD3/CD52單抗擴增組、飼養層細胞擴增組。ns：差異無統計學意義；^a P<0.05

   2. 兩種擴增體系NK細胞抑制性受體的表達：兩種體系擴增的NK細胞抑制性受體CTLA4、PD-1、TIM-3的平均螢光強度（MFI）較擴增前均明顯上調（P<0.001，P＝0.003，P＝0.001），然而Tigit的平均螢光強度無明顯變化（P>0.05）（圖3）。飼養層細胞擴增組NK細胞CTLA4（占NK細胞百分比）的表達明顯低於CD3/CD52單抗擴增組（P<0.001），而其他抑制性受體（PD-1、TIM-3、Tigit）在兩組間無論是平均螢光強度還是在NK細胞中占比差異均無統計學意義（P>0.05）。提示體外擴增誘導NK細胞活化的同時可能一定程度上伴隨功能耗竭。圖3兩種不同擴增體系NK細胞抑制性受體平均螢光強度（MFI）

      1、2、3分別為擴增前組、CD3/CD52單抗擴增組、飼養層細胞擴增組。ns：差異無統計學意義；^a P<0.05

      3. 兩種擴增體系NK細胞趨化型受體的表達：NK細胞向組織臟器中的遷移依賴於其表面的各種黏附性分子及趨化性受體的表達。為此，我們評估了不同擴增體系對NK細胞表面黏附性分子及趨化性受體表達的影響，結果顯示在飼養層細胞擴增組NK細胞中CXCR3、CD96的比例明顯高於CD3/CD52單抗擴增組（P＝0.004，P＝0.037），CX3CR1及4-1BB在NK細胞的表達比例在飼養層擴增組更低，CXCR4、CD94、CD27及CD62L的比例在兩種擴增體系NK細胞間差異均無統計學意義（P>0.05），提示從黏附分子和趨化受體表達角度，兩種擴增方法各有利弊（圖4）。圖4兩種不同擴增體系NK細胞趨化性受體表達

         1、2、3分別為擴增前組、CD3/CD52單抗擴增組、飼養層細胞擴增組。MFI：平均螢光強度；ns：差異無統計學意義；^a P<0.05

         4. 兩種擴增體系NK細胞功能表達差異：我們通過檢測擴增NK細胞的Ki-67指標評估其不同體系的擴增能力。結果顯示，飼養層擴增NK細胞的增殖潛能明顯高於CD3/CD52單抗擴增NK細胞（P＝0.033），穿孔素及顆粒酶B的表達水準也明顯高於抗體擴增NK細胞（圖5）。圖5兩種不同擴增體系NK細胞生物學功能比較

            1、2、3分別為擴增前組、CD3/CD52單抗擴增組、飼養層細胞擴增組。MFI：平均螢光強度；ns：差異無統計學意義；^a P<0.05。Perforin：穿孔素；Granzyme B：顆粒酶B

            二、入組患者的臨床特點

            CD3/CD52單抗擴增組中男5例、女3例，4例接受同胞HLA全相合allo-HSCT，4例接受haplo-HSCT，7例患者移植時處於完全緩解狀態，1例移植前為復發狀態。至2021年6月隨訪終止時，中位隨訪時間為2 554 d，共有3例患者死亡。

            飼養層擴增組中男4例、女4例，5例接受同胞HLA全相合allo-HSCT，3例接受haplo-HSCT，8例患者移植時均處於完全緩解狀態。患者首次接受供者來源NK細胞輸注的中位時間是移植後482 d。至2021年6月隨訪終止時，中位隨訪時間1 015.5（917～1 068）d，共有2例患者死亡。

            患者主要臨床特點和NK細胞治療前情況見表2。

            表2

            16例異基因造血幹細胞移植後復發白血病患者的一般資料及NK細胞治療前情況

            例號	性別	年齡	疾病類型	移植模式	急性GVHD	NK細胞輸注前化療方案	NK細胞輸注前疾病狀態
            1	男	37	AML-M2	HLA全相合	無	FLAG，HAA	血液學復發
            2	男	52	B-ALL	單倍型	無	COPD	血液學復發
            3	男	26	AML-M2	HLA全相合	無	HAA	髓外復發
            4	女	12	AML-M2	單倍型	Ⅰ度，皮膚Ⅱ度	無	MRD（+）
            5	男	21	MDS-RAEB2	單倍型	Ⅳ度（皮膚、肝）	無	MRD（+）
            6	女	46	AML-M2	單倍型	無	無	MRD（+）
            7	男	47	B-ALL	HLA全相合	無	COPD	髓外復發，MRD（+）
            8	女	33	AML-M2	HLA全相合	腸道Ⅰ度	無	血液學復發
            9	女	40	AML-M2	HLA全相合	無	無	MRD（+）
            10	男	31	AML-M2	單倍型	Ⅰ度，皮膚Ⅱ度	AA	MRD（+）
            11	女	54	AML-M4	HLA全相合	無	無	血液學復發，髓外復發，MRD（+）
            12	女	24	AML-M5	單倍型	皮膚Ⅰ度	AA	MRD（+）
            13	男	31	AML-M2	單倍型	無	無	血液學復發
            14	男	30	AML-M2	HLA全相合	無	FLAG	MRD（+）
            15	男	49	AML-M2	HLA全相合	無	無	血液學復發
            16	女	33	AML-M2	HLA全相合	無	無	MRD（+）

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            注：AML：急性髓系白血病；B-ALL：急性B淋巴細胞白血病；MDS-RAEB2：骨髓增生異常綜合征-難治性貧血伴有原始細胞增多2型；MRD：微小殘留病；FLAG方案：氟達拉賓+阿糖胞苷+G-CSF；HAA方案：高三尖杉酯堿+阿糖胞苷+阿柔比星；COPD方案：環磷醯胺+長春新堿+柔紅黴素+潑尼松；AA方案：阿柔比星+阿糖胞苷；GVHD：移植物抗宿主病

            三、安全性評價

            兩組患者在NK細胞輸注後均未觀察到發熱、血象下降、臟器功能損害等不良反應。

            四、NK細胞治療情況及療效評價

            飼養層細胞擴增組平均接受NK細胞輸注次數為1.25次，CD3/CD52單抗擴增組為2.4次。兩組共觀察到血液學復發5例（伴髓外復發1例），單純MRD持續陽性8例，單純髓外復發1例，髓外復發合併MRD陽性1例。患者NK細胞中位輸注次數為1次，移植後接受NK細胞輸注治療的中位時間為移植後434（103～1 225）d。NK細胞輸注後中位隨訪時間為2 554（917～2 583）d，復發患者緩解率為16.7％（1/6），MRD陽性患者轉陰率為54.5％（6/11），無白血病生存（LFS）率為43.75％（7/16），總生存（OS）率為56.25％（9/16）。對於持續緩解的患者，NK細胞治療後有6例患者接受化療聯合DLI，4例行2次移植。

            飼養層擴增組8例患者中6例有治療反應，其中HLA全相合移植4例，haplo-HSCT 2例，輸注過程均無明顯不良反應，其中5例患者至今無白血病長期生存，1例患者因血液復發死亡。CD3/CD52單抗擴增組8例患者中4例有治療反應，其中HLA全相合移植2例，haplo-HSCT 2例，輸注過程均無明顯不良反應，其中3例患者至今無白血病長期生存，1例因重症肺炎導致呼吸衰竭而死亡。

            而對NK細胞回輸治療無反應患者中，CD3/CD52單抗擴增組8例患者中4例無治療反應（1例為持續MRD陽性，3例為血液學復發），經化療、DLI等治療均未得到緩解，4例均死亡（死於中樞神經系統感染、重度GVHD合併TMA各1例，血液學復發2例）。在飼養層細胞擴增組8例患者中有2例無治療反應（均為MRD持續陽性），經化療後分子學及血液學復發指標均未得到緩解，其中1例NK細胞輸注後MRD仍持續陽性，但後續再行DLI治療後MRD轉陰，至今無白血病生存；另一例患者死于髓外復發。

            CD3/CD52單抗擴增組、飼養層擴增組NK細胞輸注後MRD轉陰率分別為50％（2/4）、50％（3/6）。

            滋養層擴增組的例11在接受NK細胞治療前有重度慢性GVHD（累及肺、皮膚、口腔等器官）；另有3例在移植後分別表現為皮膚、口腔及指甲、皮膚及肺部急性GVHD表現，輸注後症狀緩解。

            在CD3/CD52單抗擴增組，我們觀察到3例患者GVHD症狀在NK細胞輸注後緩解，提示NK細胞可能有抗GVHD的功能。NK細胞治療情況及療效見表3。

            表3

            16例異基因造血幹細胞移植後復發白血病患者的NK細胞治療情況及隨訪結果

            例號	NK細胞輸注次數	NK細胞輸注量（×109/L）	療效評估	隨訪時間（d）	隨訪結果
            1	2	6.20	無效	2 560	死亡（中樞神經系統感染）
            2	1	4.76	無效	2 560	死亡（重度GVHD/TMA）
            3	5	6.62	有效	2 583	存活
            4	1	4.19	有效	2 540	存活
            5	3	6.02	有效	2 540	存活
            6	1	0.36	無效	2 554	死亡（血液學復發）
            7	5	10.31	有效	2 554	死亡（重症肺炎）
            8	1	6.44	無效	2 552	死亡（血液學復發）
            9	1	6.18	有效	1 068	存活
            10	2	7.02	有效	1 064	存活
            11	1	7.10	有效	1 019	存活
            12	1	4.40	無效	917	存活
            13	1	7.32	有效	1 012	死亡（血液學復發）
            14	2	3.14	無效	994	死亡（血液學復發）
            15	1	3.82	有效	917	存活
            16	1	2.48	有效	1 047	存活

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            注：GVHD：移植物抗宿主病；TMA：血栓性微血管病

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            討論

            NK細胞是機體天然免疫屏障的重要組成，是抗病毒和抗腫瘤的主力軍之一[7]。除此之外，供者KIR不相合的NK細胞輸注至受者體內，可通過抑制受者來源的抗原提呈細胞及T細胞，降低移植物抗宿主病的發生。因此，過繼性輸注NK細胞的免疫療法已成為了潛在抗腫瘤的有效治療方式。然而，由於外周血NK細胞比例低，獲取數量少，使得NK細胞治療療效受限。體外細胞擴增體系的發展使得NK細胞可在短期（2～3周）內獲取，並且輸注的NK細胞在動物及人體中均顯示發揮抗腫瘤效應的同時不增加GVHD的發生率[5]。但是，不同擴增體系產出的NK細胞生物學特性和臨床療效存在較大差異[16]–[17]。Masuyama等[6]首次通過CD3/CD52單抗體外刺激外周血單個核細胞後聯合自體血漿及IL-2，在無飼養層細胞體系中實現了NK細胞的量級擴增，且抗腫瘤功能增強。儘管該無飼養層體系擴增NK細胞比例相對較高，但培養14 d後的擴增細胞中CD8⁺T細胞及CD4⁺T細胞比例中位值分別為60％、15％。隨著體外擴增體系的完善，體外飼養層細胞擴增體系擴增NK細胞效率更佳[14]。然而體外飼養層細胞擴增體系需要大量且持續的因數刺激，當輸注至體內後，細胞因數刺激驟失將導致輸注後NK細胞代謝加快。本研究首次對CD3/CD52單抗擴增NK細胞與K562飼養層擴增NK細胞的生物學差異進行探討，結果顯示，以K562飼養層擴增的NK細胞純度較高、T細胞含量較低。兩種不同擴增體系NK細胞活化性受體表達及KI-67均明顯高於擴增前NK細胞，說明NK細胞擴增同時伴隨著功能活化，尤以飼養層擴增組NK細胞的增殖水準及活化性受體DNAM-1及NKP30的表達水準更高，而抑制性受體CTLA4表達明顯低於CD3/CD52單抗擴增組，抑制性受體PD-1、Tigit及Tim-3的表達在兩組間無明顯差異。以上結果提示飼養層擴增的NK細胞的抗腫瘤能力可能更強。值得注意的是，兩組擴增後NK細胞的活化性受體明顯增加，抑制性受體相較於擴增前組也明顯上調，這與Judge等[18]的報導一致，可能是擴增NK細胞為了防止過度活化的適應性調控。

            既往有研究前瞻性評估不同體系擴增的NK細胞在治療AML中的療效，結果提示過繼性NK細胞輸注在治療低白血病負荷中有優勢[8],[14]，然而尚未有研究報導不同體系擴增的NK細胞在治療AML中的療效差異。在本研究中，兩種不同擴增體系NK細胞在生物學特性上存在差異，兩種擴增體系NK細胞輸注對移植後血液學復發白血病患者均無顯著療效；而對持續MRD陽性患者來說，在CD3/CD52單抗擴增組和飼養層擴增組，分別有50％（2/4）、50％（3/6）的MRD陽性患者NK細胞治療後轉陰，提示NK細胞治療可能有清除體內MRD作用，並且以飼養層擴增NK細胞效果更好，這可能與飼養層擴增的NK細胞活化性受體表達更高有關；與此同時，本研究結果表明飼養層擴增NK細胞趨化型因數受體CXCR3與CXCR4的表達均明顯高於CD3/CD52單抗擴增NK細胞，提示飼養層擴增NK細胞的遷移速度與向骨髓的趨化能力更高，也更有利於擴增NK細胞向腫瘤部位的遷移[19]。同時，Denman等[20]的研究表明裝載IL-21的K562細胞作為飼養層細胞體外擴增NK細胞的端粒酶更長，提示滋養層擴增NK細胞可能體內存活時間更長。

            在本研究中，兩種擴增體系NK細胞治療移植後復發白血病患者並未引起或加重GVHD，且兩組均有部分患者的急慢性GVHD症狀在NK細胞輸注後得以緩解，提示NK細胞輸注治療的安全性良好。既往研究表明NK細胞在抗白血病細胞的同時具有抗GVHD效應[5]，這得益於NK細胞對效應性T細胞的功能和數量制約：一方面NK細胞可殺傷供者來源的T細胞，同時可通過殺傷不成熟的樹突狀細胞減少抗原提呈[21]–[22]。與此同時，異基因來源的NK細胞不損傷患者的靶器官，因此不會發生GVHD和細胞因數風暴（CRS）。

            本研究結果初步顯示，CD3/CD52單抗擴增與飼養層細胞擴增體系NK細胞的表型和功能具有明顯差異，兩種擴增體系NK細胞在治療移植後持續MRD陽性均有效。本研究為回顧性研究且佇列樣本數少，因此NK細胞輸注對allo-HSCT後復發白血病患者的療效仍需要進一步驗證。

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            Footnotes

            利益衝突 本研究所用NK細胞產品由北京賽傲生物技術有限公司提供

            作者貢獻聲明 曹勳紅：資料收集、資料分析、文章撰寫；趙翔宇：研究設計、寫作指導；其他：資料收集

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            References

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嵌合抗原受體T細胞療法（CAR-T）在血液系統惡性腫瘤取得了顯著治療效果，FDA自2017年以來先後批准了5款CAR-T細胞療法上市，但實體癌患者仍然對CAR-T細胞療法有很大的耐藥性。導致這種耐藥性的因素包括含有抗腫瘤潛能不同的細胞的異質輸注產品、常規T細胞到腫瘤部位的運輸不良、腫瘤微環境中T細胞效應功能的抑制以及腫瘤通過抗原丟失或其他機制逃逸。與此同時，其他類型的具有先天抗腫瘤特性的免疫效應細胞，例如NK細胞、NKT細胞、γδT細胞，正在被用來開發新型細胞療法。

神經母細胞瘤（Neuroblastoma）是兒童時期最常見、最致命的實體瘤之一。儘管已有多種治療方法，包括強化骨髓清除化療、骨髓幹細胞移植、視黃酸治療，以及抗GD2單抗，但只有約50%的患者能夠實現長期緩解。神經母細胞瘤細胞表面特異性高表達GD2，GD2靶向的CAR-T細胞療法在1期臨床試驗顯示，該療法安全性良好，但很少產生持久臨床反應。近日，貝勒醫學院的研究人員在國際頂尖醫學期刊 Nature Medicine 上發表了題為：Anti-GD2 CAR-NKT cells in relapsed or refractory neuroblastoma: updated phase 1 trial interim results 的研究論文【1】。這項1期臨床試驗評估了基因工程自然殺傷T細胞免疫療法（CAR-NKT）治療神經母細胞瘤的安全性、抗腫瘤活性和免疫學特性。這是CAR-NKT細胞療法的首個人體臨床試驗的最新中期結果，試驗結果顯示，該療法耐受性良好，還觀察到了其抗腫瘤活性較強的早期證據，客觀緩解率為25%（3/12），其中2人部分緩解，1人完全緩解。

在這項研究中，NKT細胞被修飾為表達GD2特異性嵌合抗原受體以及IL-15，GD2使NKT細胞能夠靶向神經母細胞瘤細胞，而IL-15能夠增強NKT細胞存活。2020年10月，該團隊在 Nature Medicine 發表論文【2】，報告了參加該試驗的前三名神經母細胞瘤兒童患者的中期結果。

在這篇最新論文中，研究團隊描述了12名對其他治療有耐藥性的4期復發神經母細胞瘤患者的治療結果。他們發現，在四種劑量水準下，CAR-NKT細胞療法對所有12名患者都是安全的，沒有劑量限制性毒性。3名患者對治療有客觀反應，包括1名患者完全反應和2名患者部分反應。另外還有2名患者也顯示出抗腫瘤活性的證據，但未達到部分緩解標準。

貝勒醫學院兒科血液學和腫瘤學副教授、論文共同通訊作者 Andras Heczey 博士表示，對在幾名神經母細胞瘤患者中觀察到的抗腫瘤活性證據感到鼓舞，特別是因為這項試驗仍處於劑量遞增階段。

該團隊之前的研究表明，在臨床前動物模型中，NKT細胞可以定位到腫瘤部位。而這項臨床試驗在人類身上證實了這些觀察結果。此外，該還發現，CAR-NKT細胞的體內增殖與抗腫瘤活性升高之間存在相關性。

貝勒醫學院兒科血液學和腫瘤學教授、論文共同通訊作者 Leonid Metelitsa 博士表示，在這項臨床研究中，我們證實了在輸注的NKT細胞上表達的CD62L生物標誌物，可以預測更高的NKT細胞體內擴增和患者的抗腫瘤活性。該研究還發現，在輸注的CAR-NKT細胞中，BTG抗增殖因數1（BTG1）基因的上調表明細胞耗竭並限制了CAR-NKT細胞的功能活性。在小鼠模型中，降低CAR-NKT細胞中BTG1的表達，增強了它們對神經母細胞瘤的治療活性。

這項研究為GD2 CAR-NKT細胞對神經母細胞瘤的抗腫瘤活性提供了有希望的初步證據。這也激發了人們的希望，新的免疫治療策略有望改善患有神經母細胞瘤的兒童的預後。基於安全性和抗腫瘤活性的有希望的證據，研究團隊進一步進行了更高劑量的GD2 CAR-NKT細胞療法的試驗，在這些額外的佇列完成後，研究團隊將進行2期臨床試驗，以評估這種新型免疫療法的抗腫瘤活性。

論文連結：

https://www.nature.com/articles/s41591-023-02363-y

https://www.nature.com/articles/d41586-023-01473-4

Nature | CAR免疫細胞：設計原理、耐藥性及下一代方向

原文連結：https://www.nature.com/articles/s41586-023-05707-3

嵌合抗原受體（CAR）療法在B細胞和漿細胞腫瘤中表現出顯著的臨床活性，驗證了該療法類別在液態癌症中的使用，然而，耐藥性和應用範圍的限制仍是廣泛應用的難題。這篇綜述回顧了當前CAR的免疫生物學和設計原則，並介紹了預計將推動未來臨床進展的新興平臺。該領域正在快速擴展下一代CAR免疫細胞技術，這些技術旨在提升療效、增強安全性和可接入性。在提升免疫細胞適應性、啟動內源性免疫、武裝細胞以抵抗腫瘤微環境的抑制，以及調節抗原密度閾值的方法上已取得了實質性的進展。越來越複雜的多特異性、邏輯門控和可調節CAR顯示出克服耐藥性和提高安全性的潛力。隱蔽式、無病毒和體內基因傳遞技術的初步發展為降低細胞療法的成本和提高其廣泛應用提供了可能性。CAR T細胞在液態癌症中持續的臨床成功正在推動越來越複雜的免疫細胞療法的發展，這些療法預計在未來幾年內將轉化為用於治療實體瘤和非惡性疾病的治療方法。

引言

嵌合抗原受體（CAR）是合成模組化蛋白，可重定向免疫細胞以應對在惡性腫瘤細胞上表達的目標抗原。這種靈活的平臺在治療B細胞和漿細胞惡性腫瘤方面已經顯示出了顯著的臨床效果，因此，這種療法的應用潛力正推動著科技的快速發展以及來自學術界和生物製藥行業的大規模投資。美國食品和藥物管理局（FDA）已經批准了六種CAR T細胞產品，包括用於大B細胞淋巴瘤（LBCL）、B細胞急性淋巴細胞白血病（B-ALL）、濾泡狀淋巴瘤和其他12種病症的治療。在關鍵的臨床試驗中，CD19-CAR療法在LBCL的二線治療中表現優於標準護理療法（SOC），並且作為一線治療非常有效，為其在早期疾病階段的應用鋪平了道路。現在，針對CD19的CAR療法已經不再是唯一選擇。有兩種針對BCMA（又名TNF受體超家族成員17）的CAR T細胞療法已經獲得了美國食品藥品監督管理局（FDA）的批准，用於治療多發性骨髓瘤。此外，還有針對其他目標的CAR療法在治療其他類型的白血病和淋巴瘤中也展示了很高的效果，包括CD22、CD30、CD7、CD20和GPRC5D。為了降低CAR T細胞治療的風險，現在已經有標準的毒性評估和管理流程，使得與CAR T細胞治療相關的死亡率得以降低雖然我們在CAR-T細胞療法上取得了一些進展，但仍有很多問題需要解決。對於接受商業化CAR-T細胞治療的B細胞癌症患者來說，只有不到一半的人能得到持久的疾病控制。在實體腫瘤的治療上，CAR-T細胞療法雖然顯示出一些有效性，但是持久並且一致的高效反應的證據仍未明確。此外，從患者體內提取細胞製備CAR-T細胞的過程既耗費時間又需要大量資金，而現在的商業化生產能力還無法滿足所有的臨床需求。該綜述闡述了對CAR-T細胞免疫生物學的當前理解，強調了癌症中的耐藥機制、設計原則，以及增強療效的新興方法。我們主要關注開發用於癌症治療的CAR T細胞，但許多原則與其他用於癌症的免疫細胞療法和開發用於非惡性疾病的細胞療法的新興嘗試有關。

CAR-T免疫生物學及其耐藥機制

許多團體長期廣泛地致力於為癌症開發免疫細胞療法，這些努力對於CAR-T療法的成功至關重要（圖1）。CAR是由Eshhar和他的同事們發明的，目標是利用自然T細胞的擴張、殺傷和持久性，同時克服T細胞受體（TCR）的主要組織相容性複合體（MHC）限制，以實現更廣泛的治療適用性。經過許多集團的反復優化，一個融合了scFv作為抗原結合域、鉸鏈/跨膜域、TCRζ和CD28或4-1BB共刺激末端結構域的受體，最終成為了CAR的原型（圖2）。這種結構被FDA批准的六種藥物中的五種採用，而第六種藥物則在保持同樣的結構的基礎上，使用兩個納米抗體重鏈（Vhh）作為抗原結合區。1.5-2.2千基對（kb）的受體的抗原結合過程在很大程度上複製了自然T細胞中由TCR-CD3複合體介導的抗原特異性啟動和殺傷，然而，CAR T細胞和自然T細胞的生物學之間存在顯著差異，這為這些治療劑的應用提供了機遇和挑戰。

由於抗原調節產生的耐藥

CAR和TCR信號傳導之間的一個主要區別是，CAR需要更高的抗原密度才能完全啟動T細胞。儘管單鏈變數片段（scFvs）與TCRs相比具有更高的親和力，並且CAR的表達密度通常比TCR-CD3複合體高，但TCRs對每個抗原呈現細胞中不到100個肽就可以完全引發啟動，而CAR則需要每個目標細胞上有超過1000個目標分子。這種差異的原因包括CAR對近端激酶招募的減少，免疫突觸的發展程度較低，共受體的參與程度減少，以及對下游負調節因數的更大誘導，其中部分與強直信號有關，其中CAR的聚集，通常由scFv驅動，誘導抗原無關的啟動。CAR原型設計的修改在一定程度上可以調整抗原密度閾值，其中調節信號強度、scFv親和力、CAR表達密度、鉸鏈/跨膜結構和突觸間距的特徵都會產生重要影響（圖2）。由於更大的信號強度降低了抗原密度閾值，因此增強T細胞適應性的特徵，無論CAR設計如何，也會降低CAR抗原密度閾值。這些見解對於開發安全有效的CAR T細胞療法至關重要，因為毒性和有效性與靶向抗原的表達特性密切相關。靶向那些對生命至關重要的組織中不存在的分子的CAR，例如B細胞系列抗原，應被設計為在低抗原密度下啟動，以降低低抗原復發的風險，而靶向那些在癌症中高度表達但在重要的組織中表達低的分子的CAR，應被設計為具有更高的抗原密度閾值，以利用基於差異抗原密度的治療視窗。

抗原調節是B細胞惡性腫瘤中CAR T細胞失去作用的主要原因，而在實體瘤中，大部分可靶向的抗原都表現出顯著的異質性，這可能會帶來更大的挑戰。在兒童和青少年的B細胞急性淋巴細胞白血病(B-ALL)中，約50%的復發與CD19喪失有關，而在大B細胞淋巴瘤(LBCL)中，約30%的復發為CD19陰性，另有30%的復發在商業化CAR的抗原密度閾值以下表達CD19。多發性骨髓瘤中BCMA-CAR T療法對抗原變化的抵抗作用定義不明確。基礎的BCMA表達水準在患者中異質性大，且與臨床反應無關。BCMA喪失 — 與基因突變和缺失相關 — 是抵抗的罕見原因（不到5%的病例），然而，在BCMA-CAR治療後可觀察到抗原調節。抗原密度可以通過各種機制進行調節，包括基因突變、RNA選擇性剪接、細胞譜系轉換、表觀遺傳、轉錄後機制、胞啃作用、超糖基化以及抗原脫落。一些目標的下調可以通過小分子藥物進行治療干預，如用bryostatin來上調CD22，用 azacitidine來上調CD70，以及用γ-分泌酶抑制劑來上調BCMA，這些藥物能抑制抗原脫落。

T細胞功能低下導致耐藥

CAR T細胞抵抗的第二個主要原因與T細胞的效能、持續性、功能持久性和/或功能障礙不足有關，這通常與在沒有抗原調節的情況下疾病復發有關。功能障礙通常是由T細胞耗竭引起的，這是通過全域轉錄和表觀遺傳重程式設計引導的終末分化的結果。在T細胞收集、製造的CAR T細胞產品中，有時可以觀察到T細胞耗竭，而經過高腫瘤負荷後也會誘導耗竭。CAR結構中的內部因素也會導致耗竭，其中共刺激領域起主要作用。與4-1BB和第一代CARs相比，CD28協同刺激的CARs表現出更快更大的擴增，分泌更多的炎性細胞因數，而且由於T細胞耗竭，其存在的時間相對較短。在某些情況下，4-1BB和第一代CARs可能可以持續存在數年。在存在強直信號（tonic signalling）的CARs中，CD28協同刺激結構域對於加速T細胞耗竭的影響尤為顯著。強直信號的影響取決於信號的強度，並且與環境有關，一些CARs在存在強直信號的情況下可以表現出更好的功能和持久性。通過在CD3ζ或CD28結構域中進行突變，降低基於CD28的CARs的信號強度，可以減輕其對T細胞耗竭的傾向，從而提高其持久性。值得注意的是，最近一項長期跟蹤研究表明，長壽的CARs都是CD4陽性的，這引發了一個設想：這一亞群可能更不容易耗竭，從而展示出更高的持久性。

CD28與4-1BB協同刺激的CARs存在時間較短的臨床效應因疾病而異。在大B細胞淋巴瘤（LBCL）中，腫瘤的消除發生得非常快，CD28和4-1BB協同刺激的CAR T細胞表現出類似的療效。然而，在B細胞急性淋巴細胞白血病（B-ALL）中，CAR T細胞的存在時間超過6個月與復發率增加有關——因此，除非患者在CAR治療後接受骨髓移植以鞏固緩解狀況，否則CD28協同刺激的CAR T細胞的效果較差。在多發性骨髓瘤中，抗BCMA-CAR T細胞的功能持久性與回應時間的延長相關。目前還不清楚對於實體瘤來說，是更偏好CD28還是4-1BB的協同刺激，因為強烈的信號強度和持久性都是desirable。同時包含CD28和4-1BB協同刺激結構域的CARs並未表現出優勢，這使得研究人員開始嘗試整合新的或者合成的協同刺激結構域，目標是賦予最大的信號強度和持久性。通過CAR的合併篩選，已經用來識別最佳的CAR信號結構域和設計，並闡明CAR設計原則。全基因組CRISPR篩選已經確定CD2-CD58軸作為T細胞效能的介導者，並已證明IFNγR信號傳導在實體瘤中（而非液態瘤）對於CAR T細胞的粘附和細胞毒性是必需的。CAR T細胞的效能也受到腫瘤微環境（TME）中的免疫抑制分子（TGFβ、IL-10、IL-6和檢查點分子）的限制，目前正在進行的工作包括將CAR T細胞療法與免疫調節劑結合，旨在啟動TME內的免疫應答，並賦予免疫細胞抵抗特定的免疫抑制介質的能力（見box1）。

轉運受損與局部給藥

另外，受損的到達腫瘤部位的運輸可能也會限制CAR T細胞的效果，特別是在實體瘤中。在中樞神經系統腫瘤的預臨床模型中，腫瘤內或腦室內（ICV）給藥已經顯示出改善療效，局部劑量大約降低十倍就能達到與靜脈給藥相同的效果。幾項臨床試驗已經證明了將CAR T細胞局部區域性地輸入到中樞神經系統的安全性，對於一位多形性膠質瘤患者，ICV輸送的IL-13Rα2 CAR T細胞誘發了完全反應，而腫瘤內給藥則未見有效。在一項對彌漫性中線膠質瘤患者的研究中，ICV輸送的GD2-CAR T細胞誘發了抗腫瘤效果和臨床反應，並且重複給藥與持續的益處相關，這提出了一個可能性，即向中樞神經系統的輸送可能消除免疫敏化，這可能限制了多劑量靜脈CAR T細胞方案的有效性（ In a study of patients with diffuse midline gliomas, ICV delivery of GD2-CAR T cells induced antitumour effects and clinical responses, and repeated dosing was associated with sustained benefit, raising the prospect that delivery to the central nervous system may abrogate immune sensitization, which has probably limited the effectiveness of multidose intravenous CAR T cell regimens.）。在涉及胸膜的肺癌患者中，間皮素-CAR T細胞的區域遞送與PD-1阻斷相結合，介導穩定的疾病和代謝反應。另外，正在研究的策略是讓T細胞自身產生IL-7和CCL19，以改善它們對腫瘤微環境的定位和在其中的持久性。

下一代CAR-T細胞

本節將討論用於克服腫瘤抗性機制、增強免疫細胞活力、提高特異性、調整CAR信號、提高安全性和增加抗原敏感性的各種下一代平臺。

減少抗原逃逸

雙特異性CAR靶向可通過施用混合細胞產品、兩個受體的雙區表達、兩個scFvs併入一個受體或多個CAR的共同轉導來實現，每種方法都帶來了機遇和挑戰。共同輸注（co-infusion）在經濟、人力和細胞資源上都需要大量投入，而共同轉導（co-transduction）會生成多樣性的產物，這種情況下可能會出現某一亞群體在輸注後主導整個細胞群體，從而產生風險。雙區表達可能會導致蛋白表達降低，在一項臨床試驗中，雙區表達的CAR-T顯示出有限的持久性。已經報告了幾項針對CD19加CD20或CD22的雙特異性受體的試驗，在其中一項中，該受體對CD22的效力降低，而且腫瘤細胞變種顯示出CD19的表面表達量低或無表達。FDA近期批准的BCMA-CAR（雙特異性駱駝抗體胞外域結合部位抗原受體）cilta-cel，包含在一個受體中的兩個串聯Vhh結合物，它們可以結合到BCMA上的兩個不同的表位。cilta-cel的臨床結果顯示，83%的患者達到了嚴格完全緩解（sCR），並且在27個月的無進展生存率（PFS）為55%，這是到目前為止使用CARs治療多發性骨髓瘤報告的最高值（表1）。總的來說，多特異性CARs的臨床資料還處於初期階段，但已經展示出安全性和通過減少抗原逃逸來提高效果的潛力。

為降低抗原密度閾值而設計的新型受體也在開發中。Katsarou和他的同事已經表達了一種嵌合的共刺激受體(CCR)，它缺乏cd3ζ結構域，並報告說，CCR的參與在非常低的抗原密度下啟動了CAR-T細胞，防止了臨床前模型中的抗原低逃逸。對非CAR T細胞抗原產生抗腫瘤反應–如在一位患有橫紋肌肉瘤的患者接受CAR T細胞治療後所報導的–可能會減少由抗原調節引起的抗性。有幾種方法正在開發中，以增強先天和適應性免疫（box1），包括CAR介導的免疫刺激RNA RN7SL1的傳遞，共同表達配體或重塑TME的細胞因數，如IL-12、IL-18、CD40L或Flt3L、 設計CAR T細胞以分泌雙特異性T細胞誘導劑（BiTEs），利用CAR T細胞在腫瘤部位的積累，避免BiTE的全身毒性，或使用可能介導更有力的內源性抗腫瘤活性的非傳統免疫細胞。

增強T細胞功能

大量增強免疫細胞的適應性的研究正在進行中（見圖3和box1）。大部分的工作集中在表觀遺傳調控上，部分原因是在一項針對慢性淋巴細胞白血病的CD19-CAR臨床試驗中，有一位異常反應良好的患者，慢病毒整合破壞了TET2基因，這是DNA甲基化的介導者，導致了大量的克隆性T細胞增殖和持續的抗腫瘤反應。同樣地，DNMT3A基因的敲除在預臨床模型中增強了CAR T細胞的抗腫瘤活性。通過過表達轉錄因數來防止耗竭也顯示出了潛力，包括過表達AP-1因數JUN，這增強了T細胞的擴增和持續性，減少了末端分化，降低了抗原密度閾值，這可能是由於信號強度的增加。類似地，BATF轉錄因數的過度表達已經被報導可以增強T細胞的效力。正在開發製造策略，以優化CAR T細胞的表型，朝向幹細胞樣和中心記憶亞群，包括縮短培養時間，抑制PI3K–mTOR–AKT，BTK或酪氨酸激酶信號，以及在促進記憶的細胞因數中培養。

CRISPR介導的基因編輯首次在採用的T細胞療法中臨床應用，在這種療法中，PD-1被從工程化的細胞中刪除，這些細胞被設計來表達NY-ESO-1，一種癌症特異性的TCR轉基因。這些工程化的細胞並沒有顯示出增強的持久性或效力，但該研究證明了該方法的可行性和安全性，並加速了應用基因編輯技術以增強免疫細胞療法的努力。已經有一些基因被確定為候選基因，以增強T細胞的適應性（box1），並且CRISPR介導的T細胞標誌物如CD7和CD5的破壞使CAR T細胞療法能夠用於T細胞惡性病，同時避免了CAR T細胞的溶解（被稱為‘同類殺伐’）。我們預計將有越來越多的臨床試驗活動，將基因編輯的免疫細胞整合到採用的免疫細胞療法平臺中，以增強其效力，擴大可靶向抗原的範圍，並避免免疫敏感化。

為了增強持久性，一些研究人員已經試圖將細胞因數信號整合到CAR受體中，或者轉基因表達細胞因數，包括一個臨床試驗，其中表達CAR的自然殺傷細胞轉基因表達IL-15顯示出持久的存在。免疫排斥也可能限制CAR T細胞的持久性，因為可以在許多病人體內測量到針對小鼠、人源化或全人scFvs的抗CAR免疫反應。同樣的，臨床經驗顯示，第二次和隨後的靜脈內CAR T細胞的效用有限，可以通過使用淋巴清除方案來改善。這些發現提出了這樣的前景，即正在開發的stealth平臺，能夠通過增強持久性或啟用多次CAR T劑量方案來增強CAR T細胞的效能，從而使現成的異體產品成為可能。

當前正在進行多種努力以解決抑制性的腫瘤微環境（TME）（見Box1），包括基因消融或表達佔優勢的TBGβ、PD-1或Fas受體，以及工程化CAR T細胞分泌檢查點阻斷scFvs。一些研究者已經設計出切換受體，這是一種融合蛋白，能夠將TME中的抑制信號轉換為CAR T細胞中的啟動信號。然而，由這種受體引發的持續啟動信號是否會導致長期的CAR T細胞增強或使它們傾向於耗竭和終末分化，這仍有待確定。此外，也正在探索基於生物材料的方法來增強細胞的擴增和持久性。

CAR調控與可調節平臺

大量的研究工作正在進行，旨在通過調節或抑制CAR信號傳導來提高安全性和效力，以降低毒性和耗竭。這個概念最初是由Eyquem等人提出的，他們使用CRISPR技術將CAR受體敲入TRAC位點，並觀察到由於內源性TRAC調控元件介導的抗原誘導的CAR下調，CAR-T細胞的效力和耗竭有所改善。韋伯和他的同事們利用合成生物學或小分子技術暫時停止CAR信號，當在製造過程中使用時，這種方法能提高CAR-T細胞的效力，在移植後體內應用時，能提高抗腫瘤效果。

如iCasp9、HSV酪氨酸激酶（HSV-tk）和表位元標籤等”殺手開關”能夠在出現嚴重毒性的情況下清除工程化的細胞，而且，我們已經開發出一種使T細胞對尿苷有需求的無轉基因的安全開關。調節性平臺不僅可以作為可逆的安全開關，還可以調整CAR的信號，從而提供防止T細胞耗竭的休息期，提高T細胞的效力。我們已經開發出眾多的可調節平臺，這些平臺採用了藥物敏感的啟動子、誘導二聚化、分裂式CAR、藥物依賴的啟動劑、蛋白質降解的嵌合物（PROTACs）、化學依賴性降解領域和藥物調控的CAR蛋白質降解等技術。這些系統代表了合成生物學的重大進展，但仍然面臨著關閉狀態下有毒性風險的洩漏活動、開啟狀態下CAR表達或活性減弱以及使用免疫抑制藥物作為調節器的挑戰。

Labanieh等人最近開發了一種蛋白酶調控的Grazoprer誘導的 “藥物ON “平臺，即 signal neutralization by an inhibitable protease (SNIP)，它顯示出無洩漏的活性和完整的功能能力（圖3）。最近，Labanieh等研究者開發了一種新型的受蛋白酶調控的藥物啟動平臺，稱為“SNIP”。該平臺在未被啟動的狀態下沒有殘留活性，並且在被藥物（如Grazoprer）啟動後能全面發揮作用（如圖3所示）。和synNotch系統類似，SNIP能夠降低CAR T細胞的耗竭程度，從而提高其抗腫瘤效果。在一個特定的實驗模型中，通過降低Grazoprer的劑量，研究者能夠調節SNIP-CAR的活性，這樣就能找到一個治療的視窗，在該視窗中，健康的正常細胞可以存活，而表達ROR1的腫瘤細胞則會被消滅。同樣地，Hernandez-Lopez等人改進了synNotch平臺，使其能夠在避免攻擊正常細胞的同時，有效地對付高度表達腫瘤特異性抗原的腫瘤細胞。因此，這種可調節的CAR技術顯示出了在提高療效和減少毒性方面的潛力。

通過布林邏輯增強特異性

B細胞和漿細胞惡性腫瘤特別適合接受CAR-T細胞治療，因為這些細胞高度、均勻地表達的抗原主要在B細胞和漿細胞上共表達，而這些細胞的消耗是可以容忍的。然而，最近的一篇病例報告顯示，一名患者在接受BCMA-CAR T細胞治療後出現了帕金森病症狀，屍檢分析顯示在患者的基底節神經元和星形膠質細胞子集中表達有BCMA。在另一項研究中，單細胞RNA測序分析顯示腦壁細胞上表達有CD19，這提出了一個可能性，即CD19-CAR T細胞治療後的神經毒性可能是由於準確打擊目標細胞所致。這些結果突顯了確定不在重要組織上表達的靶標的挑戰。

到目前為止，由於實體瘤表面缺乏特異性腫瘤標誌物，CAR T細胞療法的應用在實體瘤中仍受限，針對CAIX和CEACAM5的CARs在臨床試驗中觀察到了不可接受的靶向腫瘤外毒性。然而，針對實體瘤的CAR T細胞和其他強效的抗體導向療法的幾項臨床試驗已展現出良好的安全性檔案（表1）。CAR抗原密度高的閾值可能解釋了為何能安全靶向某些已知在重要組織上有表達的抗原，如在神經組織上低表達的GD2。最近一項試驗顯示，針對claudin-18.2的CARs展示了有希望的臨床活性，並與顯著但非劑量限制性的毒性相關，這可能是由於抗原表達局限於胃粘膜中深層的分化上皮細胞，這些細胞對CAR T細胞可能較難接觸。尋找具有足夠差異性表達的可安全靶向的分子，如癌胚表面靶標（oncofetal cell-surface targets），對於將CAR T細胞療法擴展到B細胞和漿細胞惡性瘤以外是至關重要的。然而，隨著實施增強效能和持久性的策略，將需要持續重新評估特定靶標的安全性，如在最近的一項研究中，一個整合了有著優勢負性TGFβ受體的針對PSMA的CAR與致命毒性相關。

包含邏輯門的下一代受體可以通過組合抗原感應更好地區分腫瘤和健康組織，並擴大潛在抗原的範圍（圖3）。Roybal等人開發了synNotch，這是一個IF-THEN電路，包含了一個針對抗原A的受體，一旦接觸，就會觸發針對抗原B的傳統CAR的轉錄。synNotch系統還沒有經過臨床測試，但在臨床前模型中，當腫瘤和易感的重要組織不在一起時，它可以防止目標上、非腫瘤的毒性。Tousley等人開發了一個名為LINK的AND門平臺，它利用了近端TCR信號分子LAT和SLP76，每個分子都融合了一個膜結合的scFv，對一個獨特的抗原進行特異性處理。在一個針對ROR1的模型中，該模型的目標是對腫瘤進行精確定位，但可能對非腫瘤組織產生毒性。在這個模型中，LINK CAR T細胞能夠消除表達兩種抗原的腫瘤，而不會引起與ROR1相關的毒性。然而，接受synNotch T細胞治療的小鼠卻無法承受這種毒性。目前正在開發的其他用於組合抗原定位的方法包括SUPRA和co-LOCKR，它們通過蛋白質開關機制來改變CAR T細胞的靶向性。儘管通過組合抗原識別可能會擴大可供靶向的腫瘤抗原的範圍，但腫瘤因丟失其中任何一種抗原而逃脫的風險可能會增加。另一種提高特異性的方法是使用“與非”邏輯門，該方法包括將啟動性CAR與一種抑制性CAR（iCAR）同時表達，其中iCAR靶向在健康組織上但非腫瘤組織上表達的抗原。目前，“與非”邏輯門的應用尚處於初步階段，且還未在臨床上進行測試。

TCR樣的CAR

以靶向低水準表達的抗原為目標，通過對內源性TRAC基因座進行基因編輯，將內源性TCR的可變區改變為單鏈抗體的不依賴於人類白細胞抗原的TCRs(HIT)。當CD80和4-1BBL以反式形式提供時，靶向CD19的HITS顯示出比原始的CD19-CARS更高的抗原敏感性(圖3)。合成TCR和抗原受體（STARs）具有類似的設計，但沒有敲入TRAC基因座；因此，內源性TCR的特異性得到了保留。其他重定向TCR特異性的方法包括抗體-TCR（AbTCR）平臺，它用Fab片段取代TCRγδ的可變結構域，以及TCR融合構建體（TRuC），它將scFv與CD3亞單位融合。最近對TCR類嵌合受體的比較表明，STAR和HIT受體能重現TCR抗原的敏感性，而TruCs卻不能。與天然T細胞相比，CAR T細胞的一個潛在缺陷是不能靶向細胞內抗原，因為大多數導致癌症的異常蛋白都是細胞內的。Yarmarkovich等人克服了這一點，開發了一種針對MHC(PMHC)呈現的多肽的CAR。他們利用了一種能特異性識別並結合在神經母細胞瘤中過度表達的PHOX2B肽-MHC複合體的scFv結合子，這使得他們能夠針對多種HLA等位基因的pMHC進行靶向。這種策略可能大大擴展CAR T細胞治療的目標範圍，包括關鍵的癌症驅動因素。

增加可及性和效率

人們正在採用各種方式，目的是擴大細胞治療的應用範圍，降低其生產成本，研製出可以抵抗排斥的隱形免疫細胞，並充分利用其他免疫細胞的獨特特性。

分散式製造和同種異體產品

隨著工程技術的進步，自動化封閉系統的製造已經實現，這為現場製造打開了新的可能，從而減少了中心化製造模式（即行業標準）帶來的成本、延誤和物流問題。最近的一項多中心研究證實了現場製造細胞的安全性和效能。目前，確定現場製造的監管要求尤其受到關注，特別是針對罕見病，如兒童癌症的治療。

通過利用來自健康的’超級捐贈者’製造異源性CAR T細胞，我們有可能提升治療效力，避免已存在的T細胞功能障礙，同時降低生產成本和物流難題，從而提高治療的普及性。然而，異源性T細胞療法面臨著要克服TCR介導的GVHD風險以及宿主免疫系統可能對移植細胞產生的排斥反應。雖然基因編輯技術可以消除內源性TCR，從而消除GVHD的風險，但要使細胞具有避開免疫排斥的隱形特性依然是一大挑戰，因為CD8+細胞、CD4+細胞、自然殺傷細胞和巨噬細胞均有可能對異源性細胞產生排斥，每種細胞的調控機制都不同，因此需要進行多種優化措施（詳見Box 1）。例如，敲除β2-微球蛋白可以消除HLA-I類的表面表達，但這反而可能增加自然殺傷細胞的排斥風險。此外，誘導異源性耐受的策略包括敲除CIITA基因消除MHC II類表達，以及通過過表達HLA-E和CD47來減少自然殺傷細胞和巨噬細胞對細胞的排斥。

大量異源性策略都採用了CRISPR-Cas9技術，而當用單一的生產過程製造成百上千的異源產品時，基於CRISPR的突變事件的風險可能會被放大。由於它們很可能因為沒有雙鏈DNA斷裂而降低了風險，基因編輯和primer編輯等替代平臺可能會逐漸成為以核酸酶為基礎的基因編輯的更好選擇。另外，以RNA為目標的CRISPR-Cas系統也可以為多重基因敲除提供機會，與RNA介導的干擾相比，其特異性和效率更高。儘管包含多重基因編輯的異源供體細胞可能具有重大優勢，但這些技術仍處於初期階段，其毒性特性尚未明確。有些研究團隊嘗試通過增強宿主的免疫抑制來防止免疫排斥，他們使用傳統的化療或免疫抑制抗體，而這些抗體的靶點則從CAR T細胞中被編輯掉。這種策略的初期回應率令人充滿希望，但其長期安全性和有效性尚未得到證實，且對於與強烈的免疫清除方案相關的感染風險的擔憂依然存在。

可替代的免疫細胞

包括自然殺傷細胞、iNKT細胞、γδ T細胞和巨噬細胞在內的多種非T免疫細胞顯示出天然的抗腫瘤活性，並且不會誘導GVHD，這為他們可能提供一種減輕毒性、增強腫瘤遷移能力，或者通過天然識別腫瘤來針對抗原陰性變體的即用型細胞源提供了可能性。然而，異源性天然免疫細胞仍容易被排斥，如果這些細胞未經精心設計以降低被識別概率，這就引發了人們對其效果持久性的擔憂。臍帶血衍生的異體自然殺傷細胞結合異位表達的IL-15，在一期試驗中顯示出治療NHL和CLL的前景。在小鼠模型中，iNKT-CAR細胞通過部分激發宿主CD8細胞對腫瘤抗原的反應表現出活性，並且其在一項針對神經母細胞瘤的初級臨床試驗中已經顯示出安全性和可能性。此外，工程改造後能表達CD20-CAR的γδ T細胞在早期研究中也表現出了顯著的活性。儘管在巨噬細胞中表達CAR需要對載體和信號域進行大量調整，但是預實驗模型已經證明其具有增強吞噬、改變腫瘤微環境和吸引T細胞等抗腫瘤效果，其中，以CD3ζ為基礎的CAR與以Fcγ為基礎的CAR顯示出相似的吞噬活性。現在，人們也在努力研發誘導多能幹細胞（iPS）衍生的CAR T細胞、自然殺傷細胞和巨噬細胞。iPS細胞向自然殺傷細胞的分化特別成功，這些即時使用的療法的臨床測試目前正在進行。而相比之下，iPS細胞分化為具有完全功能的T細胞則更為挑戰性。鑒於iPS細胞衍生產品幾乎擁有無盡的擴張潛力，它們可以實現大規模生產具有多種增強特性的均一細胞產品，包括賦予其隱形屬性、安全開關以及有效性。因此，人們對這些新興平臺的長期安全性和有效性結果充滿了期待。

下一代基因傳遞技術

病毒載體的基因傳遞一直被認為是這個領域的黃金標準，然而病毒載體的製造和鑒定過程既花費高昂又耗時。目前，正在研發無病毒的基因傳遞平臺，雖然DNA範本對T細胞具有毒性，且這種方法的效率仍然不如病毒載體，但已經通過在人T細胞中使用基於CRISPR的基因傳遞來證明了這個原理。臨床可行性已被證實，通過將CD19-CAR特異地傳遞到PD-1位點，引發了NHL中的高CR率，儘管這個製造過程並未能滿足相當大一部分患者的劑量要求。改良DNA範本和小分子抑制劑混合液正在提高基因插入的效率和細胞產量。轉座子基因傳遞方法也已經被使用，然而有兩個病例報告使用Piggybac轉座子平臺進行高拷貝數的整合後，CAR工程T細胞發生了惡性轉化。體內基因傳遞是一種新興的方法，能提高可訪問性並降低成本。在這種方法中，DNA或RNA通過病毒載體或納米顆粒進行系統性傳遞，這些納米顆粒能優先靶向並在體內轉化免疫細胞群。但是，由於病毒載體可能引發中和抗體，其免疫原性可能限制其重複使用。已經證明，在小鼠中使用靶向CD3的脂質納米顆粒可以穩定表達CD19-CAR，而且含有優化RNA的T細胞靶向脂質納米顆粒在小鼠模型中減少了心臟纖維化。

用於非惡性疾病的CAR療法

雖然CAR T細胞平臺已經被優化用於癌症治療，但是應用於CAR T細胞的設計原則和廣泛的合成生物學工具箱為將此治療方法擴展到包括自身免疫性疾病、衰老、纖維化和傳染性疾病在內的非惡性疾病提供了可能性。在臨床前研究中，CD19-CAR T細胞已在系統性紅斑狼瘡中顯示出有益效果，且有病例研究報告了CD19-CAR療法在一個難以治療的狼瘡性腎炎患者中的持久效果。嵌合型自身抗體受體（CAARs）是原型CARs，它們中包含針對自身反應性B細胞克隆的特異性決定簇（idiotype）的scFv，或者使用自身抗原作為識別領域。臨床前研究中，CAARs已在天皰瘡治療中展示了療效，臨床測試也正在進行中。採用調節性T細胞（Treg細胞）作為替代方法來治療自身免疫性疾病，這種細胞主要發揮抑制作用，而非毒殺作用。非工程化的Treg細胞在移植物抗宿主病（GVHD）、異種移植、1型糖尿病、系統性紅斑狼瘡和多發性硬化症的小鼠模型中已經表現出了活性，早期臨床資料也顯示了這種方法的可行性和良好的安全性。與非工程化細胞相比，表達針對疾病組織上表達的抗原的CAR的Treg細胞顯現出了更強的特異性和效能。最近的研究資料顯示，無意中擴展CAR Treg細胞的數量已經限制了商業CAR T細胞的效果，這為CAR工程化Treg細胞的實用性提供了原理驗證。目前，人們正在嘗試通過工程化FOXP3表達來強化其譜系穩定性，並引入安全開關以減少相關風險。在血友病小鼠的最新預實驗資料中，研究人員發現表達了針對因數VIII的CAR和FOXP3的Treg細胞能夠阻止中和抗因數VIII抗體的產生。此外，針對尿激酶型纖溶酶原啟動物受體的衰老細胞殺傷CAR T細胞已經被證明能在體外靶向衰老細胞，並在肝纖維化模型中恢復組織的穩態。針對成纖維細胞活化蛋白（FAP）的CARs在心臟纖維化的小鼠模型中已經提高了心臟功能，並且利用裝載有mRNA的CD5導向脂質納米粒子在體內生成的FAP-CARs也顯示出有益效果。在這個模型中，mRNA的非整合特性確保了CAR表達是暫時性的，因此減輕了因廣泛清除活化成纖維細胞所帶來的毒性風險。

對於部分目前沒有有效療法的疾病來說，間充質乾細胞 (MSCs) 的免疫調節和再生特性使它們成為可能的替代治療選擇，但經過許多臨床試驗的結果發現，間質乾細胞 (MSCs)的注射可能導致輸注毒性和細胞排斥等問題。為瞭解決與基於細胞的治療相關的這些問題，科學家們後續開發了 MSC 外泌體療法，也觀察到有希望的臨床治療效果。

MSC及外泌體 (Exosome)

MSC 外泌體是由 MSC 分泌的納米級囊泡，是一種非細胞治療劑。MSC 外泌體保留了它們起源的細胞的治療特徵，包括遺傳物質、脂質和蛋白質。外泌體與 MSCs 類似，外泌體可以誘導細胞分化、免疫調節、血管生成和腫瘤抑制。因此，MSC 外泌體已被用於多種實驗模型和臨床研究。

間質乾細胞（MSCs）由於其乾性而具有獨特的生物醫學特性：它們可以模擬自身增殖並可以分化成多系細胞。由於主要組織相容性複合體 (MHC) I 類分子的低表達和少數 MHC II 類分子的表達，MSCs 具有低免疫原性。重要的是，MSCs 已被證明在各種疾病模型中具有免疫調節和再生功能。鑑於這些特性，MSCs 已在數十年的臨床試驗中進行了評估 。儘管使用 MSCs 的一些臨床前研究和臨床試驗的結果看似很有希望，但在其他研究中，MSC 治療後臨床結果通常沒有顯著改善疾病嚴重程度，這使得基於 MSC 的治療存在爭議 。

MSCs 影響的這些差異可能是由於注入的 MSCs 植入不良，供體依賴性變異，或由於細胞在微脈管系統中的駐留而可能導致的輸注毒性 。此外，MSCs 在體外擴增過程中的衰老會降低細胞的生產能力，並且會通過引起炎症來增加疾病的嚴重程度。為了保證一致和穩定的治療效果，需要改進 MSC 治療策略，策略應考慮當前的障礙，例如體內存活率低、發炎病變的遞送不准確以及供體間的差異。研究人員試圖通過改善 MSCs 向病灶的遷移並用生物活性分子如 IFN-γ 和 TNF-α對它們進行預處理來增強 MSCs 的治療效果]。此外，包括支架和水凝膠在內的共同給藥策略的使用使疾病治療更加謹慎和準確。改善基於 MSC 的治療的另一種方法是使用細胞外囊泡 (EV) 或外泌體 。

從原核生物到真核生物，在細胞之間藉由釋放的EV來傳遞生物信號參與細胞間通訊。根據它們的生物起源，EV 分為三大類：外泌體( exosomes)、微泡(microvesicles)和凋亡小體(apoptotic bodies) 。外泌體的最小尺寸範圍約為 50 至 150 nm，當多泡體(multivesicular)與細胞膜融合時，外泌體被釋放到細胞外環境中。這些納米大小的囊泡含有許多細胞成分，包括細胞因數和生長因數、信號脂質以及 mRNA 和調節性 miRNA，外泌體的成分根據其細胞來源而有所不同。值得注意的是，MSC 外泌體可能比 MSC 更適合臨床應用。MSC 外泌體可能沒有免疫原性問題，並且不太可能像注入的 MSC 一樣被困在肺或肝臟中，同時仍保持其來源細胞的治療功能。鑑於 MSC 衍生的外泌體在臨床前研究中的治療潛力已得到證實。

MSC 外泌體的治療特性

間充質乾細胞已被評估為多種罕見疾病的替代療法，因為它們具有免疫調節活化免疫細胞和刺激組織再生的能力。兩種主要的細胞行為是其治療效果的基礎：直接細胞介導的作用和可溶性因數釋放引起的環境變化 。MSC分泌蛋白組是指釋放到培養基中的可溶性因數，在釋放的物質中，微泡（MV，直徑 0.1-1 mm）和外泌體（直徑 50-150 nm）作為 MSCs 和靶細胞（包括 MSCs）之間的細胞間介質發揮作用。納米級外泌體(Nanosized exosomes)特別被認為是 MSC 替代品，因為它們具有與 MSC 相似的治療特徵。外泌體可能比 MSCs 具有更大的臨床應用潛力，因為它們具有較低的免疫原性和致瘤性 。因此，MSC外泌體的使用為MSCs的臨床應用開闢了新的途徑。

MSC（間充質乾細胞）外泌體的組成和治療功能。來自 MSCs 的外泌體可能含有生長因數、細胞因數、DNA、脂質、mRNAs、miRNAs 和 mtRNAs。與其起源的細胞相似，MSC 外泌體具有治療特性，包括刺激細胞遷移和細胞外基質合成、抗凋亡作用、免疫調節和抗炎作用以及刺激膠原蛋白沉積。由於這些獨特的治療特徵，MSC 外泌體治療的可行性目前正在幾項臨床研究中進行評估。

MSC 衍生的外泌體最重要的特性是它們的“(載貨cargo)”功能，它們包含多種經過驗證的治療劑，MSC外泌體的內容包括核酸、蛋白質和脂質，描述了超過850個基因產物和150個miRNA 。此外，它們的組成可能會因 MSCs 的分離來源和外部刺激而有所不同，這也是不同來源的 MSCs 表現出不同特徵或治療效果的原因之一 。儘管來自不同 MSC 來源的外泌體的特徵可能有所不同，但它們通常具有治療作用。MSC 外泌體將其內容物（如 mRNA、miRNA 和蛋白質）水準轉移到靶細胞中，以改變這些細胞的細胞功能 。儘管 MSC 外泌體內吞作用的機制尚未完全闡明，但包括囊泡-細胞融合、吞噬作用、微胞飲作用和/或受體介導的內吞作用在內的幾個細胞過程被認為與內化(internalization)有關 。

在臨床前研究中已經描述了 MSC 外泌體的幾個臨床特徵。例如，MSC 外泌體通過調節內源細胞的增殖和凋亡來加速組織再生過程。MSC 外泌體也影響一些免疫細胞的命運決定，從而促進過度炎症的減弱或恢復免疫穩態 。此外，MSC 外泌體通過刺激各種細胞信號通路誘導血管生成。鑑於這些有希望的結果，MSC 外泌體應用的安全性和有效性目前正在針對各種疾病的臨床試驗中進行評估。以下，我們根據疾病類型回顧 MSC 外泌體的治療潛力。

免疫相關疾病

MSCs 和 MSC 衍生的外泌體最重要的臨床特徵是它們的免疫調節功能。免疫相關疾病通常是由於免疫系統的失衡以及隨後身體對特定類型免疫反應的偏向啟動的反應。MSC 外泌體作為 MSC 介導的各種免疫細胞免疫調節的主要介質引起了人們的興趣。來自 MSCs 的外泌體在調節各種免疫細胞亞群和隨後促進免疫穩態中發揮作用，就像它們的起源細胞一樣。MSC 外泌體已被證明對活化的免疫細胞具有抑制功能，包括效應 T 細胞、小膠質細胞 、巨噬細胞和 NK 細胞。相比之下，MSC 外泌體有助於向調節型免疫細胞（如耐受性樹突細胞、M2 巨噬細胞和調節性 T 細胞確定譜系，從而促進免疫系統穩態。臨床前研究證明的調節功能激發了針對各種自身免疫性疾病的臨床試驗。

MSC 外泌體有效抑制 Th1 細胞的過度增殖和活化。例如，在動物移植物抗宿主病 (GvHD) 模型中，表達 CD39 的 CD4 ^{+ Th1}。此外，針對 GvHD 的治療功能已在人體研究中得到證實 。根據先前使用接觸超敏反應 (CHS) 模型小鼠的研究，輸注來自臍帶衍生的 MSC (UC-MSC) 的外泌體導致 Th1 細胞水準降低，隨後分泌 IFN-γ，同時 Treg 誘導增加。EV 的內化也被證明與信號轉導和轉錄啟動因數 1 (STAT1) 的表達降低有關，STAT1 在 Th1 細胞發育中起著至關重要的作用 。

MSC 外泌體還可以抑製過度的過敏性炎症，據報導，輸注源自脂肪組織來源的 MSC (AT-MSC) 的外泌體通過改善病理症狀和肥大細胞浸潤到皮膚病變中來緩解特應性皮炎 (AD) ，由於抑制第 2 組先天淋巴細胞 (ILC2) 通路或促進 Treg 群 。鑑於這些臨床前發現，MSC 外泌體的臨床潛力目前正在四種不同的免疫疾病中進行評估。

大約 35-50% 的患者在異基因造血幹細胞 (HSC) 移植後患有 GvHD，這是由捐贈的造血幹細胞將受體身體系統視為外來並攻擊它們引起的。慢性 GvHD (cGvHD) 的特徵是皮疹、腹部腫脹、眼睛乾澀、視力改變、氣短、肌肉無力和關節緊繃 。在這些症狀中，乾眼症是最常見的，發生在 40-76% 的患者中，其嚴重程度可以反映疾病的預後。乾燥性角結膜炎是由淚腺周圍的淋巴細胞浸潤引起的，導致組織退化和功能障礙。由於皮質類固醇或環孢菌素 A 等免疫抑製劑非特異性抑制免疫系統，並不適用於所有患者，因此 MSC 已被視為治療 cGvHD 乾眼症的替代療法 。2019年12月註冊了一項評估臍帶間充質乾細胞（UMSC）外泌體緩解乾眼症狀療效的臨床試驗（NCT04213248）。值得注意的是，該試驗的目的是分析疾病指標的反應，例如眼淚量和對組織的損傷程度，以滴眼劑形式應用外泌體而不是血管內註射的外泌體治療。

第一型糖尿病 (T1DM) 是另一種眾所周知的自身免疫性疾病，需要終生管理，症狀包括體重減輕、疲憊、皮膚發癢和視力模糊。體內的免疫細胞以未知原因攻擊胰腺β細胞，對胰島素產生和隨後的葡萄糖代謝產生不利影響。由於目前還沒有特定的治療方法，T1DM 患者需要每天注射胰島素或安裝胰島素泵以維持血糖水準的正常範圍 。為瞭解決缺乏治療 T1DM 特異性藥物的問題，據報導Nojehdehi 等人利用來自 AD-MSCs 的外泌體通過增加脾臟中的 Treg 數量和再生胰島，在鏈脲佐菌素誘導的 T1DM 小鼠模型中具有治療作用 。來自月經 MSCs 的外泌體在大鼠模型中顯示出相似的治療潛力。目前正在進行一項臨床試驗，評估重複靜脈輸注 UCB 血液來源的 MSC 外泌體對 T1DM 的影響（NCT02138331）。

除了這些自身免疫性疾病，MSC 外泌體已被證明可以緩解實驗性牙周炎。牙周腔內的菌群失調會促進牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿菌等病原微生物群的生長，從而在這些自身抗體侵入循環系統和各種器官後促進自身抗體的產生和宿主免疫反應的破壞。據報導脂肪組織來源的 MSC (AD-MSC) 外泌體在牙周韌帶和組織再生中發揮支持作用 。在一項臨床研究中，正在評估自體施用 AD-MSC 外泌體在緩解 18 至 50 歲患者牙齦炎症和組織損傷方面的療效（NCT04270006）。

最後，多器官功能障礙綜合徵 (MODS)，心血管手術後導致死亡的術後並發症，正在用從 UC-MSCs (NCT04356300) 中分離出來的外泌體進行治療。促炎細胞因數 IL-6 通常被用作 MODS 的預後指標，因為 IL-6 是響應組織損傷和炎症刺激而釋放的 。評估 MSC 外泌體的安全性和有效性、短期和長期免疫反應、IL-6 濃度（早期 3 天）和過敏反應，包括皮疹、瘙癢和過敏性休克（長達 6 個月）以及器官衰竭評估分數正在調查中。

傷口癒合

來自各種 MSCs 的外泌體已被證明可以加速傷口修復。儘管傷口癒合是一種複雜的生理現象，但 MSC 外泌體通過促進皮膚細胞成分的增殖、分化、定位 和誘導免疫細胞的分化來促進恢復過程。皮下施用源自 iPSC-MSCs 的外泌體已被證明可通過促進成纖維細胞分泌 I 型和 III 型膠原蛋白和彈性蛋白來加速動物模型中的傷口修復 。此外，移植的 MSC 外泌體不僅在血管生成中發揮關鍵作用，而且在傷口部位血管的成熟以促進癒合過程。

大皰性表皮鬆解症 (EB)是一種以皮膚脆弱和對機械性創傷起水泡為特徵的疾病，有 30 種不同的亞型。在疾病亞型中，由 VII 型膠原 (COL7A1) 基因突變和隨後缺乏蛋白質產生引起的隱性營養不良性大皰性表皮鬆解症 ( RDEB ) 可以通過骨髓來源的 MSC (BM-MSC) EV 得到緩解，因為它們捐贈了自己的類型VII 膠原蛋白並誘導宿主成纖維細胞產生這種蛋白質。鑑於這些有希望的結果，啟動了 I/IIA 期臨床研究，以測試異基因 MSC 外泌體在 EB 中局部應用的安全性和可行性。將在 10 名參與者 (NCT04173650) 中評估劑量限制性毒性和傷口大小衰退。此外，另一項使用 BM-MSCs 的前瞻性臨床研究報告稱，靜脈輸注耐受性良好，長達 12 個月沒有嚴重並發症，並且 EB 症狀在 2 個月內短暫緩解 (NCT02323789)。

除了皮膚和表皮傷口，MSC 外泌體也已應用於其他器官的傷口癒合。特發性黃斑裂孔 (MH) 可導致高度近視眼視網膜脫離 。儘管大多數患者使用通過玻璃體切除術 (PPV) 進行的手術治療來治療這種情況，但那些患有特別大且持續時間長的 MH 的患者在標準 PPV 手術後預後較差。 因此，已經探索了促進 MH 功能和身體恢復的替代或輔助工具。 據報導，七名患者中的六名（兩名接受MSC外泌體治療的患者和五名在手術後通過玻璃體內註射使用臍帶衍生的MSC外泌體治療的患者）顯示出完全的黃斑閉合，而通過最佳矯正視力評估的五名患者顯示出改善的視覺功能。 BCVA) ，臨床研究的主要結果測量 (NCT03437759)。

神經系統疾病

在承認移植細胞難以遷移到現有神經網絡並且其治療效果是由異質 EV 的分泌協調後，幹細胞治療的重點已從直接的細胞間相互作用轉移到旁分泌相互作用 。此外，修飾分子以使它們能夠穿過血腦屏障（BBB）的進展使外泌體成為神經疾病和精神障礙的治療候選者。Alvarex-Erviti 等人開發了載有GAPDH siRNA的神經元靶向外泌體，靜脈注射這些外泌體會導致神經元細胞中的特定基因敲除 。鑑於有證據表明外泌體可以穿過 BBB，Xin 等人通過靜脈內途徑將含有 miR-17-92 的大鼠骨髓來源的 MSC 外泌體施用於中風模型，並顯示出增強少突神經發生、神經發生和神經可塑性以及功能恢復。最近，靜脈內給藥的 MSC 外泌體已被修改以靶向大腦的特定區域。

另一個通往大腦的直接通路是鼻腔，該途徑可用於繞過 BBB 將治療劑輸送到大腦 在毛果芸香鹼(Pilocarpine)誘導的癲癇持續狀態小鼠模型中，MSC 衍生的外泌體經鼻內給藥，據報導在 6 小時內到達海馬體，在那裡它們具有神經保護和抗炎作用。佩雷茨等人，評估了 MSC-外泌體鼻內給藥對 BTBR T+tf/J (BTBR) 小鼠（一種公認的自閉症樣行為模型）的影響，並報告了男性與男性的社會互動增加，重複行為減少和母體行為改善，表明減輕自閉症譜系障礙相關症狀的治療策略。鑑於靜脈內遞送的外泌體可以穿過 BBB，洛杉磯神經病學協會的 Jordan 小組啟動了兩項針對顱面神經痛 (NCT04202783) 和神經退行性疾​​病驅動的抑鬱、焦慮和癡呆 (NCT04202770) 的獨立試驗。

心血管疾病

儘管死亡率在過去 20 年中急劇下降，但心血管和循環系統疾病仍被認為是全球主要的死亡原因 。雖然美國的主要死因是心血管疾病，但在中國，缺血性心髒病是心血管疾病的主要原因，導致死亡率居高不下 。由於缺血性心髒病中的心肌細胞丟失，研究人員將注意力集中在再生醫學對預防心血管疾病的重要性上。MSCs 分化成多種細胞類型的能力導致研究 MSCs 作為心臟組織再生和修復的主要細胞治療劑。

儘管 MSC 幹細胞治療的結果很有希望，但仍不清楚它們是如何工作的。弗雷曼等人在急性心肌梗塞後的豬心臟梗塞區，僅觀察到來自靜脈注射的 50 × 10 ^6 個移植細胞的 30,000 個細胞，佔0.06% 。蒂默斯等人表明在豬心肌梗塞後 MSC 條件培養基(conditioned medium)處置保留了心臟功能，這表明 MSC 分泌物可能具有血管生成潛力

鑑於分泌性外泌體的功能取決於它們所含的物質，例如細胞因數、蛋白質、mRNA、miRNA 和 rRNA，因此已經進行了研究以確定其參與心臟再生的關鍵因素。安德森等人，鑑定了 MSC 衍生的外泌體中的 1927 種蛋白質並分析了核因數-kappaB；信號傳導作為 MSC 誘導的血管生成的關鍵介質 。在大鼠心肌梗死模型中，發現 MSC 外泌體的心臟保護作用是由 miR-21 介導的，通過 PTEN/Akt 通路增強細胞存活。最近的一項研究報導，含有 miR-25-3p 的 MSC 外泌體通過降低 EZH2、H2K27me3 和 SOCS3 的表達而具有心臟保護作用，通過靶向促凋亡蛋白和炎症基因來減輕心肌梗塞 。根據 MSC 衍生的外泌體促進中風後血管生成重塑和功能恢復的發現，伊斯法罕醫科大學最近的一項臨床研究正在探索使用裝載 miR-124 的 MSC 衍生的外泌體來改善急性中風患者的血管生成（NCT03384433）

癌症

MSC 衍生的外泌體在癌症治療中的應用已經研究了幾年。儘管關於腫瘤進展的功能存在一些爭議，但一些報導顯示MSC EVs在腫瘤轉移中的抑製作用。2014 年，小野等人發現BM-MSC 外泌體可以抑制轉移性癌細胞增殖，從而通過 miR23b 介導的 MARCKS 抑制促進轉移性乳腺癌細胞的休眠 。MSC 外泌體還可以通過鈣/鈣調蛋白依賴性蛋白激酶 (CaM-K) 和 Raf/MEK/ERK 激酶級聯信號介導胃癌細胞耐藥性發展的變化，這將提高化療的效率 。然而，也有研究發現MSC外泌體會加速癌細胞的遷移和癌症相關通路的表達，包括Wnt信號通路。同樣，MSC 外泌體被證明可誘導胃癌細胞中的上皮間質轉化 (EMT)，並通過上調癌症生長和遷移來增強致瘤性 。在促進癌症生長的背景下，它們的血管生成特性也值得關注。因此，MSC 外泌體癌症治療有時被稱為“雙刃劍”。為了克服這一點，研究人員專注於 MSC 外泌體的貨物功能。例如，用紫杉醇（紫杉醇；PTX）處理的 MSCs 衍生的外泌體顯示出改善的腫瘤抑製作用，與紫杉醇單一處理相比，直接抑制腫瘤細胞生長，濃度可降低 1000 倍 。此外，靶向腫瘤相關基因如 polo 樣激酶 1 (PLK-1) 的 siRNA 可以加載到 MSC 衍生的外泌體中用於膀胱內治療。

因此，含有靶向致癌 Kras ^G12D突變的 siRNA 的 MSC 外泌體正在臨床試驗中用於治療胰腺癌 (NCT03608631)。Kras ^G12D突變是胰腺癌中常見的突變，是一種很有前景的治療靶點。Kalluri 小組已開發出表達 CD47 和 si- 或 sh-RNA 用於 Kras ^G12D的工程外泌體 (iExosomes) 。他們證明 iExosomes 抑制致癌 Kras 並提高胰腺癌小鼠模型的存活率。基於這些發現，需要在臨床試驗中評估 iExosomes 在 Kras ^G12D相關胰腺癌患者中的安全性和可行性。

MSC 外泌體作為 COVID-19 支持性治療

最近，由新型冠狀病毒嚴重急性呼吸系統綜合症冠狀病毒 2 (SARS-CoV-2) 快速廣泛感染引起的 2019 冠狀病毒病 (COVID-19) 已成為對全球公共衛生和世界經濟的最大普遍威脅. 因此，非常需要預防和治療感染的實用方法。與嚴重急性呼吸綜合徵 (SARS-CoV) 和中東呼吸綜合徵 (MERS-CoV) 等其他冠狀病毒類似，SARS-CoV-2 主要針對人類呼吸系統，症狀包括發燒、乾咳、咳痰、疲勞、頭痛, 和呼吸困難。重要的是，與其他冠狀病毒不同，這種病毒會影響下呼吸道，導致肺上葉浸潤和隨後的低氧血症。此外，感染 SARS-CoV-2 的患者偶爾會出現腹瀉作為症狀之一 。SARS-CoV-2 使用其 S 蛋白與宿主肺細胞上存在的血管緊張素轉換酶 2 (ACE2) 受體結合，一旦內化，就會開始自我複制。雖然 CD4 ⁺和 CD8 ⁺分別表達 HLA-DR 和 CD38 的 T 細胞保持啟動狀態，據報導，COVID-19 患者外周血中這些細胞的數量減少了 。SARS-CoV-2 感染會破壞患者免疫系統的功能。失調的免疫效應細胞分泌大量促炎細胞因數（例如，IFN-α、IFN-γ、IL-1β、IL-6、IL-12、IL-18、IL-33、TNF-α、TGFβ）和趨化因數（例如，CCL2、CCL3、CCL5、CXCL8、CXCL9、CXCL10），導致所謂的“細胞因數風暴”。細胞因數分泌增加和隨後被啟動的免疫細胞（如炎性單核細胞和中性粒細胞）浸潤肺組織會引發急性呼吸窘迫綜合徵 (ARDS)，這被廣泛認為是導致 COVID-19 死亡的最關鍵因素之一 ， 因此，迫切需要一種有效的治療方法來預防 COVID-19 誘導的細胞因數風暴。

如上所述，MSCs 或源自 MSCs 的外泌體最突出的特徵是它們的免疫調節能力。MSC 外泌體或 EV 已被用於治療氣道疾病，例如哮喘 、支氣管肺發育不良和ARDS 。MSCs 及其衍生物也被證明可以通過減輕症狀和恢復正常生理功能來有效抑制流感病毒感染。此外，臨床試驗表明，MSC 移植可降低流感病毒引起的肺損傷的嚴重程度並降低死亡率，這表明 MSC 和 MSC EV 在 COVID-19 治療中具有潛在作用。儘管與 MSCs 本身相比，外泌體的生產在技術和經濟上效率低下，但外泌體在治療氣道傳播疾病方面具有優勢，因為與通過靜脈途徑注射的 MSCs 不同，外泌體不會被困在肺部。此外，尺寸約為 100 nm 的外泌體可以通過氣溶膠吸入應用，同時保留其免疫調節功能。由於其獨特的磷脂膜結構，生物活性分子，包括有前途的藥物，可以插入外泌體，通過融合靶細胞膜並將貨物轉移到細胞質中，可以最大限度地發揮其作用。

目前，有四項臨床試驗探索使用 MSC 外泌體作為 COVID-19 感染患者的支持性治療。首例題為“吸入間充質乾細胞外泌體治療重症新型冠狀病毒肺炎的初步臨床研究”旨在探索氣溶膠吸入異基因AT-MSCs衍生的外泌體在重症患者中的治療潛力（NCT04276987）。這種 MSC 外泌體治療的安全性正在另一項臨床研究 (NCT04313647) 中進行評估。由俄羅斯臨床醫生領導的另一項研究正在測試吸入 MSC 衍生的外泌體是否可以抑制免疫系統對病毒的過度反應並刺激再生過程（NCT04491240、NCT04602442）。除了這三項研究之外，使用來自非 MSC 來源的 EV 或外泌體的研究包括供體來源的 COVID-19 特異性 T 細胞 (NCT04389385) 或具有 300 多種來自人類的生長因數、細胞因數和趨化因數的羊膜幹細胞和上皮細胞羊水 (HAF) (NCT04384445) 也在進行中。即使這些正在進行的研究報告了成功的結果，仍然有幾個問題需要解決。值得注意的是，在實際臨床應用之前應解決安全問題，因為據報導 MSC EV 與其來源的細胞一樣具有促凝活性。一項隊列研究表明，重症 COVID-19 患者的症狀之一是高凝狀態; 因此，必須按照血漿交換療法的建議在輸注前去除外泌體貨物中的促凝血因數和過多的促炎細胞因數。此外，為了加快和鞏固臨床前進程，需要完善的疾病模型（例如非人類靈長類動物模型）來評估新療法和潛在疫苗的安全性和有效性。

未來展望

本文根據疾病類型全面回顧了MSC外泌體的治療特點和臨床試驗現狀。儘管臨床前研究報告了許多有希望的結果，但需要對 MSC 外泌體治療進行一些改進才能獲得更好的結果。首先，應在外泌體分離之前評估 MSCs 對特定疾病的適用性。間質乾細胞的基因修飾可以改善來自這些間質乾細胞的外泌體的治療功能。基因改造的主要目標之一可能是 miRNA。miR-143 的過表達提高了 MSC 外泌體對癌細胞遷移和侵襲的抑制功能。除了上面討論的 miRNA 之外，還有許多其他 miRNA 是外泌體遺傳操作的潛在目標。CXCR4 和 GATA-4等具有特定治療作用的蛋白質的過度表達也已被證明可以改善 MSC 外泌體的功能。因此，在對 MSCs 進行基因操作之前，重要的是要確定可以在外泌體中操作以治療特定疾病的精確基因靶點。

其次，通過將靶分子直接遞送到MSC外泌體中來增強MSC外泌體的治療效果。已經開發了多種插入方法，包括被動加載、超聲處理、電穿孔、擠壓和光誘導加載 。正如我們上面所討論的，抗癌藥物已被加載到外泌體中以獲得更好的臨床結果。經研究報導，薑黃素是一種有效的免疫抑製劑，通過將其包裹在外泌體中來提高其抗炎活性。另一種抗炎藥，即 STAT3 抑製劑 JSI124，當通過鼻內途徑以外泌體的形式引入時，可有效抑制神經炎症。除了外泌體介導的藥物遞送，長內源性 RNA 或小幹擾性 RNA 的加載和遞送已被證明可以抑制癌症並導致白血病細胞凋亡。支援材料可用於最大限度地發揮 MSC 外泌體的治療功能。在生物相容性助劑中，各種水凝膠最近引起了人們的關注。在缺血性實驗模型中，含有殼聚醣水凝膠的胎盤衍生的 MSC 外泌體顯示出增強的治療效果，具有體內保留和外泌體內容物（包括蛋白質和 miRNA）的穩定性 。其他水凝膠已被證明可以通過補充物理缺陷來加強傷口修復過程。在類似的情況下，用 MSC 外泌體和支架包裝組織比在骨或子宮內膜再生模型中的初始治療產生更好的結果。此外，用脂多醣等細菌物質預處理 MSCs 可用於開發適用於解決慢性炎症的疾病或類型特異性外泌體。最後，可以與肝細胞受體結合的支鏈澱粉的表面修飾被證明可以通過改善其對受損器官的靶向性來增強 MSC 外泌體的治療效果。

為了使基於外泌體的療法在臨床應用中安全且成功，必須探索所施用的外泌體的生物分佈。目前，有各種研究來評估從不同來源獲得併在不同疾病模型中治療的外泌體的生物分佈。在患有急性腎損傷的小鼠中，5 小時後從損傷部位檢測到靜脈內遞送的 MSC 外泌體，24 小時後檢測不到 。在荷瘤小鼠中，腹腔注射後 24 小時和 48 小時，外泌體在腫瘤區域的積累顯著增加。一般來說，已知靜脈內遞送的外泌體主要在肝臟和脾臟中積累，但是，根據細胞來源和給藥途徑，生物分佈模式可能不同 。在使用外泌體設計治療策略時，必須先仔細考慮 MSC 來源、給藥途徑和生物分佈。

總之，成功的 MSC 外泌體治療各種罕見疾病需要疾病和/或患者定制治療。為此，需要詳細識別每種目標疾病的特徵和發病機制，選擇可行的外泌體貨物，確定調節所選因素的方法，以及改進對病變的遞送。

參考資料: Therapeutic Features and Updated Clinical Trials of Mesenchymal Stem Cell (MSC)-Derived Exosomes