誘導多能幹細胞來源NK細胞腫瘤免疫治療取得新進展

導讀：NK細胞的細胞毒性在很大程度上取決於IgG Fc受體CD16a，其介導抗體依賴性細胞介導的細胞毒性（ADCC）。高親和力和不可切割的CD16（hnCD16）被開發並顯示出多腫瘤殺傷潛力。然而，hnCD16受體啟動單個CD16信號並提供有限的腫瘤抑制。如何利用hnCD16的特性並摻入NK細胞特異性活化結構域是進一步提高NK細胞抗腫瘤活性的有前景的發展方向。

6月14日，北京大學基礎醫學院李揚副教授和北京大學人民醫院趙翔宇教授合作在《Journal of Hematology&Oncology》雜誌線上發表題為“Leveraging CD16 Fusion Receptors to Remodel the Immune Response for Enhancing Anti-Tumor Immunotherapy in iPSC-Derived NK Cells”的研究論文，揭示了該融合受體通過重塑免疫應答以增強NK細胞抗腫瘤功能的機制，並將hnCD16FR在誘導多能幹細胞來源NK細胞（hnCD16FR-iPSC-NK）中進行工程化修飾，證明瞭hnCD16FR-iPSC-NK細胞具有良好的應用前景，可以為以NK細胞為基礎的抗腫瘤免疫療法提供新的策略和選擇。

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC10265820/

研究背景

使用工程免疫效應細胞的過繼細胞療法已成為治療血液學和實體惡性腫瘤的一種很有前途的新方法。在幾種免疫效應物的選擇中，自然殺傷（NK）細胞被證明在對惡性細胞和病毒感染的先天免疫應答中起關鍵作用。特別是嵌合抗原受體（CAR）工程的NK細胞由於其獨特的生物學特性而最近引起了相當大的關注 。與T細胞不同，NK細胞缺乏表面T細胞受體（TCR），不會引起移植物抗宿主病（GvHD），這是同種異體NK細胞療法的關鍵優勢，可實現工程化NK細胞的規模化製造和現成給藥用於癌症免疫治療。評估同種異體NK細胞過繼轉移的臨床試驗表明，這種療法是安全的，幾乎沒有證據表明細胞因數釋放綜合征（CRS）或神經毒性等毒性。此外，自體CAR-T細胞治療在移植後可以持續多年，而同種異體NK細胞通常在宿主中存活的時間較短。同種異體NK細胞的這種特性可能有助於更準確的給藥策略，允許多次組合給藥，並避免長期累積毒性，這在接受CAR-T治療的患者中很常見。

用於癌症免疫治療的NK細胞的來源多種多樣，即外周血來源的NK（PB-NK）細胞，臍帶血分離NK（UCB-NK）細胞和NK細胞系。PB-NK和UCB-NK過繼細胞療法在治療各種血液系統癌症方面取得了許多成功。然而，PB-NK細胞和UCB-NK細胞的NK細胞產量和亞群組成對供體的依賴性極強，因為這些細胞通常不是來自單一的可再生資源，使得產品標準化和多劑量策略變得困難。此外，原代NK細胞的遺傳修飾效率低，但變化很大，這使得難以利用一致且可重複的工程NK細胞療法。

研究進展

在我們的初步研究中篩選了三種不同的融合受體構建體，並測試了它們對NK細胞功能的啟動作用。所有融合受體均基於CD16a變體設計，可增加FcγRIIIa對抗體Fc片段（F158V）的親和力並抵抗ADAM17介導的切割（S197P），並針對增強NK細胞的活性進行了優化。我們設計了NK細胞特異性hnCD16融合受體構建體，其由信號肽，hnCD16的細胞外和跨膜結構域，通常在NK細胞中表達的細胞內1或2共刺激結構域（CD）以及刺激結構域（SD）CD3ζ或FcεRIγ組成。CD16a的細胞質尾部沒有任何ITAM結構域，因此需要含有ITAM結構域CD3ζ和FcεRIγ的細胞內鏈串聯的幫助，它們都與CD16a相關。

為了驗證hnCD16FR與不同的治療性mAb聯合使用可以有效殺死表達不同腫瘤相關抗原的癌細胞，我們使用表達三種hnCD16FR構建體中每種的NK細胞對肺癌細胞系A549進行了ADCC測定。與殺死Raji細胞的結果類似，FR1（hnCD16-2B4-DAP10-CD3ζ）構建體對A549細胞的ADCC作用優於其他構建體。FR2（hnCD16-DAP10-CD3ζ）和FR3（hnCD16-2B4-FcεRIγ） 構建介導的與hnCD16構建體相當的A549細胞殺傷。

我們的資料表明，與先前報導的hnCD16構建體相比，hnCD16與2B4-DAP10-CD3ζ的組合融合促進了ADCC功能的啟動，以增強抗體誘導的NK細胞介導的抗原依賴性抗腫瘤細胞毒性。

研究結果

在本研究中，我們篩選了殺死B細胞淋巴瘤的最有效組合，B細胞淋巴瘤與hnCD16a的外域，NK特異性共刺激劑（2B4和DAP10）和細胞質結構域中的CD3ζ融合在一起。篩選的構建體在NK細胞系和iNK細胞中顯示出優異的細胞毒性作用和敏銳的多種細胞因數釋放。hnCD16-和hnCD16FR轉導NK細胞的轉錄組學分析和驗證結果顯示，hnCD16FR轉導重塑了NK細胞中的免疫相關轉錄組，其中與hnCD16轉導相比，強調了與細胞毒性、高細胞因數釋放、誘導腫瘤細胞凋亡和ADCC相關的基因的顯著上調。體內異種移植研究表明，工程化hnCD16FR iPSC來源的NK細胞的單一低劑量方案與抗CD20 mAb治療共同給藥可介導有效的活性並顯著提高存活率。

總之，我們開發了一種新型hnCD16FR構建體，其表現出比報導的hnCD16更有效的細胞毒性，這是一種有前途的治療惡性腫瘤的方法，具有改善的ADCC特性。我們還為NK啟動結構域提供了基本原理，該啟動域重塑免疫反應以增強NK細胞中的CD16信號傳導。

參考資料：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC10265820/

2023年6月14日，北京大學基礎醫學院李揚副教授和北京大學人民醫院趙翔宇教授合作在Journal of Hematology & Oncology （(IF=23.168)）雜誌線上發表題為“Leveraging CD16 Fusion Receptors to Remodel the Immune Response for Enhancing Anti-Tumor Immunotherapy in iPSC-Derived NK Cells”（利用CD16融合蛋白重塑免疫應答以增強iPSC衍生NK細胞抗腫瘤免疫療法）的研究成果。本研究開發了一種新型hnCD16融合受體（high-affinity non-cleavable CD16 fusion receptor，hnCD16FR），該融合受體由hnCD16的胞外域、NK細胞特異性共刺激因數（2B4和DAP10）和CD3ζ構成的胞內段，它在體外和體內實驗中均表現出顯著增強的抗體依賴性細胞毒性，並初步揭示了該融合受體通過重塑免疫應答以增強NK細胞抗腫瘤功能的機制，並將hnCD16FR在誘導多能幹細胞來源NK細胞（hnCD16FR-iPSC-NK）中進行工程化修飾，證明了hnCD16FR-iPSC-NK細胞具有良好的應用前景，可以為以NK細胞為基礎的抗腫瘤免疫療法提供新的策略和選擇。

近年來，由於NK細胞相比於T細胞具有更好的治療安全性，更多的受體啟動機制，同時可以允許生產現貨型的產品的特點，使得其在過繼性細胞治療領域取得了廣泛的關注。目前開發出以誘導多能幹細胞（induced pluripotent stem cell, iPSC）為基礎的NK細胞生產方法已經可以用於臨床級的規模化生產，並用於癌症的免疫治療。當前，免疫療法正處於從基礎研究向轉化醫學邁進的時代，這催生了許多創新性免疫治療策略，其中一種重要的治療手段是通過使用治療型抗體來誘導抗體依賴性細胞介導的細胞毒性（ADCC）來靶向腫瘤並啟動NK細胞功能。

NK細胞的ADCC效應取決於在其膜表面表達的IgG受體CD16。最近的研究中開發了具有高親和力和不可剪切特性的CD16（hnCD16），並證明了其具有對多種腫瘤的殺傷潛力。然而，hnCD16受體只能啟動單一的CD16信號並提供有限的腫瘤抑制效果。由此，設計一種可以利用抗體療法優勢，並且能夠靶向多種腫瘤抗原的基於hnCD16的融合信號受體，使其在保留多抗原靶向性特點的基礎上，可以同時擴展抗腫瘤信號啟動是進一步提高NK細胞抗腫瘤活性的一個有前景的發展方向。

在本研究中，首先利用NK細胞系在體外篩選出可以介導最有效ADCC抗腫瘤活性的融合受體結構，該融合受體由hnCD16的胞外域、NK細胞特異性共刺激因數（2B4和DAP10）和CD3ζ構成的胞內段組成（圖1）。

圖1. 融合受體結構示意圖與抗B細胞淋巴瘤、肺癌細胞殺傷效果

 

進一步通過轉錄組學分析表明，hnCD16FR的表達重塑了NK細胞中的免疫相關轉錄組，與hnCD16相比hnCD16FR工程化的NK細胞與細胞毒性、細胞因數產生、誘導腫瘤細胞凋亡和ADCC作用相關的基因都發生了顯著上調。細胞因數釋放實驗證實了hnCD16FR工程化可以 介導NK功能相關細胞因數的大量釋放（圖2）。

圖2. hnCD16FR重塑了NK細胞中的免疫相關轉錄組並介導NK功能相關細胞因數的大量釋放

 

將篩選出的hnCD16FR在 iPSC 中進行工程化修飾，並將其分化為hnCD16FR-iNK（induced NK）細胞進行腫瘤免疫細胞治療。與NK細胞系得到結果一致，與對照相比，hnCD16FR-iNK表現出顯著的細胞因數釋放和體外ADCC抗腫瘤活性（圖3）。

圖3. hnCD16FR-iPSC其衍生NK細胞的體外抗腫瘤活性

 

最後，在小鼠B細胞淋巴瘤異種移植動物模型中進一步驗證hnCD16FR-iPSC衍生NK細胞體內的ADCC抗腫瘤功能。研究結果顯示，工程化修飾的hnCD16FR-iPSC衍生NK細胞的單次、低劑量注射方案與抗CD20 mAb的聯合治療策略，可以有效介導ADCC抗腫瘤活性並顯著延長生存期（圖4）。

圖4:在腫瘤異種移植模型中hnCD16FR-iNK細胞聯合治療的抗腫瘤效果。

 

綜上所述，本研究設計並篩選了由NK細胞啟動結構域構成的hnCD16融合受體，並使用iPSC平臺在體外構建了均質表達hnCD16FR的iNK細胞，這些hnCD16FR-iNK細胞可以與治療型mAb聯用以觸發有效的ADCC效應並產生多種細胞因數以響應抗腫瘤免疫。同時這些經過hnCD16FR工程化的iNK細胞與抗體聯合使用可以在體內介導有效的腫瘤控制。這項研究將有助於擴展iPSC-NK細胞在腫瘤免疫治療領域的應用前景。

北京大學基礎醫學院碩士研究生孟繁一為該文章的第一作者，北京大學基礎醫學院李揚副教授、北京大學人民醫院趙翔宇教授、北京大學基礎醫學院周士新副教授為共同通訊作者。該研究得到國家重點研發計畫、國家自然科學基金、瑞臻再生醫學研究基金、北大醫學交叉研究種子基金的資助。

原文連結：https://jhoonline.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13045-023-01455-z

靶向T細胞和NK細胞的協同作用

腫瘤異質性是包括免疫療法在內癌症治療方法面臨的主要挑戰之一。異質性可通過獲得新突變而產生，從而產生抗治療腫瘤亞克隆。此外，癌細胞可以通過改變其細胞狀態來適應治療壓力。因此，我們面臨的任務是如何積極設計免疫療法，防止耐藥腫瘤細胞的選擇。

T細胞和自然殺傷（NK）細胞在腫瘤免疫中具有互補作用，這些淋巴細胞群體使用不同的識別策略來識別癌細胞，NK細胞可以殺死逃脫CD8+T細胞識別的癌細胞。因此T細胞和NK細胞的雙重攻擊為加深免疫治療的影響提供了機會。最近的研究還表明，NK細胞在向腫瘤招募樹突狀細胞中發揮重要作用，從而增強CD8+T細胞應答的誘導，而T細胞分泌的IL-2啟動NK細胞。

有趣的是，T細胞和NK細胞還共用幾種重要的抑制和啟動受體，這些受體可以作為增強T細胞和NK-細胞免疫作用的靶點。這些抑制性受體配體系統包括CD161-CLEC2D、TIGIT-CD155和NKG2A/CD94-HLA-E。此外，基於抑制和啟動細胞因數的新的治療策略也可以發揮T細胞和NK細胞的協同作用，這些基於T細胞和NK細胞協同作用的療法將深刻影響目前的癌症免疫治療。

T細胞和NK細胞識別腫瘤細胞的分子邏輯

T細胞和NK細胞在腫瘤細胞識別的分子機制上有根本不同。T細胞通過TCR介導的MHC結合肽抗原識別腫瘤細胞。T細胞的所有關鍵功能都在TCR的控制下，包括細胞毒性、細胞因數產生和增殖。因此，腫瘤可以通過下調或丟失MHC-I表達逃避CD8+T細胞的作用。

相反，NK細胞利用一系列啟動和抑制受體來識別應激和轉化的細胞，如NKG2D、NKp46、NKp30和NKp44受體。與T細胞相比，NK細胞識別腫瘤細胞不依賴於任何唯一的啟動受體，這一事實為識別應激和轉化的細胞提供了更大的靈活性。因此，T細胞和NK細胞對腫瘤細胞施加不同的選擇壓力，為T細胞和NK細胞雙重靶向腫瘤提供了理論依據。

T細胞和NK細胞的共用受體

T細胞和NK細胞從生物學上經常被認為是適應性免疫識別和固有免疫識別的嚴格區分。然而，NK細胞和CD8+T細胞的受體-配體系統也存在大量重疊。因此，CD8+T細胞和NK細胞表達的活化和抑制受體提供了使它們參與協同抗腫瘤免疫的機會。

CD161及其配體CLEC2D

CD161受體屬於C型凝集素受體家族，並形成同源二聚體。它最初被鑒定為NK細胞上的一種抑制性受體，其阻斷對表達CLEC2D配體的腫瘤細胞的殺傷。最近，CD161也被確定為腫瘤浸潤T細胞的重要抑制受體。CLEC2D是一種C型凝集素受體，在幾種人類癌症的腫瘤細胞和浸潤性髓系細胞上表達。CLEC2D在生髮中心B細胞中高水準表達。因此，起源于生髮中心B細胞的B細胞淋巴瘤可以表達高水準的CLEC2D，包括濾泡性淋巴瘤、伯基特淋巴瘤和具有生髮中心B-細胞樣基因表達特徵的彌漫性大B細胞淋巴瘤亞型。在Toll樣受體（TLR）啟動後，DC和B細胞也表達CLEC2D。因此，靶向這種抑制性受體可以增強T細胞和NK細胞的抗腫瘤活性。

NKG2A/CD94及其配體HLA-E

HLA-E是一種非經典MHC Ib分子，與NK細胞和CD8+T細胞亞群表達的抑制性NKG2A/CD94受體結合。在許多實體瘤中，HLA-E在腫瘤細胞過表達，並且在腫瘤浸潤巨噬細胞和DC上也檢測到這種蛋白的表達。NKG2A/CD94受體由大多數迴圈和腫瘤浸潤的NK細胞組成性表達。雖然只有一小部分血液CD8+T細胞表達NKG2A/CD94，但其表達會在共表達PD-1和其他抑制性受體的腫瘤浸潤CD8+T細胞中上調。

CD226受體和抑制性對應受體TIGIT、CD96和PVRIG

CD226受體是NK細胞和CD8+T細胞表達的重要共刺激受體。這種啟動性受體的主要配體CD155在人類癌細胞中廣泛表達，此外，CD226還與第二配體PVRL2（CD112）結合。有趣的是，啟動CD226受體的活性被三種抑制性受體TIGIT、CD96和PVRIG拮抗。TIGIT和CD96抑制性受體對共有CD155配體的親和力高於CD226，並且可以在配體結合方面勝過CD226。在這三種抑制性受體中，TIGIT的研究最為廣泛。TIGIT由NK細胞、CD8+T細胞和調節性T細胞（Tregs）表達。TIGIT在不同實體瘤和淋巴瘤中的腫瘤浸潤CD8+T細胞高表達。TIGIT也是NK細胞中的一種重要抑制受體，並導致腫瘤中的NK細胞功能障礙。PD-1和TIGIT都抑制CD226，但通過不同的機制：PD-1在CD226的胞質結構域中去磷酸化Tyr-322，而TIGIT在CD155結合方面超過CD226。CD96和PVRIG受體的研究較少。在小鼠模型中，CD8+T細胞或NK細胞中CD96受體的失活增強了抗腫瘤免疫，但其在人類細胞中的作用尚不清楚。PVRIG也由T細胞和NK細胞表達，其主要配體是PVRL2。

NKG2D受體及其應激誘導配體

NKG2D受體由人NK細胞、CD8+T細胞和先天性T細胞（NKT細胞和γδT細胞）表達。啟動後，NKG2D通過銜接蛋白DAP10發出信號，誘導NK細胞、γδT細胞和NKT細胞的穿孔素依賴性細胞裂解；它還為CD8+T細胞提供共刺激信號。

NKG2D受體識別一組受應激和轉化細胞上調的配體。在人類中，這些配體包括MICA/MICB和ULBP1-6蛋白；在小鼠中，這些配體包括Rae1α–ε、H60a–c和Mult1。這種受體-配體系統對腫瘤免疫很重要，因為這些配體被DNA損傷和cGAS STING信號上調，但很少被健康細胞表達。本質上，NKG2D配體的上調標誌著應激細胞被細胞毒性淋巴細胞清除。NKG2D配體的表達經常在多種實體瘤和血液瘤中檢測到，包括前列腺癌、卵巢癌和乳腺癌以及黑色素瘤和多發性骨髓瘤。

MICA/B的蛋白水解脫落通過顯著降低腫瘤細胞表面上這些刺激性NKG2D配體的密度而導致免疫逃逸。二硫異構酶ERp5參與脫落的啟動：它破壞MICA/Bα3結構域中的結構二硫鍵，使其可通過ADAM-10/17和MMP14進行蛋白水解。脫落MICA與許多人類癌症的疾病進展密切相關，但在健康受試者的血清中未檢測到。

NK細胞-DC細胞-T細胞軸

NK細胞不僅充當細胞毒性效應細胞，還可以將DC細胞招募到實體瘤中，從而形成T細胞介導的腫瘤免疫。傳統DC目前分為兩個主要子集，cDC1和cDC2。通過將凋亡腫瘤細胞的細胞相關抗原呈遞給CD8+和CD4+T細胞，cDC1亞群對保護性抗腫瘤免疫至關重要。除了這種傳遞作用外，cDC1還通過招募和啟動腫瘤特異性CD8+T細胞在腫瘤中發揮關鍵作用。

兩項主要研究表明，NK細胞在向腫瘤募集cDC1中起著關鍵作用。第一項研究表明，NK細胞分泌趨化因數，介導cDC1募集到腫瘤中，特別是XCL1、XCL2和CCL5。這是一個重要的發現，因為cDC1選擇性表達XCL1/2的XCR1趨化因數受體。第二項研究側重於FLT3配體，這是一種調節DC分化和存活的關鍵細胞因數。在NK細胞中檢測到這種重要細胞因數的表達。研究顯示， NK細胞（而不是T細胞）的清除大大減少了cDC1向腫瘤的募集。這些研究證明了腫瘤中NK細胞和T細胞反應之間的重要聯繫：NK細胞募集並支援DC的存活，而DC又對T細胞介導的腫瘤免疫至關重要。

靶向T細胞和NK細胞協同作用的免疫治療方法

癌症疫苗

大多數當前的癌症疫苗都關注肽表位，由於個體之間MHC等位基因的巨大多樣性，需要個性化設計。此外，細胞毒性T細胞施加巨大的選擇壓力，導致MHC-I表達下調或缺失的腫瘤克隆出現。一種引發T細胞和NK細胞雙重攻擊的疫苗可以防止MHC-I缺陷型腫瘤克隆的出現，因為MHC-I表達的缺失使腫瘤細胞更容易被NK細胞殺死。人類腫瘤通過活化的MICA和MICB配體在腫瘤細胞上的蛋白水解脫落來逃避活化NKG2D受體的識別。靶向參與蛋白水解脫落的MICA/Bα3結構域的癌症疫苗誘導高滴度抗體，可以抑制脫落並增加腫瘤細胞表面MICA/B蛋白的密度。該疫苗誘導多種T細胞和NK細胞群體顯著歸巢小鼠腫瘤。這種疫苗誘導的抗體在抗腫瘤免疫應答中發揮著重要作用：腫瘤結合的MICA/B抗體增強了DC對CD8+T細胞的腫瘤抗原交叉呈遞，並通過啟動NK細胞上的CD16-Fc受體增加了NK細胞介導的腫瘤細胞殺傷。

靶向抑制性細胞因數

TGF-β是一種主要的免疫抑制細胞因數，可有效抑制腫瘤內的T細胞和NK細胞功能。TGF-β強烈抑制T細胞增殖和效應器功能。在NK細胞中，TGF-β信號抑制mTOR調節的關鍵代謝程式，從而抑制增殖和細胞毒性。TGF-β還抑制腫瘤浸潤NK細胞的多種活化受體的表達，包括NKG2D受體。PGE2在免疫抑制中起著重要作用，也與增強癌細胞存活和侵襲性有關。環氧化酶（COX）-1和2是PGE2合成的關鍵酶，在許多人類癌症中經常過表達。通過Ptgs1和Ptgs2基因的失活抑制小鼠黑色素瘤細胞系中PGE2的合成，導致TME從促腫瘤細胞因數（IL-1β和IL-6）向抗腫瘤的細胞因數/趨化因數（IL-12、IFN-γ和CXCL10）轉變。重要的是，CD103+cDC1在這些Ptgs1/2−/−小鼠的TME中顯著增加，而NK細胞通過分泌XCL1和CCL5在cDC1的募集中發揮核心作用。

工程化刺激性細胞因數

幾種主要的細胞因數同時作用於T細胞和NK細胞，包括IL-2、IL-12、IL-15和IL-18，為增強T細胞和NK細胞功能提供了機會。例如，NKTR-214是一種聚乙二醇形式的IL-2，在一項1期臨床試驗中，NKTR-214單藥治療，26名患者中有14名（53.8%）疾病穩定，迴圈CD4+T細胞、CD8+T細胞和NK細胞大量增殖。同時，IL-15作為治療藥物也在大力開發中，因為它啟動效應T細胞和NK細胞，但不啟動Treg。IL-15對記憶性T細胞的存活很重要，並誘導NK細胞增殖和活化。在一項血液惡性腫瘤復發患者的1期臨床試驗中，IL-15超級激動劑ALT-803在19%的治療患者中誘導了治療反應。與其作用機制一致，ALT-803誘導血液中NK細胞和CD8+T細胞的顯著增殖，並通過迴圈NK細胞增強活化受體（NKG2D、NKp30）和顆粒酶B的表達。

結合T細胞和NK細胞的聯合療法

對在小鼠模型系統中有效治療腫瘤的聯合療法已經確定了四種藥物的組合，簡稱AIPV，其由抗腫瘤抗體（A）、延長半衰期的IL-2（I）、抗PD-1（P）和肽疫苗（V）組成。該方案可以進一步簡化為單劑量AIP（抗腫瘤抗體、IL-2和PD-1抗體）。單劑量AIP治療可誘導快速早期反應，NK細胞和巨噬細胞發揮顯著作用，包括促炎性趨化因數和細胞因數的表達上調。腫瘤結合抗體和延長半衰期的IL-2有助於早期NK細胞活化，這使得能夠招募DC和CD8+T細胞，從而使腫瘤對ICB更敏感。

此外，天然免疫刺激物也提供活化CD8+T細胞和NK細胞的機會。STING激動劑在小鼠模型中誘導由CD8+T細胞和NK細胞介導的強大抗腫瘤反應。STING激動劑通過動員T細胞和NK細胞，與IL-2顯示出強烈的協同作用，以對抗MHC-I缺陷和MHC-I陽性小鼠腫瘤。

最近的研究表明，腫瘤中T細胞的生物學與NK細胞的生物學高度相關。NK細胞在T細胞介導的腫瘤免疫中發揮著重要作用，通過招募DC細胞並支持其生存。儘管NK細胞和T細胞屬於免疫系統的固有和適應性分支，但它們也共用重要的活化和抑制受體配體系統，為免疫治療提供了機會。對人類腫瘤的這些特徵更深入的分子理解可能會發現新的免疫治療靶點，並指導有效參與DC、NK細胞和T細胞的聯合療法的開發。

參考文獻：

1.DesigningCancer Immunotherapies That Engage T Cells and NK Cells. Annu Rev Immunol.2022Nov 29

 

2023年港股18A生物科技行業發展白皮書

科技共同撰寫的《2023年港股18A生物科技行業發展白皮書》正式發佈。《白皮書》基於已上市和擬上市的生物科技企業，從公司全景、行業分析、發行資料、指數分析、公司研究等不同維度勾勒生物科技行業發展全貌。《白皮書》認為，生物製藥、醫療器械及前沿科技賽道仍被看好。根據研究，生物製藥賽道可能是未來3-5年內資金追逐的戰場，同時，醫療器械賽道受產品國產化率的提升、技術的進步、滲透率增加及中國不斷加大政策支持等主要驅動因素的推動，“18A”生物科技公司將受益於行業大趨勢發展，未來可期。

Part 1 全景掃描：生物科技市場回暖，發展空間廣闊

《白皮書》顯示，恒生香港上市生物科技指數覆蓋港股上市的生物科技領域細分行業優質龍頭，分享生物科技長期發展紅利。2022年10月以來，受集采預期溫和、財政貼息政策、全球美元資產再平衡，一級市場投融資資料環比逐步向好、海外超預期加息終結等因素催化，港股生物科技市場迎來估值修復行情。截至2022年12月31日，恒生香港上市生物科技指數的歷史市銷率PS(TTM)在經過1年多的時間深度調整消化估值，釋放風險，其市銷率PS(TTM)僅為1.6倍，處於2020年以來36.6%低點分位，估值處於相對低位，具有較高吸引力。中國生物科技行業作為國內醫藥政策紅利和巨大未滿足的臨床需求的最直接受益者，其發展空間廣闊。

Part 2 行業分析：上市規則實施5年，生物科技板塊多元發展

自2018年香港交易所(295.4, -6.00, -1.99%)推行18A上市規則以來，香港成為越來越多生物科技企業上市的首選地，截止至2022年12月31日，共有64家企業通過18A規則遞表或上市，包括56家已上市公司，8家遞表公司，其中6家公司已摘B。企業分佈於製藥、醫療器械、前沿科技，其中製藥行業共有45家企業，醫療器械17家，前沿科技2家。其中，已摘B企業的6家企業均為製藥企業，在腫瘤和自免細分賽道分佈最多。

製藥是主要賽道，專注新藥研發生產商業化業務。截止至2022年12月31日，共45家企業，占18A企業總數70.3%，包含已上市40家、已遞表5家，其中6家上市企業已摘B。隨著全球製藥市場的發展，在經濟增長和(48.05, -0.10, -0.21%)中國對醫藥健康需求的帶動下，2021年中國製藥行業市場規模為15,912億元，預計整體以6.7%年複合增速增長，2025年市場規模預計擴張至20,645億元。從細分行業市場特點來看，全球增速最快的是細胞免疫治療行業，預計2021-2025年全球細胞免疫治療行業市場規模年複合增長率達47.5%;行業體量最高的為腫瘤藥物行業，2021年全球腫瘤藥物市場規模為1,817億美元。中國增速最快的也是細胞免疫治療行業，預計2021-2025年中國細胞免疫治療行業市場規模年複合增長率達87.9%。

醫療器械賽道主要專注於血管介入、神經外科、非血管介入、糖尿病、診療設備、分子診斷等領域，其中血管介入領域是企業佈局最大的子行業，共有10家，其中上市企業9家。2015-2020年，中國醫療器械市場複合增速為19.3%，預計2020-2024年會保持13.9%年複合增速增長。

前沿科技以AI醫療影像和手術機器人行業為主，中國AI診療設備市場規模由2019年的1.2億元大幅增加至2020年的2.9億元，預計2030年將增加至755.7億元。隨著醫療AI第一股鷹瞳科技上市，標誌著AI+醫療行業隨著人工智慧技術的發展將加速發展。

《白皮書》認為，生物製藥、醫療器械及前沿科技賽道仍被看好。根據研究，生物製藥賽道可能是未來3-5年內資金追逐的戰場，同時，醫療器械賽道受產品國產化率的提升、技術的進步、滲透率增加及中國不斷加大政策支持等主要驅動因素的推動，“18A”生物科技公司將受益於行業大趨勢發展，未來可期。全球新冠疫情的爆發加速了新興醫療子行業的發展，受醫療保健需求激增、AI賦能優勢認知增加、有利的政策等主要驅動因素所推動，越來越多前沿科技企業赴港上市。受益于香港資本市場的創新扶持制度，18A企業擁有更通暢的上市路徑，並可獲得更多的資金扶持，促進自身產品和技術的國際化和全球化。在巨大的未被填補的臨床需求下，我們關注到PD-1/L1、CAR-T、ADC、mRNA、基因編輯等不斷湧現的新興技術所展現的巨大潛力，也會有更多的18A企業脫穎而出。未來，在政策、資本及技術的多項推動因素下，18A生物科技行業未來可期。

Part 3 發行資料：18A公司IPO募資額超千億

2018年港交所推出《上市規則》第18A章後，香港成為18A公司重要的融資中心，18A公司的從遞表到上市的週期較非18A公司普遍縮短。資料顯示，截至2022年12月31日，已上市的18A公司共有 56家，累計募集資金總額超過千億港元，累計發行總市值超過7,000億港元。平均募集資金約19億港元，募集資金最多的百濟神州(110.5, 1.50, 1.38%)約70.85億港元。

據LiveReport大資料，已上市18A公司普遍在上市前已經進行了較為頻繁的融資，上市前融資輪次為2-6輪的有46家，占比85%;上市前融資輪次最多的公司高達12輪;大部分公司的估值較首輪融資增長突出，且過半18A公司的發行估值較最後一輪溢價50%以上。

基石投資者方面，已上市的56家18A公司中，有51家公司有基石參與，其共計158位基石投資者，總持倉市值占56家18A公司全球發售市值的40.82%。而參投家數前三的基石投資者均為知名的投資機構，其分別為奧博參投17家，清池資本參投15家，高瓴資本參投13家等;但從參投金額來看，GIC集團位居第一，共計參投超28億港元，其次高瓴參投超24億港元。仲介機構方面，高盛、摩根士丹利和中金公司(13.36, 0.04, 0.30%)是參與18A公司發行最多的保薦人，說明頭部大行在生物科技行業內專案資源很強。沙利文在行業顧問的佔有率排名第一，參與了46家18A公司的發行，占比高達82.14%。18A發行的核數師及申報會計師主要為四大會計師事務所，安永占比四成。律所方面，擔任發行人律師的律所分佈比較均勻，邁普達、通商、美邁斯參與較多。

Part 4 指數及未來展望：18A仍是港股IPO市場的重要組成部分

為刻畫18A生物科技板塊的整體運行表現，捷利交易寶編制了沙利文捷利生物科技指數系列，包括沙利文捷利生物科技精選30和沙利文捷利生物科技綜合。

沙利文捷利生物科技綜合於2022年新增8只成分股，目前共有56只成分股。截至2022年12月31日，生物科技綜合指數的成分股合計市值約7000億港元，前十大權重股合計約4700億港元，占比約七成;其中，市值前三的成分股百濟神州、君實生物(22.7, 0.80, 3.65%)、信達生物(30.6, 0.15, 0.49%)均已實現摘B。

自2018年12月31日至2022年12月31日，生物精選指數錄得累計收益率33.7%，生物綜合指數錄得累計收益率12.8%，同期恒生指數(18824.24, -65.73, -0.35%)錄得虧損，累計收益率為-23.5%。可見，港股18A經歷過探索期、狂熱期、調整期之後，整體市場表現仍然強於大盤。

18A公司發行受全球宏觀經濟、港股新股市場冷熱、生物醫藥板塊冷暖影響。2018-2022年18A公司的發行家數分別為5家、9家、14家、20家、8家。2021年上市家數最多，2022年因新股市場遇冷，上市家數出現回落。我們相信18A未來仍然是港股IPO市場的重要組成部分。

中國細胞行業當前業態、司法監管實踐及未來監管模式研判報告

綜述

當前中國細胞行業真實業態多樣，細胞領域臨床研究、研發、生產產能及市場需求均有較大釋放空間；另一方面，從主要監管部門到各地地方政府，或在具體監管案例中謹慎處理，為日後完善監管留白預留充分政策空間，或積極探索細胞行業發展模式和監管路徑。

一、我國細胞行業當前業態及典型投建模式

（一）當前細胞行業主要業態

根據市場公開信息，目前我國細胞行業主要業態包括細胞商業存儲、細胞生產與製備、細胞醫美大健康、按藥物申報、雙備案的幹細胞臨床試驗、臨床轉化治療等實際業態，整體如下圖：

1.細胞商業存儲現狀

目前我國細胞存儲業務分為公共血庫造血幹細胞存儲和商業有償存儲，涉及的組織樣本主要包括新生兒臍帶、臍帶血和胎盤樣本、骨髓液樣本、牙齒樣本、脂肪組織、滑膜組織等。公共庫主要系原衛生部依據《臍帶血造血幹細胞庫設置管理規範（試行）》等規定，以公益為目的進行採集和存儲，供有需求的患者配型使用而先後批准設立的北京、天津、上海、浙江、山東、廣東、四川等7個臍帶血造血幹細胞庫。商業存儲則由相關企業面向社會公眾從事有償細胞存儲和製備，以新生兒自體圍產組織幹細胞和成人自體細胞為主。目前各省基本均有細胞有償存儲業務業態，且呈現頭部企業虹吸效應。如中源協和（600645）在2022年報中披露其已在全國20 個省市建立細胞資源庫，開展臍帶血造血幹細胞、臍帶間充質幹細胞、胎盤亞全能幹細胞、脂肪幹細胞及免疫細胞的檢測、製備與存儲服務，構建了全國性細胞資源存儲網路。

2.細胞生產與製備現狀

除細胞藥物研發製備企業及相關CDMO企業外，當前細胞製備業務主要指細胞企業為臨床研究醫院、科研及企事業單位提供細胞製品。如天晴股份（832035）年報披露，公司的製備服務專案“主要集中在省內及東三省的專業的腫瘤醫院及綜合性醫院的腫瘤科、普通外科等產生腫瘤病人的科室，公司為他們的生物治療癌症臨床研究提供高效 NK細胞”。截止2022年底，我國獲得中檢院幹細胞質量檢驗報告機構的數量約50家。近年，隨著誘導多能幹細胞（IPSC）技術及其應用的不斷成熟和拓展，IPSC來源的種子細胞、前體細胞製劑製備的市場需求不斷擴容。

在各地政府鼓勵發展細胞與基因治療背景下，頭部細胞企業多被當地科技、發改等部門認定為當地“工程技術中心”、“工程研究中心”、“區域細胞製備中心”等。如賽萊拉（831049）曾在信披檔中披露，廣東省（賽萊拉）區域細胞製備中心即是廣東省發改委、省科技廳、省衛計委、省食藥監局聯合發函批復，由賽萊拉承擔建設的省級區域細胞製備中心。

3.細胞醫美與大健康業務現狀

細胞大健康業務常見的有幹細胞、免疫細胞回輸及相關醫美製品或服務。如冠昊生物在2021年報中即披露，公司“紮根大健康前沿領域，適時推出免疫增強方案、牙髓幹細胞儲存等新技術服務，借助產品線擴充升級，自建中醫養生保健館–天佑延年堂、高端綜合門診–廣州百尼夫等技術落地運營機構，完善產品應用閉環”。

值得一提的是，由於人源細胞因數尚未列入國家藥監局化妝品原料藥目錄，目前國內尚無獲批的幹細胞化妝品。國家藥監局曾在2021年9月發文強調“幹細胞化妝品”屬於偽概念。當前合規化生產、銷售的化妝品也並非是以“人源細胞”作為原料的化妝品。如賽萊拉曾披露“公司依託掌握的幹細胞核心技術，延伸到動植物細胞提取物技術研發，將自主研發、自主生產的包含專利技術的動植物細胞提取物原料轉化為功能性護膚品”。

4.按藥物進行申報

隨著2021年兩款CAR-T產品在中國批准上市，細胞治療產品按照藥品監管的路徑全面打通。根據CDE官網資訊，截至2023年2月28日，國內共有42家企業的62款幹細胞藥物臨床試驗申請（IND）獲得受理，30家企業的47款獲得臨床默示許可，主要為來源臍帶、胎盤、骨髓、脂肪、牙髓、宮血等間充質幹細胞藥物。同時，IPSC類幹細胞藥物IND申請也逐漸增多。目前在該方面較活躍的企業包括安徽中盛溯源、南京艾爾普、浙江霍得生物、呈諾醫學、武漢睿健醫藥等。值得一提的是，今年4月西比曼生物科技正式宣佈啟動公司旗下“異體人源脂肪間充質祖細胞注射液AlloJoin”的 III 期臨床試驗。這也標誌著我國幹細胞藥物研發進入III期臨床時代。

5.雙備案的臨床試驗現狀

雙備案即非註冊臨床研究（IIT）的研究機構、研究專案雙備案。

經檢索，目前全國已有137家研究機構（含軍隊醫院22家）在衛健委、藥監局或後勤保障部衛生局完成臨床研究機構備案，共有112個幹細胞臨床研究專案備案。相關適應症涉及循環系統（如急性心梗、心衰）、神經系統（如帕金森病、缺血性卒中）、泌尿生殖系統（如宮頸粘連、卵巢早衰）、免疫系統（如狼瘡性腎炎）、運動系統（如膝骨關節炎、半月板損傷等）等多系統疾病的治療。

6.臨床轉化治療現狀

儘管監管政策前後有所變化，在醫療實踐中，醫院或企業通過多種方式嘗試或實施細胞臨床轉化治療的行為從未終止。許多地方政府或自貿區也積極探索，希望打通細胞臨床轉化治療的支付路徑。如中源協和在2021年報中披露，“2021 年 6 月，血研所與公司等主體合作建設中國(天津)自由貿易試驗區聯動創新示範基地，該基地計畫依託國家幹細胞工程產品產業化基地細胞存儲、研發、生產製備、臨床轉化應用等全閉環管理環境，探索在細胞治療臨床試驗同情用藥、進口國外已上市國內未上市藥品與醫療器械、細胞治療按照醫療技術准入開展臨床收費應用等方面實現突破”。

（二）當前細胞企業典型投建模式

鑒於細胞治療藥品研發週期長、資本密集的特點，國內多數細胞企業同時佈局多種業態，以構建細胞產業全閉環。以國內上市或掛牌的細胞企業為例，其業態佈局情況如下：

再如，根據市場公開資料，北京漢氏聯合生物技術股份有限公司同時佈局漢氏生物、漢氏藥業、漢氏醫學、希諾神州四個產業板塊，其中漢氏生物負責細胞存儲、製備和CXO服務；漢氏醫學承擔集團精准醫療大健康產業的建設運營任務，主要包括三級醫院、綜合門診部、高端體檢中心、協力廠商醫學檢驗中心、互聯網醫院、醫美護膚中心、醫療旅遊等業務；漢氏醫藥則以細胞類新藥研發為主，現有多個幹細胞1類新藥臨床試驗申請獲得批准。

二、現有業態的法律評價與司法監管實踐

（一）當前司法監管實踐的整體特徵

目前我國細胞領域的司法裁判以零星案例為主，尚未形成體系化的裁判標準，針對同類型案例，不同法院裁判口徑不一；行政監管實踐以相關主體投訴、舉報等發起的被動型監管為主，主動研判型、體系化監管相對偏少。值得一提的是，為應對行業發展帶來的監管挑戰，部分地方開始加強主動型監管的研究。如2021年9月深圳市坪山區人民法院發佈《生物醫藥產業全流程法律風險及司法應對研究》專項調研課題投標公告，2022年12月深圳坪山區發佈《深圳市坪山區生物醫藥企業刑事合規工作指引》，均系主動構建當地裁判或監管體系。

（二）各業態典型司法、監管案例及執行口徑

1.商業存儲業務的法律評價與裁判

（1）商業存儲合約效力認定

泰州中院（2017）蘇12民終570號一案中，在案由上，法院將臍帶血存儲糾紛界定為消費者權益糾紛；在合約效力上，針對上述人（存儲臍帶血的自然人）提出的“案涉合同違反法律、行政法規的強制性規定應當無效”的訴請，法院認為，上訴人 “既是臍帶血造血幹細胞的提供者，也是臍帶血造血幹細胞的所有者，臍帶血造血幹細胞僅僅供本人或者近親屬使用，並不涉及其他公民，亦不會對公共安全造成影響”，故“被上訴人接受上訴人委託製備、存儲臍帶血造血幹細胞並不違反《中華人民共和國獻血法》等法律、行政法規的強制性規定”，最終判決臍帶血有償存儲合約有效。

經筆者在裁判文書網檢索，尚未發現人遺條例頒佈後的商業存儲糾紛判例。

（2）商業存儲與保藏審批的監管實踐

目前的從事細胞商業存儲的企業多將存儲行為定位成基於“未來臨床治療目的”，未申請保藏許可。部分企業因兼有未來科學研究目的或承擔了特定平臺職能，則申請並獲得了保藏審批，如河南省華隆生物技術有限公司河南省人類幹細胞資源庫等。

目前尚無商業存儲方因未取得保藏許可而被人遺監管部門處罰的案例。

2.細胞回輸協議效力的司法實踐

在已有的細胞回輸相關糾紛案例中，針對細胞回輸協議的效力，出現“有效”和“無效”兩種不同的裁判結果。

（1）協議有效的案例

在煙臺中院（2020）魯06民終1331號一案中，上述人（接受回輸方）提出“被上訴人在未獲得國家批准情況下，直接將‘幹細胞回輸液’注射到上訴人體內，並向上訴人收取費用，違反上述管理辦法及《中華人民共和國藥品管理法》、《醫療機構管理條例》等法律規定，被上訴人以‘免疫細胞保健’名義向上訴人有償提供的‘幹細胞套餐’服務依法應當認定無效。二審法院最終認為，“本案雙方簽訂的‘幹細胞套餐’服務合同，系雙方真實意思表示，且雙方在簽訂合同時，該合同並未違反法律或行政法規的強制性規定”，即判決細胞保健合同有效。

（2）協議無效的案例

在上海一中院（2020）滬01民終4321號一案中，法院認為 “與幹細胞相關的管理規範具有公共利益屬性，雖然《幹細胞臨床研究管理辦法（試行）》不屬於法律、行政法規，在法律規範的效力位元階上屬於部門規章，但是該管理辦法系依據《中華人民共和國藥品管理法》《醫療機構管理條例》等法律、行政法規而制定，旨在規範和促進幹細胞臨床研究健康、有序發展”，因此，“聚仁公司銷售‘幹細胞’給他人直接用於人體回輸，違反了《幹細胞臨床研究管理辦法（試行）》第五十二條關於禁止幹細胞直接進入臨床應用的規定的同時，嚴重違背了倫理規範，破壞國家醫療監管制度，危及不特定個體生命健康安全，進而損害社會公共利益”，最終判決協議無效。綜上，對於細胞醫美和細胞大健康服務的法律評價，司法實踐中尚無統一認定標準。

3.“細胞化妝品”的監管實踐

國家市場監督管理總局廣告監督司《關於加強幹細胞廣告監管的工作提示》（廣函字（2021）187號）、國家藥監局《關於開展化妝品“線上淨網、線下清源”專項行行動的通知》（國藥監妝（2021）47號）等檔均明確不得違規宣稱相關產品含有幹細胞且存在美容、抗衰等功效，多地亦出現行政處罰案例。因此，針對“細胞化妝品”的監管口徑比較清晰。

4.臨床轉化治療的司法監管實踐

一直以來，國內因臨床轉化治療涉刑案件較少，較有代表性的是（2020）滬0101刑初76號許某等人非法經營罪案。該案判決書載明，2016年12月至2017年4月期間，許某以上海某高校轉化醫學研究院名義對外招攬病患，汪某負責在涉案公司辦公地製作幹細胞注射液，最終在涉案醫院腫瘤科或公司辦公地為患有漸凍症、腦溢血等不同病症的患者有償注射幹細胞。

該案的審理過程頗有看點。最初，上海市黃浦區法院一審判決許某等人犯生產、銷售假藥罪，公訴機關及原審被告人均不服，分別提出抗訴、上訴。上海三中院以“涉案幹細胞是否假藥以及各被告人在共同犯罪中的地位、作用等事實尚需進一步查明”為由，裁定發回重審。2020年1月，黃浦區法院重審立案，黃浦區檢察院變更指控罪名為非法經營罪。最終，黃浦區法院判決被告人許某等“違反國家藥品專營、專賣管理法律法規，未經許可經營藥品”，構成非法經營罪。許某的刑罰從生產銷售假藥罪項下的有期徒刑11年，變更為非法經營罪項下的有期徒刑6年。

同時，針對細胞臨床轉化治療，近兩年典型行政處罰案件如下：

截止目前，上述案件相關方均未涉及刑事處罰。

5.與細胞領域相關的其他司法實踐

目前與細胞行業關聯的刑事罪名主要包括銷售假藥罪、詐騙罪以及走私、妨礙檢驗檢疫等進出口類犯罪，其中以詐騙罪案例居首，這也與我國當前細胞治療知識普及度和監管留白有關。近年來典型案件如下：

綜上，儘管僅有少量司法裁判和監管處罰案例，但亦能看出，相關法院和監管部門在處理具體案件時，為行業發展預留政策空間的謹慎克制，在司法裁判上也似有輕刑化趨勢。

三、我國細胞行業監管趨勢研判與分析

（一）研判分析的基準

1.基於國外監管模式的共同底層邏輯或最大公約數

我們認為，無論是基於《公共衛生服務法案》將人體細胞和組織分為低風險產品（PHS ACT 351章節）和高風險產品（PHS ACT 361章節）而構建監管體系的美國“單軌制”（歐盟與之類似），還是將再生細胞治療產品與藥物、醫療器械平行立法的日本“雙軌制”，均具有共性的底層邏輯和要素支撐。主要體現在以下兩點：

（1）依託完善的風險分級制度

FDA依據細胞和組織產品風險的高低，將產品分為如下兩大類，並明確界定“最小操作”和“同源性使用”的含義：

 

來源：《中國食品藥品監管》

日本則由厚生勞動省（MHLW）按照三級風險對細胞治療進行申報備案管理的，如下：

來源：《中國食品藥品監管》

（2）依託完備的細胞製備體系和市場

針對細胞製備體系，美國FDA制定了較為完備的指南，包括工藝相關指南、臨床前期相關指南、針對特定疾病或特定細胞的指南、有效性和安全性指南等。日本細胞治療指導檔也涵蓋不同的疾病領域、細胞類型，聚焦細胞採集、細胞製備、品質評價、療效安全評估以及運輸和存儲標準等環節，基本實現細胞製備標準化。

關於細胞製備與流通市場，以幹細胞為例，根據市場公開資料，日本在2020年底發放細胞製備許可證已超過2700家。

2.基於我國細胞行業監管模式的沿革邏輯

未來的監管模式即是對過去、當前現狀的延伸和完善。

我國曾實行一段時間的“雙軌制”，2016年“魏則西事件”之後，原國家衛計委終止細胞治療收費，藥監部門則逐漸強化、明晰和完善按藥品監管的路徑和體系。根據當前法律法規、規範體系，我國細胞基因治療領域的“正清單”如下：

“正清單”之外領域的監管暫時留白，但趨勢邏輯卻在相關表徵中有所體現。如2019年國家衛健委曾發佈《生物醫學新技術臨床應用管理條例（徵求意見稿）》《體細胞治療臨床研究和抓華應用管理辦法（試行）》（徵求意見稿），雖至今仍未頒佈，但被業界認為是“雙軌制”回歸的信號。2023年5月9日衛健委發佈的《體細胞臨床研究工作指引（徵求意見稿）》，即進一步體現了體細胞IIT與幹細胞IIT監管模式逐漸趨同的趨勢。

3.基於我國細胞領域政策趨勢和立法邏輯

政策方面，繼納入十三五、十四五規劃、健康中國 2030 後，2022年初，工信部、發改委、科技部、衛健委等九部門聯合發佈《“十四五”醫藥工業發展規劃》，提出重點發展細胞治療等新型生物藥的產業化製備技術。2022年5月，發改委發佈《“十四五”生物經濟發展規劃》，提出發展基因診療、幹細胞治療、免疫細胞治療等新技術，加快相關技術產品轉化和臨床應用，推動形成再生醫學和精准醫學治療新模式，並推動政策先行先試。

立法方面，我國在科技進步、生物安全、人遺資源管理、資料安全、科學倫理、外商投資、技術進出口等領域密集立法或修訂，構建更符合當前國內外經濟、科技發展形勢的法律體系。

我們認為，我國針對細胞治療等生物科技行業的政策和立法基本邏輯整體為“鼓勵發展、守住紅線”，具體如下：

（二）監管趨勢與中國版“雙軌制”分析

1.商業存儲的監管趨勢分析

我們認為，一段時間內將商業存儲自體庫納入保藏審批監管的可能性不大。對於“存儲”行為，仍將根據“存儲目的”進行區分監管，即僅對基於科學研究目的的樣本庫要求保藏資質，具體如下圖：

特別指出的是，無論是否取得保藏許可，從事幹細胞存儲的企業和機構均應無差別遵守《生物安全法》、人遺條例、《刑法》等法律法規中關於人遺資源出境、國際合作、人遺資訊對外提供等監管的規定。

2.細胞醫美與大健康的監管趨勢分析

一方面，部分地方政府將幹細胞醫美作為地方特色經濟來支持。如昆明市於2022年8月發佈的《昆明市細胞產業發展規劃（2021-2035年）》，在“近期重點推進”部分提出，“以臨床技術（疾病治療、醫美應用）為行業突破點，打通臨床應用環節和支付環節，實現臨床技術在多病種上的突破”；在“重點任務”部分明確，“積極發展幹細胞美容製品，引進一批擁有核心技術的醫美製造企業；推進昆明醫療機構整形美容科室建設，推動幹細胞研發等多方向研究及在修復重建、組織再生、創傷修復等的治療應用；發揮昆明旅遊勝地的流量優勢，開發以幹細胞醫療美容服務為主題的旅遊產品”。

另一方面，2021年國家藥監局修訂發佈的《已使用化妝品原料目錄》中，並未收錄“幹細胞”作為化妝品原料。我國當前備案的幹細胞臨床研究中，也少有幹細胞在美容、抗衰方面的研究。

我們認為，長遠來看，細胞技術在醫美和大健康領域的應用將分別納入低風險臨床轉化細胞項目或保健品、化妝品等管道監管。但因我國細胞製備體系和市場相對滯後、幹細胞臨床研究“雙備案”門檻較高等現實因素，將“幹細胞製品”納入化妝品、保健品原料，或按照風險分級原則調整“雙備案”門檻，在短期內落地的可能性不大，因此，未來一段時間內該領域大概率仍處於監管留白。但相關探索不會停止，如2021年1月，《中國美容整形外科雜誌》即刊發《幹細胞在整形修復美容領域研究和臨床試驗的專家共識》，旨在為幹細胞在整形修復美容領域的研究與未來臨床轉化提供參考與支援。

3.細胞治療的中國版“雙軌制”模式分析

針對是否支持細胞治療臨床轉化應用，不同地方政府表現出不同的態度，代表性的地方政策包括：

鑒於當前多數備案醫院均不具備細胞製備能力，我國細胞製備工藝成熟度和市場容量也無法滿足全面放開IIT項目臨床轉化的需求，因此完全按實施主體性質進行分類監管的可能性不大；同時，若僅依風險分級進行監管，將封閉現有多數“雙備案”專案的臨床轉化通路，使得現有IIT研究的價值大打折扣，可行性亦受限。二種模式的優劣如下：

與之對應，我國細胞行業研發、生產產能和市場需求容量又亟需釋放。

綜上，我們認為，我國對細胞治療的監管大概率將出現如下變化或趨勢（各項內容或同步推進）：

（1）對體細胞、幹細胞臨床研究的監管日漸趨同，即均施行“雙備案”；

（2）率先在“雙備案”專案中開展風險分級管理，並嘗試放開低風險專案臨床轉化應用與收費；

（3）分類型、分病種完善細胞製備體系，統一或趨同不同監管通道的同類型細胞製備標準，擴容細胞製備市場和協力廠商檢驗檢測市場；

（4）加強IIT與IST並軌管理，完善和優化IIT資料用於新藥註冊申請的路徑和機制，進一步打通“雙備案”專案成果轉化通路；

（5）利用區域創新試點機制，擇較成功區域擴大試點。

具體如下圖

結語

儘管我國細胞行業的監管存在一定不確定性，但基於影響監管模式選擇的底層邏輯和要素分析，我們仍能捕捉較多的確定性。對於不同的組織或機構，宜提前佈局應對。如從事細胞醫美的機構，積極推動細胞在美容、抗衰方面的IIT研究與轉化，逐步將細胞醫美大健康項目納入各級、各類醫療機構經營範圍，或是其合規化發展趨勢。再如，對於地方政府，積極進行主動型管理佈局，或是提高當地營商監管環境，促進當地細胞產業發展的有力措施。

參考文獻

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[9]廣州賽萊拉幹細胞科技股份有限公司2021、2022年度報告；

[10]《誘導多能幹細胞（IPSC）技術及轉化、應用核心法律機制與問題研究》德恒律師，左玉傑等。

全球首款TIL細胞療法完成FDA滾動上市申報

美國生物技術公司Iovance Biotherapeutics近日宣佈，已向FDA完成lifileucel生物製品許可申請（BLA）的滾動式遞交過程。Lifileucel是一種腫瘤浸潤淋巴細胞（TIL）治療方案，用於PD-1/PD-L1治療後進展的晚期黑色素瘤。如果順利獲批，lifileucel將成為全球首款TIL細胞療法。

TIL（Tumor Infiltrating Lymphocytes）是腫瘤間質中的異質性淋巴細胞，包括T細胞及NK細胞等。機體在發現體內的癌細胞後，調動免疫細胞深入到腫瘤組織內部，對腫瘤進行識別、抵抗和攻擊。TIL細胞到達腫瘤內部後，通過釋放細胞毒素直接殺傷腫瘤細胞。此外，TIL還能調節機體免疫功能，提高機體對腫瘤細胞的殺傷能力。

與CAR-T細胞療法類似，TIL細胞療法屬於過繼性免疫治療的一種。TIL療法從腫瘤中分離浸潤的淋巴細胞，體外擴增後回輸給患者，由於存在大量患者抗原特異性的TIL細胞，可以特異性識別患者的癌細胞進行殺傷。

Iovance公司第二代（Gen2）的生產工藝需要22天的製備週期。與此同時，該公司還在探索第3代工藝，有望將製造時間縮短到16天以減少初始腫瘤樣本和患者輸注之間的等待時間。

此次滾動上市申請基於lifileucel治療晚期黑色素瘤患者的II臨床試驗C-144-01的陽性結果。C-144-01研究入組患者為既往接受過包括PD-1抗體在內≥1次全身治療的不可切除或轉移性黑色素瘤；如果患者BRAF V600突變陽性，則採用BRAF抑制劑±MEK抑制劑聯合治療。

該研究共分為4個佇列，其中佇列1（n=30）患者接受非冷凍保存的TIL產品治療；佇列2（n=66）和佇列4（n=75）患者皆接受經冷凍保存的TIL治療；佇列3（n=~10）為重複接受TIL治療患者。

非冷凍保存的TIL產品（Gen1）是一種不通過冷凍保存的腫瘤浸潤淋巴細胞（TIL）療法。Gen1產品通常用於TIL療法開發的早期階段，其中TIL在體外擴增後立即注入患者，因此不需要被冷凍。這與冷凍保存的TIL產品（Gen2）工藝有所不同，後者會被冷凍以備後續使用，以實現長期儲存和運輸。

研究結果顯示，經過獨立影像學委員會(IRC）評估，佇列2的客觀緩解率（ORR）為34.8%；佇列4的ORR為28.7%；佇列2+4的總ORR為31.4%。

Iovance還就lifileucel的III期註冊試驗（研究代號TILVANCE-301）設計方案與FDA達成一致，該試驗是將lifileucel與K藥聯合用於一線晚期黑色素瘤的試驗，不僅旨在全面支持lifileucel獲批用於治療PD-1單抗進展後的黑色素瘤患者，同時也是為了支持lifileucel與K藥聯合用於一線晚期黑色素瘤治療方案的註冊申請。

據報導，全球每年約有32.5萬新發黑色素瘤患者，其中每年約有5.7萬患者因該病死亡；美國每年約有10萬人被診斷出患有黑色素瘤，約有7700人死於該疾病。如果獲得FDA的批准，lifileucel將成為一種在晚期黑色素瘤治療中的全新選擇

兩種擴增體系NK細胞生物學特性比較及治療異基因造血幹細胞移植後白血病復發的初步研究

Zhonghua Xue Ye Xue Za Zhi. 2022 May; 43(5): 400–407.

Chinese. doi: 10.3760/cma.j.issn.0253-2727.2022.05.009

Abstract

目的

比較不同擴增體系NK細胞生物學特性的差異以及治療異基因造血幹細胞移植後（allo-HSCT）白血病復發的療效。

方法

分別採用CD3/CD52單抗擴增法和飼養層細胞擴增法誘導供者來源NK細胞大量擴增，檢測擴增前後NK細胞表型、因數分泌、細胞毒的變化規律；選取16例allo-HSCT後復發白血病患者，8例輸注CD3/CD52單抗擴增NK細胞，8例輸注飼養層細胞擴增NK細胞，觀察患者的治療反應和長期生存情況。

結果

①與CD3/CD52單抗擴增體系相比，飼養層細胞擴增體系NK細胞純度較高、NK細胞表面活化性受體DNAM-1及NKp30表達較高、抑制性受體CTLA-4表達較低，而兩種NK細胞NKG2D/CD25/CD69/Trail/PD-1/TIM-3/TIGIT表達差異無統計學意義。②兩種擴增體系NK細胞Ki-67指數均明顯增加，以飼養層細胞擴增NK細胞尤為明顯；飼養層細胞擴增NK細胞穿孔素及顆粒酶B表達水平均明顯高於CD3/CD52單抗擴增NK細胞。③16例allo-HSCT後復發白血病患者NK細胞輸注過程中均未觀察到明顯不良反應。NK細胞輸注後中位隨訪時間為2554（917～2583）d，CD3/CD52單抗擴增組中3例患者無白血病存活，5例死亡；飼養層細胞擴增組中6例患者長期存活，2例死亡。5例患者在NK細胞輸注前存在移植物抗宿主病，NK細胞輸注後移植物抗宿主病未加重甚至緩解。

結論

CD3/CD52單抗擴增與飼養層細胞擴增體系NK細胞的生物學特性具有明顯差異；NK細胞輸注對allo-HSCT後復發白血病患者的療效仍需要進一步驗證。

Keywords: 白血病, 復發, 擴增, NK細胞

異基因造血幹細胞移植（allo-HSCT）是白血病的有效治療手段，移植後復發是影響移植療效的主要原因。目前，移植後白血病復發的常規治療方法包括化療及供者淋巴細胞輸注（DLI），但DLI可使移植物抗宿主病（GVHD）的發生風險增加[1]。因此，探討新的復發後治療方法是提高白血病患者移植療效的關鍵。

自然殺傷（NK）細胞是構成機體重要的天然免疫屏障之一，無需致敏即可殺傷腫瘤細胞或感染的細胞，通過分泌穿孔素、顆粒酶等介導靶細胞殺傷[2]–[3]，另一方面可通過分泌IFN-γ、TNF-α等活化適應性免疫系統而發揮協同免疫防禦作用[4]。除此之外，抗體依賴的細胞介導細胞毒性作用（ADCC）也是NK細胞效應功能發揮的重要途徑。

NK細胞效應功能強度受NK細胞活化性受體與抑制性受體的平衡、NK細胞的成熟度及對細胞因數的回應體內外多種因素調控。內源性NK細胞往往受疾病及自身HLA分子抑制等多方面影響，數量及效應功能受損，但研究證明來自健康供者的NK細胞具有殺傷腫瘤細胞功能[5]。然而，若輸注的NK細胞數量少、療程短，患者仍面臨腫瘤復發的風險。目前，CD3/CD52單抗法和K562飼養層細胞法是臨床應用較多的兩種NK細胞體外擴增方法[6]–[7]。本研究比較了以上兩種擴增體系NK細胞的生物學特性，並回顧性分析比較了兩種擴增體系NK細胞過繼性輸注治療allo-HSCT後白血病復發患者的安全性及初步療效。

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物件與方法

一、NK細胞擴增方法

採集健康供者外周血，提取單個核細胞，CD3/CD52單抗擴增法參照文獻[6]，飼養層細胞擴增法參照文獻[8]。

二、NK細胞採集時間點

NK細胞擴增前采外周血檢測表型及功能，體外擴增2周後檢測擴增後NK細胞表型及功能各項指標。

三、NK細胞表型及功能評估方法

  1. 表型評估：外周血來源的單個核細胞及擴增後的NK細胞，加入膜表面抗體標記，避光孵育30 min，溶血並PBS洗滌後上機檢測。抗體選擇見表1。

表1

流式細胞術評估NK細胞表型及功能所用抗體

生產商 抗體 標誌抗體 克隆號
BD CD56 BUV737 NCAM16.2
BD CD158a BV421 HP-3E4
BD CD45 V500 HI30
Biolegend NKG2D BV605 1D11
Biolegend CXCR3 BV650 G025H7
Biolegend CTLA-4 BV785 BNL3
BD CD158e FITC DX9
Biolegend CD158f PE UP-R1
Biolegend CD57 PE-CF594 12G5
BD PD-1 PE-Cy7 EH12.1
MACS NKG2C AF647 FAB138N
Biolegend CD3 AF700 UCHT1
BD CD16 APC-Cy7 3G8
BD CD25 BUV395 2A3
BD CD69 BUV737 FN50
Biolegend 4-1BB BV421 4B4-1
Biolegend CXCR4 BV605 12G5
Biolegend CD27 BV650 O323
BD TIM-3 BV711 7D3
Biolegend LFA-1 FITC/AF488 m24
BD CD94 Percp-Cy5.5 HP-3D9
BD NKP46 PE 9E2/NKp46
Biolegend CD96 PE-CF594 NK92.39
BD CD62L PE-Cy7 DREG-56
BD DNAM-1 APC/AF647 DX11
Biolegend CD56 APC-Cy7 HCD56
BD NKP30 BV421 p30-15
Biolegend TIGIT BV605 A15153G
Biolegend CX3CR1 BV650 2A9-1
BD CD107a BV786 H4A3
RD TRAIL FITC FAB687G
Biolegend NKP44 Percp-Cy5.5 P44-8
MACS NKG2A PE-Cy7 REA110
Biolegend NKp80 APC/AF647 5D12

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  1. 功能評估：對於NK細胞擴增前後細胞增殖及細胞毒的評估，則在膜表面抗體標記後，按照Cytofix/Cytoperm試劑盒（美國Becton Dickinson公司產品）說明固定破膜後標記細胞內免疫因數。抗體選擇見表1。

四、入組病例及移植方案

  1. 病例：16例患者納入本研究。8例患者輸注CD3/CD52擴增NK細胞，均為2011年2月至2014年2月在北京大學血液病研究所進行allo-HSCT且移植後白血病復發患者；8例患者輸注K562飼養層擴增NK細胞，為2016年8月至2018年6月在北京大學血液病研究所進行allo-HSCT且移植後白血病復發患者。所有患者均簽署知情同意書。
  2. 預處理方案：全部採用常規的改良BU/CY（白消安/環磷醯胺）方案，HLA配型不合患者移植預處理方案中加用抗胸腺細胞球蛋白（ATG）[9]。
  3. 幹細胞的動員和採集：全部患者採用骨髓聯合外周血幹細胞移植，所有患者均以G-CSF動員5～6 d（−3 d開始），劑量為5 µg/kg[10]–[11]。
  4. 急性GVHD的預防：採用環孢素A（CsA）聯合黴酚酸酯（MMF）及短程甲氨蝶呤（MTX）方案。
  5. 植活標準：連續3 d中性粒細胞絕對計數（ANC）≥0.5×109/L為粒細胞植活，PLT≥20×109/L連續7 d且脫離血小板輸注為血小板植活[12]。

五、患者移植後微小殘留病（MRD）監測

多參數流式細胞術（MFC）和即時螢光定量PCR（RT-PCR）用來檢測MRD[13]。MRD陽性：①MFC連續兩次陽性或者WT1連續兩次陽性抑或是在同一標本中MFC或WT1陽性各1次；②移植後出現基因重排或突變。MRD緩解：在NK細胞輸注後達到MRD陰性狀態並維持至少1個月[14]。對於骨髓中原始細胞>5％定義為血液學復發。

六、隨訪

通過查閱住院/門診病歷及電話隨訪方式獲取患者生存資料。

七、統計學處理

採用GraphPad Prism8分析資料，採用非配對t檢驗進行單因素分析，P<0.05為差異有統計學意義。

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結果

一、兩種擴增體系NK細胞生物學差異

  1. 兩種擴增體系NK細胞活化性受體的表達：CD3/CD52單抗擴增組NK細胞在CD45陽性淋巴亞群中的中位占比為18.9％，而飼養層細胞擴增的NK細胞中位數比例為85.0％，純度更高。通過對不同體系擴增前後NK細胞活化性受體的表達評估，我們發現滋養層擴增的NK細胞的活化性受體DNAM-1及NKp30的表達都明顯高於CD3/CD52單抗擴增組（P＝0.016，P＝0.006），而NKG2D、Trail占NK細胞的百分比在兩組間差異無統計學意義（P>0.05）（圖1、圖2）。CD25及CD69分別被認為是NK細胞早期活化和晚期活化的重要指標[15]。在我們的佇列中，CD25及CD69占NK細胞百分比在CD3/CD52單抗擴增組及飼養層擴增組均無明顯差別（P>0.05），提示兩種擴增NK細胞儘管在活化性受體表達方面存在差異，但兩者綜合的活化程度相當（圖1、圖2）。圖1兩種不同擴增體系NK細胞活化性受體表達

    1、2、3分別為擴增前組、CD3/CD52單抗擴增組、飼養層細胞擴增組。ns：差異無統計學意義；a P<0.05

    圖2

    兩種不同擴增體系NK細胞活化性受體平均螢光強度（MFI）

    1、2、3分別為擴增前組、CD3/CD52單抗擴增組、飼養層細胞擴增組。ns：差異無統計學意義；a P<0.05

    1. 兩種擴增體系NK細胞抑制性受體的表達：兩種體系擴增的NK細胞抑制性受體CTLA4、PD-1、TIM-3的平均螢光強度（MFI）較擴增前均明顯上調（P<0.001，P＝0.003，P＝0.001），然而Tigit的平均螢光強度無明顯變化（P>0.05）（圖3）。飼養層細胞擴增組NK細胞CTLA4（占NK細胞百分比）的表達明顯低於CD3/CD52單抗擴增組（P<0.001），而其他抑制性受體（PD-1、TIM-3、Tigit）在兩組間無論是平均螢光強度還是在NK細胞中占比差異均無統計學意義（P>0.05）。提示體外擴增誘導NK細胞活化的同時可能一定程度上伴隨功能耗竭。圖3兩種不同擴增體系NK細胞抑制性受體平均螢光強度（MFI）

      1、2、3分別為擴增前組、CD3/CD52單抗擴增組、飼養層細胞擴增組。ns：差異無統計學意義；a P<0.05

      1. 兩種擴增體系NK細胞趨化型受體的表達：NK細胞向組織臟器中的遷移依賴於其表面的各種黏附性分子及趨化性受體的表達。為此，我們評估了不同擴增體系對NK細胞表面黏附性分子及趨化性受體表達的影響，結果顯示在飼養層細胞擴增組NK細胞中CXCR3、CD96的比例明顯高於CD3/CD52單抗擴增組（P＝0.004，P＝0.037），CX3CR1及4-1BB在NK細胞的表達比例在飼養層擴增組更低，CXCR4、CD94、CD27及CD62L的比例在兩種擴增體系NK細胞間差異均無統計學意義（P>0.05），提示從黏附分子和趨化受體表達角度，兩種擴增方法各有利弊（圖4）。圖4兩種不同擴增體系NK細胞趨化性受體表達

        1、2、3分別為擴增前組、CD3/CD52單抗擴增組、飼養層細胞擴增組。MFI：平均螢光強度；ns：差異無統計學意義；a P<0.05

        1. 兩種擴增體系NK細胞功能表達差異：我們通過檢測擴增NK細胞的Ki-67指標評估其不同體系的擴增能力。結果顯示，飼養層擴增NK細胞的增殖潛能明顯高於CD3/CD52單抗擴增NK細胞（P＝0.033），穿孔素及顆粒酶B的表達水準也明顯高於抗體擴增NK細胞（圖5）。圖5兩種不同擴增體系NK細胞生物學功能比較

          1、2、3分別為擴增前組、CD3/CD52單抗擴增組、飼養層細胞擴增組。MFI：平均螢光強度；ns：差異無統計學意義；a P<0.05。Perforin：穿孔素；Granzyme B：顆粒酶B

          二、入組患者的臨床特點

          CD3/CD52單抗擴增組中男5例、女3例，4例接受同胞HLA全相合allo-HSCT，4例接受haplo-HSCT，7例患者移植時處於完全緩解狀態，1例移植前為復發狀態。至2021年6月隨訪終止時，中位隨訪時間為2 554 d，共有3例患者死亡。

          飼養層擴增組中男4例、女4例，5例接受同胞HLA全相合allo-HSCT，3例接受haplo-HSCT，8例患者移植時均處於完全緩解狀態。患者首次接受供者來源NK細胞輸注的中位時間是移植後482 d。至2021年6月隨訪終止時，中位隨訪時間1 015.5（917～1 068）d，共有2例患者死亡。

          患者主要臨床特點和NK細胞治療前情況見表2。

          表2

          16例異基因造血幹細胞移植後復發白血病患者的一般資料及NK細胞治療前情況

          例號 性別 年齡 疾病類型 移植模式 急性GVHD NK細胞輸注前化療方案 NK細胞輸注前疾病狀態
          1 男 37 AML-M2 HLA全相合 無 FLAG，HAA 血液學復發
          2 男 52 B-ALL 單倍型 無 COPD 血液學復發
          3 男 26 AML-M2 HLA全相合 無 HAA 髓外復發
          4 女 12 AML-M2 單倍型 Ⅰ度，皮膚Ⅱ度 無 MRD（+）
          5 男 21 MDS-RAEB2 單倍型 Ⅳ度（皮膚、肝） 無 MRD（+）
          6 女 46 AML-M2 單倍型 無 無 MRD（+）
          7 男 47 B-ALL HLA全相合 無 COPD 髓外復發，MRD（+）
          8 女 33 AML-M2 HLA全相合 腸道Ⅰ度 無 血液學復發
          9 女 40 AML-M2 HLA全相合 無 無 MRD（+）
          10 男 31 AML-M2 單倍型 Ⅰ度，皮膚Ⅱ度 AA MRD（+）
          11 女 54 AML-M4 HLA全相合 無 無 血液學復發，髓外復發，MRD（+）
          12 女 24 AML-M5 單倍型 皮膚Ⅰ度 AA MRD（+）
          13 男 31 AML-M2 單倍型 無 無 血液學復發
          14 男 30 AML-M2 HLA全相合 無 FLAG MRD（+）
          15 男 49 AML-M2 HLA全相合 無 無 血液學復發
          16 女 33 AML-M2 HLA全相合 無 無 MRD（+）

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          注：AML：急性髓系白血病；B-ALL：急性B淋巴細胞白血病；MDS-RAEB2：骨髓增生異常綜合征-難治性貧血伴有原始細胞增多2型；MRD：微小殘留病；FLAG方案：氟達拉賓+阿糖胞苷+G-CSF；HAA方案：高三尖杉酯堿+阿糖胞苷+阿柔比星；COPD方案：環磷醯胺+長春新堿+柔紅黴素+潑尼松；AA方案：阿柔比星+阿糖胞苷；GVHD：移植物抗宿主病

          三、安全性評價

          兩組患者在NK細胞輸注後均未觀察到發熱、血象下降、臟器功能損害等不良反應。

          四、NK細胞治療情況及療效評價

          飼養層細胞擴增組平均接受NK細胞輸注次數為1.25次，CD3/CD52單抗擴增組為2.4次。兩組共觀察到血液學復發5例（伴髓外復發1例），單純MRD持續陽性8例，單純髓外復發1例，髓外復發合併MRD陽性1例。患者NK細胞中位輸注次數為1次，移植後接受NK細胞輸注治療的中位時間為移植後434（103～1 225）d。NK細胞輸注後中位隨訪時間為2 554（917～2 583）d，復發患者緩解率為16.7％（1/6），MRD陽性患者轉陰率為54.5％（6/11），無白血病生存（LFS）率為43.75％（7/16），總生存（OS）率為56.25％（9/16）。對於持續緩解的患者，NK細胞治療後有6例患者接受化療聯合DLI，4例行2次移植。

          飼養層擴增組8例患者中6例有治療反應，其中HLA全相合移植4例，haplo-HSCT 2例，輸注過程均無明顯不良反應，其中5例患者至今無白血病長期生存，1例患者因血液復發死亡。CD3/CD52單抗擴增組8例患者中4例有治療反應，其中HLA全相合移植2例，haplo-HSCT 2例，輸注過程均無明顯不良反應，其中3例患者至今無白血病長期生存，1例因重症肺炎導致呼吸衰竭而死亡。

          而對NK細胞回輸治療無反應患者中，CD3/CD52單抗擴增組8例患者中4例無治療反應（1例為持續MRD陽性，3例為血液學復發），經化療、DLI等治療均未得到緩解，4例均死亡（死於中樞神經系統感染、重度GVHD合併TMA各1例，血液學復發2例）。在飼養層細胞擴增組8例患者中有2例無治療反應（均為MRD持續陽性），經化療後分子學及血液學復發指標均未得到緩解，其中1例NK細胞輸注後MRD仍持續陽性，但後續再行DLI治療後MRD轉陰，至今無白血病生存；另一例患者死于髓外復發。

          CD3/CD52單抗擴增組、飼養層擴增組NK細胞輸注後MRD轉陰率分別為50％（2/4）、50％（3/6）。

          滋養層擴增組的例11在接受NK細胞治療前有重度慢性GVHD（累及肺、皮膚、口腔等器官）；另有3例在移植後分別表現為皮膚、口腔及指甲、皮膚及肺部急性GVHD表現，輸注後症狀緩解。

          在CD3/CD52單抗擴增組，我們觀察到3例患者GVHD症狀在NK細胞輸注後緩解，提示NK細胞可能有抗GVHD的功能。NK細胞治療情況及療效見表3。

          表3

          16例異基因造血幹細胞移植後復發白血病患者的NK細胞治療情況及隨訪結果

          例號 NK細胞輸注次數 NK細胞輸注量（×109/L） 療效評估 隨訪時間（d） 隨訪結果
          1 2 6.20 無效 2 560 死亡（中樞神經系統感染）
          2 1 4.76 無效 2 560 死亡（重度GVHD/TMA）
          3 5 6.62 有效 2 583 存活
          4 1 4.19 有效 2 540 存活
          5 3 6.02 有效 2 540 存活
          6 1 0.36 無效 2 554 死亡（血液學復發）
          7 5 10.31 有效 2 554 死亡（重症肺炎）
          8 1 6.44 無效 2 552 死亡（血液學復發）
          9 1 6.18 有效 1 068 存活
          10 2 7.02 有效 1 064 存活
          11 1 7.10 有效 1 019 存活
          12 1 4.40 無效 917 存活
          13 1 7.32 有效 1 012 死亡（血液學復發）
          14 2 3.14 無效 994 死亡（血液學復發）
          15 1 3.82 有效 917 存活
          16 1 2.48 有效 1 047 存活

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          注：GVHD：移植物抗宿主病；TMA：血栓性微血管病

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          討論

          NK細胞是機體天然免疫屏障的重要組成，是抗病毒和抗腫瘤的主力軍之一[7]。除此之外，供者KIR不相合的NK細胞輸注至受者體內，可通過抑制受者來源的抗原提呈細胞及T細胞，降低移植物抗宿主病的發生。因此，過繼性輸注NK細胞的免疫療法已成為了潛在抗腫瘤的有效治療方式。然而，由於外周血NK細胞比例低，獲取數量少，使得NK細胞治療療效受限。體外細胞擴增體系的發展使得NK細胞可在短期（2～3周）內獲取，並且輸注的NK細胞在動物及人體中均顯示發揮抗腫瘤效應的同時不增加GVHD的發生率[5]。但是，不同擴增體系產出的NK細胞生物學特性和臨床療效存在較大差異[16]–[17]。Masuyama等[6]首次通過CD3/CD52單抗體外刺激外周血單個核細胞後聯合自體血漿及IL-2，在無飼養層細胞體系中實現了NK細胞的量級擴增，且抗腫瘤功能增強。儘管該無飼養層體系擴增NK細胞比例相對較高，但培養14 d後的擴增細胞中CD8+T細胞及CD4+T細胞比例中位值分別為60％、15％。隨著體外擴增體系的完善，體外飼養層細胞擴增體系擴增NK細胞效率更佳[14]。然而體外飼養層細胞擴增體系需要大量且持續的因數刺激，當輸注至體內後，細胞因數刺激驟失將導致輸注後NK細胞代謝加快。本研究首次對CD3/CD52單抗擴增NK細胞與K562飼養層擴增NK細胞的生物學差異進行探討，結果顯示，以K562飼養層擴增的NK細胞純度較高、T細胞含量較低。兩種不同擴增體系NK細胞活化性受體表達及KI-67均明顯高於擴增前NK細胞，說明NK細胞擴增同時伴隨著功能活化，尤以飼養層擴增組NK細胞的增殖水準及活化性受體DNAM-1及NKP30的表達水準更高，而抑制性受體CTLA4表達明顯低於CD3/CD52單抗擴增組，抑制性受體PD-1、Tigit及Tim-3的表達在兩組間無明顯差異。以上結果提示飼養層擴增的NK細胞的抗腫瘤能力可能更強。值得注意的是，兩組擴增後NK細胞的活化性受體明顯增加，抑制性受體相較於擴增前組也明顯上調，這與Judge等[18]的報導一致，可能是擴增NK細胞為了防止過度活化的適應性調控。

          既往有研究前瞻性評估不同體系擴增的NK細胞在治療AML中的療效，結果提示過繼性NK細胞輸注在治療低白血病負荷中有優勢[8],[14]，然而尚未有研究報導不同體系擴增的NK細胞在治療AML中的療效差異。在本研究中，兩種不同擴增體系NK細胞在生物學特性上存在差異，兩種擴增體系NK細胞輸注對移植後血液學復發白血病患者均無顯著療效；而對持續MRD陽性患者來說，在CD3/CD52單抗擴增組和飼養層擴增組，分別有50％（2/4）、50％（3/6）的MRD陽性患者NK細胞治療後轉陰，提示NK細胞治療可能有清除體內MRD作用，並且以飼養層擴增NK細胞效果更好，這可能與飼養層擴增的NK細胞活化性受體表達更高有關；與此同時，本研究結果表明飼養層擴增NK細胞趨化型因數受體CXCR3與CXCR4的表達均明顯高於CD3/CD52單抗擴增NK細胞，提示飼養層擴增NK細胞的遷移速度與向骨髓的趨化能力更高，也更有利於擴增NK細胞向腫瘤部位的遷移[19]。同時，Denman等[20]的研究表明裝載IL-21的K562細胞作為飼養層細胞體外擴增NK細胞的端粒酶更長，提示滋養層擴增NK細胞可能體內存活時間更長。

          在本研究中，兩種擴增體系NK細胞治療移植後復發白血病患者並未引起或加重GVHD，且兩組均有部分患者的急慢性GVHD症狀在NK細胞輸注後得以緩解，提示NK細胞輸注治療的安全性良好。既往研究表明NK細胞在抗白血病細胞的同時具有抗GVHD效應[5]，這得益於NK細胞對效應性T細胞的功能和數量制約：一方面NK細胞可殺傷供者來源的T細胞，同時可通過殺傷不成熟的樹突狀細胞減少抗原提呈[21]–[22]。與此同時，異基因來源的NK細胞不損傷患者的靶器官，因此不會發生GVHD和細胞因數風暴（CRS）。

          本研究結果初步顯示，CD3/CD52單抗擴增與飼養層細胞擴增體系NK細胞的表型和功能具有明顯差異，兩種擴增體系NK細胞在治療移植後持續MRD陽性均有效。本研究為回顧性研究且佇列樣本數少，因此NK細胞輸注對allo-HSCT後復發白血病患者的療效仍需要進一步驗證。

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          Footnotes

          利益衝突 本研究所用NK細胞產品由北京賽傲生物技術有限公司提供

          作者貢獻聲明 曹勳紅：資料收集、資料分析、文章撰寫；趙翔宇：研究設計、寫作指導；其他：資料收集

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年輕的NK免疫細胞有望延緩衰老過程，治療年齡相關疾病

衰老是一種隨著時間推移機體組織器官功能逐漸喪失的過程。衰老不僅導致組織修復能力的減退，也伴隨著多種衰老相關疾病的發生。

衰老是大多數慢性疾病的最大危險因素，這些慢性疾病包括心血管疾病、癌症、阿爾茨海默症和其他與衰老相關的神經退行性疾病。其中，免疫功能損害（又稱為免疫衰老，指的是與年齡相關的免疫功能下降），是這些慢性疾病患者發病和死亡的重要原因之一。 近日，英國拉夫堡大學研究人員在cells雜誌上發表綜述表明，NK細胞是衰老細胞免疫監視的核心參與者，隨著年齡的增長而增加，其細胞毒性和功能不斷下降，會增加感染、惡性腫瘤、炎症性疾病等疾病的發生幾率，作者認為改善NK細胞的衰老在治療與年齡相關疾病和延緩生物衰老過程中起到重要作用。

01、NK細胞——“全能型”免疫細胞

NK細胞又稱自然殺傷細胞，是一類能非特異性殺傷腫瘤細胞和病毒感染細胞的淋巴細胞，主要分佈於骨髓、外周血、肝、脾、肺和淋巴結，約占血液中所有免疫細胞（白細胞數量）的15%，屬於天然免疫系統的核心細胞。NK細胞不需要接受免疫系統的特殊指令，也不需要其他細胞的配合，自己單獨就能識別並清除病原微生物，是一種兼具免疫監視、免疫應答、免疫記憶三大功能於一身的“全能型”免疫細胞。

1）抵禦病毒: NK細胞對產生免疫逃逸的病毒有效，NK細胞會殺死被感染的細胞，避免這些細胞成為病毒培養基地，阻止更多病毒的複製產生。在臨床已經證明對這類病毒如甲型流感病毒、乙肝病毒、愛滋病毒、丙肝病毒均有效，對此次全球肆虐的新冠病毒也同樣奏效。那些免疫力強而躲過新冠病毒的人，正是因為體內這種抵禦病毒的免疫細胞發揮功效的能力強而免遭一難，它的數量和活力決定了發揮功效的強弱。

2）防癌抗癌: NK細胞具有廣譜的抗腫瘤作用，幾乎對所有常見的癌細胞類型都有殺傷作用，包括肺癌、乳腺癌、肝癌、淋巴癌、食道癌等。在最新的研究中，NK細胞療法已經被廣泛應用於各種癌症治療，包括：血液系統腫瘤、神經母細胞瘤、卵巢腫瘤、橫紋肌肉瘤、乳腺癌、胃癌等，並在這些研究中取得不錯治療效果。

3）抗衰老

免疫的衰老和人體的衰老是密切相關的。一方面，免疫細胞是清除衰老細胞的，但是另一方面伴隨著衰老的發生，免疫系統也會面臨衰退。20歲到45歲期間，免疫細胞活力最好，功能比較完善，45歲之後機體免疫功能開始衰退，免疫細胞活力下降，各種疾病接踵而來。 經醫學驗證，自體免疫細胞保健不僅是目前國際上最前沿的高科技保健方式之一，也是21世紀最科學最安全的保健手段。免疫細胞抗衰保健療法利用先進的分子生物學和細胞生物學技術，將血液中分離出來的免疫細胞在人體外進行一連串的啟動與擴增，再補充到人體內，對病變的細胞進行補充與調控，啟動衰老細胞功能，增加正常細胞的數量，提高細胞的活性，改善細胞的品質，防止和延緩細胞的病變，恢復細胞的正常生理功能，從而實現緩解疾病症狀、對抗衰老的目的。

NK細胞的作用機制：

1）NK可釋放穿孔素、顆粒酶，穿孔素在靶細胞表面穿孔，使顆粒酶b進入靶細胞誘導靶細胞凋亡。

2）分泌大量的細胞因數，如ifn-v、tnf-x、gm-csf、il-3、m-csf等，直接作用於靶細胞，或通過進一步啟動其他種類免疫細胞攻擊靶細胞。

3）表達可以誘導細胞凋亡的蛋白（fasl）和腫瘤壞死因數相關凋亡誘導配體（trail），使靶細胞進入程式性凋亡狀態。

多項研究證實，NK細胞是衰老細胞免疫監視的主要參與者，隨著年齡的增長而增加，但與此同時，研究還證實NK細胞的細胞毒性和功能會隨著年齡增長而下降，釋放的細胞因數減少，影響了它們與其他免疫細胞及其靶細胞相互作用的能力。因此，隨著年齡增長，NK細胞數量和火星降低，作用不如從前，這會增加病毒感染和罹患癌症的風險。

02、年輕的免疫細胞：疾病治療的新焦點

2021年，美國明尼蘇達大學醫學院的學者在《Nature》上發表了相關文章，證實了衰老和免疫細胞衰老之間的聯繫。 研究者採用特異性敲除ERCC-1的方法來讓小鼠的免疫“未老先衰”，敲除基因後，小鼠出現了類似正常衰老小鼠的免疫特徵，證明小鼠模型中免疫細胞確實出現了衰老的症狀。研究者再將ERCC-1敲除小鼠的免疫細胞移植給衰老小鼠，發現衰老小鼠的衰老速度變快，並且壽命也更短，證實了衰老的免疫細胞對衰老小鼠的作用的確是“雪上加霜”。 反之，將年輕健康小鼠的免疫細胞移植給衰老小鼠，一個月後檢測，發現相關的衰老標誌物水準顯著減少，小鼠體內多處的組織和器官的衰老發生逆轉。證實了年輕的免疫細胞可一定程度逆轉衰老小鼠的衰老。2021年，安德森癌症中心的研究人員發表在《The Journal Of Clinical Investigation》雜誌上的一項研究表明，回輸健康的免疫細胞，可有效抑制癌細胞的轉移，延長生存率。

近年來，越來越多的研究將健康的、年輕的免疫細胞與疾病治療相關聯。當前通過輸注外源性的年輕、健康的免疫細胞來治療疾病已在臨床研究取得了較好的成效，其安全性及有效性都獲得了肯定。

03、真實研究，NK可以延緩衰老

長征醫院、上海免疫學研究所、原能細胞三家機構近期在《Frontiers in Immunology》雜誌上共同發佈了 關於自體NK細胞輸注對年齡相關免疫特徵表徵影響的研究資料，進一步佐證了通過自體NK細胞延緩衰老這一方法的可行性和有效性。

研究人員入組37例符合條件的中年健康受試者，其中32例靜脈注射NK細胞，5例靜脈注射生理鹽水。使用流式細胞術檢測輸注後4周內外周血衰老和衰竭T細胞比例的變化，以及血清中衰老相關分泌表型相關因數(SASP)的水準。體外共培養實驗研究了NK細胞介導對衰老或衰竭T細胞的細胞毒活性。最後對NK細胞擴增前後的功能和表型變化進行了表徵。 研究結果顯示，NK細胞輸注後1周和4周，表現為CD28-、KLRG1+的CD4+ T細胞和CD8+ T細胞顯著減少。這代表T細胞衰老指標顯著得到改善。

▲ NK細胞輸注後1周和4周，流式細胞術分析得到的 CD28 – 、KLRG1+的CD4+  T細胞和CD8+ T細胞的百分比 圖1

細胞輸注後，衰老T細胞減少 NK細胞輸注顯著降低了 包括IL-6、IL-8、IL-1α、IL-17、MIP-1α、MMP-1β以及MMP1在內的SASP相關因數，進一步提示NK細胞輸注能夠有效改善衰老指標。 這項研究首次從資料層面證實了自體NK細胞輸注是顯著緩解T細胞衰老、衰竭，抑制關鍵成分SASP的有效方法。

總  結： 以上種種都說明了同一個問題，即NK細胞具有延緩衰老，提高機體自身免疫能力的作用。衰老是一種隨著時間推移機體組織器官功能逐漸喪失的過程。衰老不僅導致組織修復能力的減退，也伴隨著多種衰老相關疾病的發生。

首個CAR-NKT細胞療法臨床試驗，顯示出良好的神經母細胞瘤療效

嵌合抗原受體T細胞療法（CAR-T）在血液系統惡性腫瘤取得了顯著治療效果，FDA自2017年以來先後批准了5款CAR-T細胞療法上市，但實體癌患者仍然對CAR-T細胞療法有很大的耐藥性。導致這種耐藥性的因素包括含有抗腫瘤潛能不同的細胞的異質輸注產品、常規T細胞到腫瘤部位的運輸不良、腫瘤微環境中T細胞效應功能的抑制以及腫瘤通過抗原丟失或其他機制逃逸。與此同時，其他類型的具有先天抗腫瘤特性的免疫效應細胞，例如NK細胞、NKT細胞、γδT細胞，正在被用來開發新型細胞療法。

神經母細胞瘤（Neuroblastoma）是兒童時期最常見、最致命的實體瘤之一。儘管已有多種治療方法，包括強化骨髓清除化療、骨髓幹細胞移植、視黃酸治療，以及抗GD2單抗，但只有約50%的患者能夠實現長期緩解。神經母細胞瘤細胞表面特異性高表達GD2，GD2靶向的CAR-T細胞療法在1期臨床試驗顯示，該療法安全性良好，但很少產生持久臨床反應。近日，貝勒醫學院的研究人員在國際頂尖醫學期刊 Nature Medicine 上發表了題為：Anti-GD2 CAR-NKT cells in relapsed or refractory neuroblastoma: updated phase 1 trial interim results 的研究論文【1】。這項1期臨床試驗評估了基因工程自然殺傷T細胞免疫療法（CAR-NKT）治療神經母細胞瘤的安全性、抗腫瘤活性和免疫學特性。這是CAR-NKT細胞療法的首個人體臨床試驗的最新中期結果，試驗結果顯示，該療法耐受性良好，還觀察到了其抗腫瘤活性較強的早期證據，客觀緩解率為25%（3/12），其中2人部分緩解，1人完全緩解。

在這項研究中，NKT細胞被修飾為表達GD2特異性嵌合抗原受體以及IL-15，GD2使NKT細胞能夠靶向神經母細胞瘤細胞，而IL-15能夠增強NKT細胞存活。2020年10月，該團隊在 Nature Medicine 發表論文【2】，報告了參加該試驗的前三名神經母細胞瘤兒童患者的中期結果。

在這篇最新論文中，研究團隊描述了12名對其他治療有耐藥性的4期復發神經母細胞瘤患者的治療結果。他們發現，在四種劑量水準下，CAR-NKT細胞療法對所有12名患者都是安全的，沒有劑量限制性毒性。3名患者對治療有客觀反應，包括1名患者完全反應和2名患者部分反應。另外還有2名患者也顯示出抗腫瘤活性的證據，但未達到部分緩解標準。

貝勒醫學院兒科血液學和腫瘤學副教授、論文共同通訊作者 Andras Heczey 博士表示，對在幾名神經母細胞瘤患者中觀察到的抗腫瘤活性證據感到鼓舞，特別是因為這項試驗仍處於劑量遞增階段。

該團隊之前的研究表明，在臨床前動物模型中，NKT細胞可以定位到腫瘤部位。而這項臨床試驗在人類身上證實了這些觀察結果。此外，該還發現，CAR-NKT細胞的體內增殖與抗腫瘤活性升高之間存在相關性。

貝勒醫學院兒科血液學和腫瘤學教授、論文共同通訊作者 Leonid Metelitsa 博士表示，在這項臨床研究中，我們證實了在輸注的NKT細胞上表達的CD62L生物標誌物，可以預測更高的NKT細胞體內擴增和患者的抗腫瘤活性。該研究還發現，在輸注的CAR-NKT細胞中，BTG抗增殖因數1（BTG1）基因的上調表明細胞耗竭並限制了CAR-NKT細胞的功能活性。在小鼠模型中，降低CAR-NKT細胞中BTG1的表達，增強了它們對神經母細胞瘤的治療活性。

這項研究為GD2 CAR-NKT細胞對神經母細胞瘤的抗腫瘤活性提供了有希望的初步證據。這也激發了人們的希望，新的免疫治療策略有望改善患有神經母細胞瘤的兒童的預後。基於安全性和抗腫瘤活性的有希望的證據，研究團隊進一步進行了更高劑量的GD2 CAR-NKT細胞療法的試驗，在這些額外的佇列完成後，研究團隊將進行2期臨床試驗，以評估這種新型免疫療法的抗腫瘤活性。

論文連結：

https://www.nature.com/articles/s41591-023-02363-y

https://www.nature.com/articles/d41586-023-01473-4

體內的衰老細胞是生是死？決定權在NK細胞手上

免疫系統被稱為世界上最好的醫生，而NK細胞是人體免疫系統的核心細胞，它是體內負責殺傷老化、受病毒感染、腫瘤等異常細胞的最主要“戰士”。在我們人體內扮演著重要的角色，與我們的健康息息相關。日前，《Journal of Leukocyte Biology》雜誌發表的論文綜述了衰老細胞如何觸發免疫反應，特別是NK細胞識別和清除衰老細胞的能力 [1]。其中提到，NK細胞為基礎的抗癌治療是有希望的，同時NK細胞免疫治療應被視為衰老治療的一部分。

你知道免疫衰老嗎？隨著年齡增長，NK細胞功能下降

隨著年齡的增長，NK細胞失去了功能，從而使我們更容易受到病毒性疾病和腫瘤形成的影響[4]。年齡越大，因流感住院或死亡的風險就越高[5]。當你年輕的時候，NK細胞是你先天免疫系統的一部分，可以摧毀新的病毒毒株[6]。但由於NK細胞功能隨著年齡的增長而下降，因此，很容易感染新的病毒毒株。同樣，由於NK功能下降不能早期破壞惡性細胞，老年人患癌症的風險增加。NK細胞是先天免疫系統的淋巴細胞，具有細胞溶解活性，能夠迅速處理應激細胞。它的工作原理是觸發被病毒或惡性腫瘤轉化的細胞凋亡（程式性細胞死亡）[7]。如果沒有這種關鍵的防禦機制，病毒可能會在全身傳播，而癌症細胞可能會形成侵襲性、轉移性腫瘤。因此，這些細胞的健康對強大的免疫系統至關重要。但是，隨著年齡的增長，NK細胞功能會迅速下降，這是免疫系統自然衰退的一部分[8]。這種免疫功能的退化在醫學上也被稱為免疫衰老。

NK細胞是衰老細胞的哨兵

細胞衰老是一種導致細胞週期停滯的細胞應激反應，在組織穩態和癌變過程中發揮著關鍵作用。衰老是一種基於複製、基因毒性或致癌損傷後細胞週期長期停滯的細胞程式[9]。衰老細胞具有抗凋亡和代謝活性，產生大量可溶性因數，統稱為衰老相關分泌表型（SASP）。SASP的組成包括細胞因數、趨化因數、生長因數和蛋白酶。通過這種方式，衰老細胞參與胚胎發生[10]、創傷癒合[11]、和癌症期間的組織重塑[12]。衰老細胞在衰老組織中積累，從而導致組織功能障礙。在衰老過程中免疫系統的減弱可能是造成這種累積的原因，免疫細胞不再能夠有效地識別衰老細胞。研究發現，在老年人中， NK細胞和CRP水準(被評估為炎症標誌物)之間呈負相關，從而推測NK細胞有助於控制炎症，並執行衰老細胞免疫監視任務。NK細胞通過一種機制殺死衰老細胞，該機制涉及穿孔素和含有顆粒酶的顆粒胞吐作用，並在衰老細胞相互作用後產生IFN-γ，這導致了NK細胞介導的衰老細胞免疫清除不僅依賴於直接殺傷，還依賴於細胞因數的產生，從而促進巨噬細胞的活化。NK細胞和巨噬細胞已被證明可以在衰老細胞免疫監測中發揮重要作用，啟動受體NKG2D和DNAM-1能夠迅速識別應激細胞，使NK細胞成為衰老細胞的哨兵。

當衰老遇上腫瘤，NK細胞同樣一拳“掃清”

衰老腫瘤細胞被NK細胞識別和殺死的第一個證據源於Scott Lowe小組的發現，即小鼠肝癌中p53的恢復導致腫瘤消退，這是由於包括NK細胞在內的先天免疫反應清除了衰老腫瘤細胞[13]。這項研究改變了人們對衰老的看法，細胞衰老不僅是一種對細胞增殖施加障礙的細胞自主機制，而且是一個涉及免疫系統對衰老細胞的識別的過程。衰老細胞和免疫系統的細胞相互作用，深入塑造組織穩態，在致癌和腫瘤進展過程中進行組織重塑。從機制角度來看，肝癌細胞中p53再啟動的模型已經表明，雖然NK細胞耗竭導致腫瘤根除延遲，但NK細胞在識別清除衰老細胞後，同時也會促進腫瘤消退。

NK細胞與巨噬細胞在衰老細胞免疫監視中起主要作用，並及時清除衰老細胞。當前，許多研究致力於使腫瘤細胞更容易被NK細胞殺死，但研究發現，衰老細胞優先被NK細胞識別和清除，這些發現擴展了NK的應用領域。關於衰老的研究從最初的關注衰老的增殖抑制，到如今的細胞衰老的研究，人們對於衰老的認知越來越全面。由於衰老細胞優先被NK細胞識別和清除，那麼是否可以設想一種聯合治療，使腫瘤細胞被迫衰老，然後通過NK細胞去除衰老的腫瘤細胞，以達到治療腫瘤患者的目的。由於NK細胞的抗癌療法很有前景，相信隨著研究的逐漸增加，實現這一設想造福更多患者不是夢。

【參考文獻】

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Nature | CAR免疫細胞：設計原理、耐藥性及下一代方向

Nature | CAR免疫細胞：設計原理、耐藥性及下一代方向

原文連結：https://www.nature.com/articles/s41586-023-05707-3

嵌合抗原受體（CAR）療法在B細胞和漿細胞腫瘤中表現出顯著的臨床活性，驗證了該療法類別在液態癌症中的使用，然而，耐藥性和應用範圍的限制仍是廣泛應用的難題。這篇綜述回顧了當前CAR的免疫生物學和設計原則，並介紹了預計將推動未來臨床進展的新興平臺。該領域正在快速擴展下一代CAR免疫細胞技術，這些技術旨在提升療效、增強安全性和可接入性。在提升免疫細胞適應性、啟動內源性免疫、武裝細胞以抵抗腫瘤微環境的抑制，以及調節抗原密度閾值的方法上已取得了實質性的進展。越來越複雜的多特異性、邏輯門控和可調節CAR顯示出克服耐藥性和提高安全性的潛力。隱蔽式、無病毒和體內基因傳遞技術的初步發展為降低細胞療法的成本和提高其廣泛應用提供了可能性。CAR T細胞在液態癌症中持續的臨床成功正在推動越來越複雜的免疫細胞療法的發展，這些療法預計在未來幾年內將轉化為用於治療實體瘤和非惡性疾病的治療方法。

引言

嵌合抗原受體（CAR）是合成模組化蛋白，可重定向免疫細胞以應對在惡性腫瘤細胞上表達的目標抗原。這種靈活的平臺在治療B細胞和漿細胞惡性腫瘤方面已經顯示出了顯著的臨床效果，因此，這種療法的應用潛力正推動著科技的快速發展以及來自學術界和生物製藥行業的大規模投資。美國食品和藥物管理局（FDA）已經批准了六種CAR T細胞產品，包括用於大B細胞淋巴瘤（LBCL）、B細胞急性淋巴細胞白血病（B-ALL）、濾泡狀淋巴瘤和其他12種病症的治療。在關鍵的臨床試驗中，CD19-CAR療法在LBCL的二線治療中表現優於標準護理療法（SOC），並且作為一線治療非常有效，為其在早期疾病階段的應用鋪平了道路。現在，針對CD19的CAR療法已經不再是唯一選擇。有兩種針對BCMA（又名TNF受體超家族成員17）的CAR T細胞療法已經獲得了美國食品藥品監督管理局（FDA）的批准，用於治療多發性骨髓瘤。此外，還有針對其他目標的CAR療法在治療其他類型的白血病和淋巴瘤中也展示了很高的效果，包括CD22、CD30、CD7、CD20和GPRC5D。為了降低CAR T細胞治療的風險，現在已經有標準的毒性評估和管理流程，使得與CAR T細胞治療相關的死亡率得以降低雖然我們在CAR-T細胞療法上取得了一些進展，但仍有很多問題需要解決。對於接受商業化CAR-T細胞治療的B細胞癌症患者來說，只有不到一半的人能得到持久的疾病控制。在實體腫瘤的治療上，CAR-T細胞療法雖然顯示出一些有效性，但是持久並且一致的高效反應的證據仍未明確。此外，從患者體內提取細胞製備CAR-T細胞的過程既耗費時間又需要大量資金，而現在的商業化生產能力還無法滿足所有的臨床需求。該綜述闡述了對CAR-T細胞免疫生物學的當前理解，強調了癌症中的耐藥機制、設計原則，以及增強療效的新興方法。我們主要關注開發用於癌症治療的CAR T細胞，但許多原則與其他用於癌症的免疫細胞療法和開發用於非惡性疾病的細胞療法的新興嘗試有關。

CAR-T免疫生物學及其耐藥機制

許多團體長期廣泛地致力於為癌症開發免疫細胞療法，這些努力對於CAR-T療法的成功至關重要（圖1）。CAR是由Eshhar和他的同事們發明的，目標是利用自然T細胞的擴張、殺傷和持久性，同時克服T細胞受體（TCR）的主要組織相容性複合體（MHC）限制，以實現更廣泛的治療適用性。經過許多集團的反復優化，一個融合了scFv作為抗原結合域、鉸鏈/跨膜域、TCRζ和CD28或4-1BB共刺激末端結構域的受體，最終成為了CAR的原型（圖2）。這種結構被FDA批准的六種藥物中的五種採用，而第六種藥物則在保持同樣的結構的基礎上，使用兩個納米抗體重鏈（Vhh）作為抗原結合區。1.5-2.2千基對（kb）的受體的抗原結合過程在很大程度上複製了自然T細胞中由TCR-CD3複合體介導的抗原特異性啟動和殺傷，然而，CAR T細胞和自然T細胞的生物學之間存在顯著差異，這為這些治療劑的應用提供了機遇和挑戰。

 

 

由於抗原調節產生的耐藥

CAR和TCR信號傳導之間的一個主要區別是，CAR需要更高的抗原密度才能完全啟動T細胞。儘管單鏈變數片段（scFvs）與TCRs相比具有更高的親和力，並且CAR的表達密度通常比TCR-CD3複合體高，但TCRs對每個抗原呈現細胞中不到100個肽就可以完全引發啟動，而CAR則需要每個目標細胞上有超過1000個目標分子。這種差異的原因包括CAR對近端激酶招募的減少，免疫突觸的發展程度較低，共受體的參與程度減少，以及對下游負調節因數的更大誘導，其中部分與強直信號有關，其中CAR的聚集，通常由scFv驅動，誘導抗原無關的啟動。CAR原型設計的修改在一定程度上可以調整抗原密度閾值，其中調節信號強度、scFv親和力、CAR表達密度、鉸鏈/跨膜結構和突觸間距的特徵都會產生重要影響（圖2）。由於更大的信號強度降低了抗原密度閾值，因此增強T細胞適應性的特徵，無論CAR設計如何，也會降低CAR抗原密度閾值。這些見解對於開發安全有效的CAR T細胞療法至關重要，因為毒性和有效性與靶向抗原的表達特性密切相關。靶向那些對生命至關重要的組織中不存在的分子的CAR，例如B細胞系列抗原，應被設計為在低抗原密度下啟動，以降低低抗原復發的風險，而靶向那些在癌症中高度表達但在重要的組織中表達低的分子的CAR，應被設計為具有更高的抗原密度閾值，以利用基於差異抗原密度的治療視窗。

抗原調節是B細胞惡性腫瘤中CAR T細胞失去作用的主要原因，而在實體瘤中，大部分可靶向的抗原都表現出顯著的異質性，這可能會帶來更大的挑戰。在兒童和青少年的B細胞急性淋巴細胞白血病(B-ALL)中，約50%的復發與CD19喪失有關，而在大B細胞淋巴瘤(LBCL)中，約30%的復發為CD19陰性，另有30%的復發在商業化CAR的抗原密度閾值以下表達CD19。多發性骨髓瘤中BCMA-CAR T療法對抗原變化的抵抗作用定義不明確。基礎的BCMA表達水準在患者中異質性大，且與臨床反應無關。BCMA喪失 — 與基因突變和缺失相關 — 是抵抗的罕見原因（不到5%的病例），然而，在BCMA-CAR治療後可觀察到抗原調節。抗原密度可以通過各種機制進行調節，包括基因突變、RNA選擇性剪接、細胞譜系轉換、表觀遺傳、轉錄後機制、胞啃作用、超糖基化以及抗原脫落。一些目標的下調可以通過小分子藥物進行治療干預，如用bryostatin來上調CD22，用 azacitidine來上調CD70，以及用γ-分泌酶抑制劑來上調BCMA，這些藥物能抑制抗原脫落。

T細胞功能低下導致耐藥

CAR T細胞抵抗的第二個主要原因與T細胞的效能、持續性、功能持久性和/或功能障礙不足有關，這通常與在沒有抗原調節的情況下疾病復發有關。功能障礙通常是由T細胞耗竭引起的，這是通過全域轉錄和表觀遺傳重程式設計引導的終末分化的結果。在T細胞收集、製造的CAR T細胞產品中，有時可以觀察到T細胞耗竭，而經過高腫瘤負荷後也會誘導耗竭。CAR結構中的內部因素也會導致耗竭，其中共刺激領域起主要作用。與4-1BB和第一代CARs相比，CD28協同刺激的CARs表現出更快更大的擴增，分泌更多的炎性細胞因數，而且由於T細胞耗竭，其存在的時間相對較短。在某些情況下，4-1BB和第一代CARs可能可以持續存在數年。在存在強直信號（tonic signalling）的CARs中，CD28協同刺激結構域對於加速T細胞耗竭的影響尤為顯著。強直信號的影響取決於信號的強度，並且與環境有關，一些CARs在存在強直信號的情況下可以表現出更好的功能和持久性。通過在CD3ζ或CD28結構域中進行突變，降低基於CD28的CARs的信號強度，可以減輕其對T細胞耗竭的傾向，從而提高其持久性。值得注意的是，最近一項長期跟蹤研究表明，長壽的CARs都是CD4陽性的，這引發了一個設想：這一亞群可能更不容易耗竭，從而展示出更高的持久性。

CD28與4-1BB協同刺激的CARs存在時間較短的臨床效應因疾病而異。在大B細胞淋巴瘤（LBCL）中，腫瘤的消除發生得非常快，CD28和4-1BB協同刺激的CAR T細胞表現出類似的療效。然而，在B細胞急性淋巴細胞白血病（B-ALL）中，CAR T細胞的存在時間超過6個月與復發率增加有關——因此，除非患者在CAR治療後接受骨髓移植以鞏固緩解狀況，否則CD28協同刺激的CAR T細胞的效果較差。在多發性骨髓瘤中，抗BCMA-CAR T細胞的功能持久性與回應時間的延長相關。目前還不清楚對於實體瘤來說，是更偏好CD28還是4-1BB的協同刺激，因為強烈的信號強度和持久性都是desirable。同時包含CD28和4-1BB協同刺激結構域的CARs並未表現出優勢，這使得研究人員開始嘗試整合新的或者合成的協同刺激結構域，目標是賦予最大的信號強度和持久性。通過CAR的合併篩選，已經用來識別最佳的CAR信號結構域和設計，並闡明CAR設計原則。全基因組CRISPR篩選已經確定CD2-CD58軸作為T細胞效能的介導者，並已證明IFNγR信號傳導在實體瘤中（而非液態瘤）對於CAR T細胞的粘附和細胞毒性是必需的。CAR T細胞的效能也受到腫瘤微環境（TME）中的免疫抑制分子（TGFβ、IL-10、IL-6和檢查點分子）的限制，目前正在進行的工作包括將CAR T細胞療法與免疫調節劑結合，旨在啟動TME內的免疫應答，並賦予免疫細胞抵抗特定的免疫抑制介質的能力（見box1）。

 

 

轉運受損與局部給藥

另外，受損的到達腫瘤部位的運輸可能也會限制CAR T細胞的效果，特別是在實體瘤中。在中樞神經系統腫瘤的預臨床模型中，腫瘤內或腦室內（ICV）給藥已經顯示出改善療效，局部劑量大約降低十倍就能達到與靜脈給藥相同的效果。幾項臨床試驗已經證明了將CAR T細胞局部區域性地輸入到中樞神經系統的安全性，對於一位多形性膠質瘤患者，ICV輸送的IL-13Rα2 CAR T細胞誘發了完全反應，而腫瘤內給藥則未見有效。在一項對彌漫性中線膠質瘤患者的研究中，ICV輸送的GD2-CAR T細胞誘發了抗腫瘤效果和臨床反應，並且重複給藥與持續的益處相關，這提出了一個可能性，即向中樞神經系統的輸送可能消除免疫敏化，這可能限制了多劑量靜脈CAR T細胞方案的有效性（ In a study of patients with diffuse midline gliomas, ICV delivery of GD2-CAR T cells induced antitumour effects and clinical responses, and repeated dosing was associated with sustained benefit, raising the prospect that delivery to the central nervous system may abrogate immune sensitization, which has probably limited the effectiveness of multidose intravenous CAR T cell regimens.）。在涉及胸膜的肺癌患者中，間皮素-CAR T細胞的區域遞送與PD-1阻斷相結合，介導穩定的疾病和代謝反應。另外，正在研究的策略是讓T細胞自身產生IL-7和CCL19，以改善它們對腫瘤微環境的定位和在其中的持久性。

下一代CAR-T細胞

本節將討論用於克服腫瘤抗性機制、增強免疫細胞活力、提高特異性、調整CAR信號、提高安全性和增加抗原敏感性的各種下一代平臺。

減少抗原逃逸

雙特異性CAR靶向可通過施用混合細胞產品、兩個受體的雙區表達、兩個scFvs併入一個受體或多個CAR的共同轉導來實現，每種方法都帶來了機遇和挑戰。共同輸注（co-infusion）在經濟、人力和細胞資源上都需要大量投入，而共同轉導（co-transduction）會生成多樣性的產物，這種情況下可能會出現某一亞群體在輸注後主導整個細胞群體，從而產生風險。雙區表達可能會導致蛋白表達降低，在一項臨床試驗中，雙區表達的CAR-T顯示出有限的持久性。已經報告了幾項針對CD19加CD20或CD22的雙特異性受體的試驗，在其中一項中，該受體對CD22的效力降低，而且腫瘤細胞變種顯示出CD19的表面表達量低或無表達。FDA近期批准的BCMA-CAR（雙特異性駱駝抗體胞外域結合部位抗原受體）cilta-cel，包含在一個受體中的兩個串聯Vhh結合物，它們可以結合到BCMA上的兩個不同的表位。cilta-cel的臨床結果顯示，83%的患者達到了嚴格完全緩解（sCR），並且在27個月的無進展生存率（PFS）為55%，這是到目前為止使用CARs治療多發性骨髓瘤報告的最高值（表1）。總的來說，多特異性CARs的臨床資料還處於初期階段，但已經展示出安全性和通過減少抗原逃逸來提高效果的潛力。

為降低抗原密度閾值而設計的新型受體也在開發中。Katsarou和他的同事已經表達了一種嵌合的共刺激受體(CCR)，它缺乏cd3ζ結構域，並報告說，CCR的參與在非常低的抗原密度下啟動了CAR-T細胞，防止了臨床前模型中的抗原低逃逸。對非CAR T細胞抗原產生抗腫瘤反應–如在一位患有橫紋肌肉瘤的患者接受CAR T細胞治療後所報導的–可能會減少由抗原調節引起的抗性。有幾種方法正在開發中，以增強先天和適應性免疫（box1），包括CAR介導的免疫刺激RNA RN7SL1的傳遞，共同表達配體或重塑TME的細胞因數，如IL-12、IL-18、CD40L或Flt3L、 設計CAR T細胞以分泌雙特異性T細胞誘導劑（BiTEs），利用CAR T細胞在腫瘤部位的積累，避免BiTE的全身毒性，或使用可能介導更有力的內源性抗腫瘤活性的非傳統免疫細胞。

增強T細胞功能

大量增強免疫細胞的適應性的研究正在進行中（見圖3和box1）。大部分的工作集中在表觀遺傳調控上，部分原因是在一項針對慢性淋巴細胞白血病的CD19-CAR臨床試驗中，有一位異常反應良好的患者，慢病毒整合破壞了TET2基因，這是DNA甲基化的介導者，導致了大量的克隆性T細胞增殖和持續的抗腫瘤反應。同樣地，DNMT3A基因的敲除在預臨床模型中增強了CAR T細胞的抗腫瘤活性。通過過表達轉錄因數來防止耗竭也顯示出了潛力，包括過表達AP-1因數JUN，這增強了T細胞的擴增和持續性，減少了末端分化，降低了抗原密度閾值，這可能是由於信號強度的增加。類似地，BATF轉錄因數的過度表達已經被報導可以增強T細胞的效力。正在開發製造策略，以優化CAR T細胞的表型，朝向幹細胞樣和中心記憶亞群，包括縮短培養時間，抑制PI3K–mTOR–AKT，BTK或酪氨酸激酶信號，以及在促進記憶的細胞因數中培養。

CRISPR介導的基因編輯首次在採用的T細胞療法中臨床應用，在這種療法中，PD-1被從工程化的細胞中刪除，這些細胞被設計來表達NY-ESO-1，一種癌症特異性的TCR轉基因。這些工程化的細胞並沒有顯示出增強的持久性或效力，但該研究證明了該方法的可行性和安全性，並加速了應用基因編輯技術以增強免疫細胞療法的努力。已經有一些基因被確定為候選基因，以增強T細胞的適應性（box1），並且CRISPR介導的T細胞標誌物如CD7和CD5的破壞使CAR T細胞療法能夠用於T細胞惡性病，同時避免了CAR T細胞的溶解（被稱為‘同類殺伐’）。我們預計將有越來越多的臨床試驗活動，將基因編輯的免疫細胞整合到採用的免疫細胞療法平臺中，以增強其效力，擴大可靶向抗原的範圍，並避免免疫敏感化。

為了增強持久性，一些研究人員已經試圖將細胞因數信號整合到CAR受體中，或者轉基因表達細胞因數，包括一個臨床試驗，其中表達CAR的自然殺傷細胞轉基因表達IL-15顯示出持久的存在。免疫排斥也可能限制CAR T細胞的持久性，因為可以在許多病人體內測量到針對小鼠、人源化或全人scFvs的抗CAR免疫反應。同樣的，臨床經驗顯示，第二次和隨後的靜脈內CAR T細胞的效用有限，可以通過使用淋巴清除方案來改善。這些發現提出了這樣的前景，即正在開發的stealth平臺，能夠通過增強持久性或啟用多次CAR T劑量方案來增強CAR T細胞的效能，從而使現成的異體產品成為可能。

當前正在進行多種努力以解決抑制性的腫瘤微環境（TME）（見Box1），包括基因消融或表達佔優勢的TBGβ、PD-1或Fas受體，以及工程化CAR T細胞分泌檢查點阻斷scFvs。一些研究者已經設計出切換受體，這是一種融合蛋白，能夠將TME中的抑制信號轉換為CAR T細胞中的啟動信號。然而，由這種受體引發的持續啟動信號是否會導致長期的CAR T細胞增強或使它們傾向於耗竭和終末分化，這仍有待確定。此外，也正在探索基於生物材料的方法來增強細胞的擴增和持久性。

 

 

CAR調控與可調節平臺

大量的研究工作正在進行，旨在通過調節或抑制CAR信號傳導來提高安全性和效力，以降低毒性和耗竭。這個概念最初是由Eyquem等人提出的，他們使用CRISPR技術將CAR受體敲入TRAC位點，並觀察到由於內源性TRAC調控元件介導的抗原誘導的CAR下調，CAR-T細胞的效力和耗竭有所改善。韋伯和他的同事們利用合成生物學或小分子技術暫時停止CAR信號，當在製造過程中使用時，這種方法能提高CAR-T細胞的效力，在移植後體內應用時，能提高抗腫瘤效果。

如iCasp9、HSV酪氨酸激酶（HSV-tk）和表位元標籤等”殺手開關”能夠在出現嚴重毒性的情況下清除工程化的細胞，而且，我們已經開發出一種使T細胞對尿苷有需求的無轉基因的安全開關。調節性平臺不僅可以作為可逆的安全開關，還可以調整CAR的信號，從而提供防止T細胞耗竭的休息期，提高T細胞的效力。我們已經開發出眾多的可調節平臺，這些平臺採用了藥物敏感的啟動子、誘導二聚化、分裂式CAR、藥物依賴的啟動劑、蛋白質降解的嵌合物（PROTACs）、化學依賴性降解領域和藥物調控的CAR蛋白質降解等技術。這些系統代表了合成生物學的重大進展，但仍然面臨著關閉狀態下有毒性風險的洩漏活動、開啟狀態下CAR表達或活性減弱以及使用免疫抑制藥物作為調節器的挑戰。

Labanieh等人最近開發了一種蛋白酶調控的Grazoprer誘導的 “藥物ON “平臺，即 signal neutralization by an inhibitable protease (SNIP)，它顯示出無洩漏的活性和完整的功能能力（圖3）。最近，Labanieh等研究者開發了一種新型的受蛋白酶調控的藥物啟動平臺，稱為“SNIP”。該平臺在未被啟動的狀態下沒有殘留活性，並且在被藥物（如Grazoprer）啟動後能全面發揮作用（如圖3所示）。和synNotch系統類似，SNIP能夠降低CAR T細胞的耗竭程度，從而提高其抗腫瘤效果。在一個特定的實驗模型中，通過降低Grazoprer的劑量，研究者能夠調節SNIP-CAR的活性，這樣就能找到一個治療的視窗，在該視窗中，健康的正常細胞可以存活，而表達ROR1的腫瘤細胞則會被消滅。同樣地，Hernandez-Lopez等人改進了synNotch平臺，使其能夠在避免攻擊正常細胞的同時，有效地對付高度表達腫瘤特異性抗原的腫瘤細胞。因此，這種可調節的CAR技術顯示出了在提高療效和減少毒性方面的潛力。

通過布林邏輯增強特異性

B細胞和漿細胞惡性腫瘤特別適合接受CAR-T細胞治療，因為這些細胞高度、均勻地表達的抗原主要在B細胞和漿細胞上共表達，而這些細胞的消耗是可以容忍的。然而，最近的一篇病例報告顯示，一名患者在接受BCMA-CAR T細胞治療後出現了帕金森病症狀，屍檢分析顯示在患者的基底節神經元和星形膠質細胞子集中表達有BCMA。在另一項研究中，單細胞RNA測序分析顯示腦壁細胞上表達有CD19，這提出了一個可能性，即CD19-CAR T細胞治療後的神經毒性可能是由於準確打擊目標細胞所致。這些結果突顯了確定不在重要組織上表達的靶標的挑戰。

到目前為止，由於實體瘤表面缺乏特異性腫瘤標誌物，CAR T細胞療法的應用在實體瘤中仍受限，針對CAIX和CEACAM5的CARs在臨床試驗中觀察到了不可接受的靶向腫瘤外毒性。然而，針對實體瘤的CAR T細胞和其他強效的抗體導向療法的幾項臨床試驗已展現出良好的安全性檔案（表1）。CAR抗原密度高的閾值可能解釋了為何能安全靶向某些已知在重要組織上有表達的抗原，如在神經組織上低表達的GD2。最近一項試驗顯示，針對claudin-18.2的CARs展示了有希望的臨床活性，並與顯著但非劑量限制性的毒性相關，這可能是由於抗原表達局限於胃粘膜中深層的分化上皮細胞，這些細胞對CAR T細胞可能較難接觸。尋找具有足夠差異性表達的可安全靶向的分子，如癌胚表面靶標（oncofetal cell-surface targets），對於將CAR T細胞療法擴展到B細胞和漿細胞惡性瘤以外是至關重要的。然而，隨著實施增強效能和持久性的策略，將需要持續重新評估特定靶標的安全性，如在最近的一項研究中，一個整合了有著優勢負性TGFβ受體的針對PSMA的CAR與致命毒性相關。

包含邏輯門的下一代受體可以通過組合抗原感應更好地區分腫瘤和健康組織，並擴大潛在抗原的範圍（圖3）。Roybal等人開發了synNotch，這是一個IF-THEN電路，包含了一個針對抗原A的受體，一旦接觸，就會觸發針對抗原B的傳統CAR的轉錄。synNotch系統還沒有經過臨床測試，但在臨床前模型中，當腫瘤和易感的重要組織不在一起時，它可以防止目標上、非腫瘤的毒性。Tousley等人開發了一個名為LINK的AND門平臺，它利用了近端TCR信號分子LAT和SLP76，每個分子都融合了一個膜結合的scFv，對一個獨特的抗原進行特異性處理。在一個針對ROR1的模型中，該模型的目標是對腫瘤進行精確定位，但可能對非腫瘤組織產生毒性。在這個模型中，LINK CAR T細胞能夠消除表達兩種抗原的腫瘤，而不會引起與ROR1相關的毒性。然而，接受synNotch T細胞治療的小鼠卻無法承受這種毒性。目前正在開發的其他用於組合抗原定位的方法包括SUPRA和co-LOCKR，它們通過蛋白質開關機制來改變CAR T細胞的靶向性。儘管通過組合抗原識別可能會擴大可供靶向的腫瘤抗原的範圍，但腫瘤因丟失其中任何一種抗原而逃脫的風險可能會增加。另一種提高特異性的方法是使用“與非”邏輯門，該方法包括將啟動性CAR與一種抑制性CAR（iCAR）同時表達，其中iCAR靶向在健康組織上但非腫瘤組織上表達的抗原。目前，“與非”邏輯門的應用尚處於初步階段，且還未在臨床上進行測試。

TCR樣的CAR

以靶向低水準表達的抗原為目標，通過對內源性TRAC基因座進行基因編輯，將內源性TCR的可變區改變為單鏈抗體的不依賴於人類白細胞抗原的TCRs(HIT)。當CD80和4-1BBL以反式形式提供時，靶向CD19的HITS顯示出比原始的CD19-CARS更高的抗原敏感性(圖3)。合成TCR和抗原受體（STARs）具有類似的設計，但沒有敲入TRAC基因座；因此，內源性TCR的特異性得到了保留。其他重定向TCR特異性的方法包括抗體-TCR（AbTCR）平臺，它用Fab片段取代TCRγδ的可變結構域，以及TCR融合構建體（TRuC），它將scFv與CD3亞單位融合。最近對TCR類嵌合受體的比較表明，STAR和HIT受體能重現TCR抗原的敏感性，而TruCs卻不能。與天然T細胞相比，CAR T細胞的一個潛在缺陷是不能靶向細胞內抗原，因為大多數導致癌症的異常蛋白都是細胞內的。Yarmarkovich等人克服了這一點，開發了一種針對MHC(PMHC)呈現的多肽的CAR。他們利用了一種能特異性識別並結合在神經母細胞瘤中過度表達的PHOX2B肽-MHC複合體的scFv結合子，這使得他們能夠針對多種HLA等位基因的pMHC進行靶向。這種策略可能大大擴展CAR T細胞治療的目標範圍，包括關鍵的癌症驅動因素。

增加可及性和效率

人們正在採用各種方式，目的是擴大細胞治療的應用範圍，降低其生產成本，研製出可以抵抗排斥的隱形免疫細胞，並充分利用其他免疫細胞的獨特特性。

分散式製造和同種異體產品

隨著工程技術的進步，自動化封閉系統的製造已經實現，這為現場製造打開了新的可能，從而減少了中心化製造模式（即行業標準）帶來的成本、延誤和物流問題。最近的一項多中心研究證實了現場製造細胞的安全性和效能。目前，確定現場製造的監管要求尤其受到關注，特別是針對罕見病，如兒童癌症的治療。

通過利用來自健康的’超級捐贈者’製造異源性CAR T細胞，我們有可能提升治療效力，避免已存在的T細胞功能障礙，同時降低生產成本和物流難題，從而提高治療的普及性。然而，異源性T細胞療法面臨著要克服TCR介導的GVHD風險以及宿主免疫系統可能對移植細胞產生的排斥反應。雖然基因編輯技術可以消除內源性TCR，從而消除GVHD的風險，但要使細胞具有避開免疫排斥的隱形特性依然是一大挑戰，因為CD8+細胞、CD4+細胞、自然殺傷細胞和巨噬細胞均有可能對異源性細胞產生排斥，每種細胞的調控機制都不同，因此需要進行多種優化措施（詳見Box 1）。例如，敲除β2-微球蛋白可以消除HLA-I類的表面表達，但這反而可能增加自然殺傷細胞的排斥風險。此外，誘導異源性耐受的策略包括敲除CIITA基因消除MHC II類表達，以及通過過表達HLA-E和CD47來減少自然殺傷細胞和巨噬細胞對細胞的排斥。

大量異源性策略都採用了CRISPR-Cas9技術，而當用單一的生產過程製造成百上千的異源產品時，基於CRISPR的突變事件的風險可能會被放大。由於它們很可能因為沒有雙鏈DNA斷裂而降低了風險，基因編輯和primer編輯等替代平臺可能會逐漸成為以核酸酶為基礎的基因編輯的更好選擇。另外，以RNA為目標的CRISPR-Cas系統也可以為多重基因敲除提供機會，與RNA介導的干擾相比，其特異性和效率更高。儘管包含多重基因編輯的異源供體細胞可能具有重大優勢，但這些技術仍處於初期階段，其毒性特性尚未明確。有些研究團隊嘗試通過增強宿主的免疫抑制來防止免疫排斥，他們使用傳統的化療或免疫抑制抗體，而這些抗體的靶點則從CAR T細胞中被編輯掉。這種策略的初期回應率令人充滿希望，但其長期安全性和有效性尚未得到證實，且對於與強烈的免疫清除方案相關的感染風險的擔憂依然存在。

可替代的免疫細胞

包括自然殺傷細胞、iNKT細胞、γδ T細胞和巨噬細胞在內的多種非T免疫細胞顯示出天然的抗腫瘤活性，並且不會誘導GVHD，這為他們可能提供一種減輕毒性、增強腫瘤遷移能力，或者通過天然識別腫瘤來針對抗原陰性變體的即用型細胞源提供了可能性。然而，異源性天然免疫細胞仍容易被排斥，如果這些細胞未經精心設計以降低被識別概率，這就引發了人們對其效果持久性的擔憂。臍帶血衍生的異體自然殺傷細胞結合異位表達的IL-15，在一期試驗中顯示出治療NHL和CLL的前景。在小鼠模型中，iNKT-CAR細胞通過部分激發宿主CD8細胞對腫瘤抗原的反應表現出活性，並且其在一項針對神經母細胞瘤的初級臨床試驗中已經顯示出安全性和可能性。此外，工程改造後能表達CD20-CAR的γδ T細胞在早期研究中也表現出了顯著的活性。儘管在巨噬細胞中表達CAR需要對載體和信號域進行大量調整，但是預實驗模型已經證明其具有增強吞噬、改變腫瘤微環境和吸引T細胞等抗腫瘤效果，其中，以CD3ζ為基礎的CAR與以Fcγ為基礎的CAR顯示出相似的吞噬活性。現在，人們也在努力研發誘導多能幹細胞（iPS）衍生的CAR T細胞、自然殺傷細胞和巨噬細胞。iPS細胞向自然殺傷細胞的分化特別成功，這些即時使用的療法的臨床測試目前正在進行。而相比之下，iPS細胞分化為具有完全功能的T細胞則更為挑戰性。鑒於iPS細胞衍生產品幾乎擁有無盡的擴張潛力，它們可以實現大規模生產具有多種增強特性的均一細胞產品，包括賦予其隱形屬性、安全開關以及有效性。因此，人們對這些新興平臺的長期安全性和有效性結果充滿了期待。

下一代基因傳遞技術

病毒載體的基因傳遞一直被認為是這個領域的黃金標準，然而病毒載體的製造和鑒定過程既花費高昂又耗時。目前，正在研發無病毒的基因傳遞平臺，雖然DNA範本對T細胞具有毒性，且這種方法的效率仍然不如病毒載體，但已經通過在人T細胞中使用基於CRISPR的基因傳遞來證明了這個原理。臨床可行性已被證實，通過將CD19-CAR特異地傳遞到PD-1位點，引發了NHL中的高CR率，儘管這個製造過程並未能滿足相當大一部分患者的劑量要求。改良DNA範本和小分子抑制劑混合液正在提高基因插入的效率和細胞產量。轉座子基因傳遞方法也已經被使用，然而有兩個病例報告使用Piggybac轉座子平臺進行高拷貝數的整合後，CAR工程T細胞發生了惡性轉化。體內基因傳遞是一種新興的方法，能提高可訪問性並降低成本。在這種方法中，DNA或RNA通過病毒載體或納米顆粒進行系統性傳遞，這些納米顆粒能優先靶向並在體內轉化免疫細胞群。但是，由於病毒載體可能引發中和抗體，其免疫原性可能限制其重複使用。已經證明，在小鼠中使用靶向CD3的脂質納米顆粒可以穩定表達CD19-CAR，而且含有優化RNA的T細胞靶向脂質納米顆粒在小鼠模型中減少了心臟纖維化。

用於非惡性疾病的CAR療法

雖然CAR T細胞平臺已經被優化用於癌症治療，但是應用於CAR T細胞的設計原則和廣泛的合成生物學工具箱為將此治療方法擴展到包括自身免疫性疾病、衰老、纖維化和傳染性疾病在內的非惡性疾病提供了可能性。在臨床前研究中，CD19-CAR T細胞已在系統性紅斑狼瘡中顯示出有益效果，且有病例研究報告了CD19-CAR療法在一個難以治療的狼瘡性腎炎患者中的持久效果。嵌合型自身抗體受體（CAARs）是原型CARs，它們中包含針對自身反應性B細胞克隆的特異性決定簇（idiotype）的scFv，或者使用自身抗原作為識別領域。臨床前研究中，CAARs已在天皰瘡治療中展示了療效，臨床測試也正在進行中。採用調節性T細胞（Treg細胞）作為替代方法來治療自身免疫性疾病，這種細胞主要發揮抑制作用，而非毒殺作用。非工程化的Treg細胞在移植物抗宿主病（GVHD）、異種移植、1型糖尿病、系統性紅斑狼瘡和多發性硬化症的小鼠模型中已經表現出了活性，早期臨床資料也顯示了這種方法的可行性和良好的安全性。與非工程化細胞相比，表達針對疾病組織上表達的抗原的CAR的Treg細胞顯現出了更強的特異性和效能。最近的研究資料顯示，無意中擴展CAR Treg細胞的數量已經限制了商業CAR T細胞的效果，這為CAR工程化Treg細胞的實用性提供了原理驗證。目前，人們正在嘗試通過工程化FOXP3表達來強化其譜系穩定性，並引入安全開關以減少相關風險。在血友病小鼠的最新預實驗資料中，研究人員發現表達了針對因數VIII的CAR和FOXP3的Treg細胞能夠阻止中和抗因數VIII抗體的產生。此外，針對尿激酶型纖溶酶原啟動物受體的衰老細胞殺傷CAR T細胞已經被證明能在體外靶向衰老細胞，並在肝纖維化模型中恢復組織的穩態。針對成纖維細胞活化蛋白（FAP）的CARs在心臟纖維化的小鼠模型中已經提高了心臟功能，並且利用裝載有mRNA的CD5導向脂質納米粒子在體內生成的FAP-CARs也顯示出有益效果。在這個模型中，mRNA的非整合特性確保了CAR表達是暫時性的，因此減輕了因廣泛清除活化成纖維細胞所帶來的毒性風險。

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