免疫細胞治療可以說是醫學界的革命。廣譜性免疫細胞治療曾被央視報導，被譽為腫瘤綠色療法。晚期腫瘤患者已經無法根治性手術，同時身體對化療耐受程度往往較低，亟需尋求新型治療策略。免疫細胞治療無疑是一項不錯的選擇，免疫細胞聯合常規治療（手術、化療、放療），給晚期患者帶來福音，不會給病人帶來額外的負擔，相反還可以減弱放化療帶來的副作用。在我們瞭解免疫細胞治療時，往往會有一個疑問困擾著：免疫細胞用自體的好還是異體的好？

2021年2月，國家藥監局《免疫細胞治療產品臨床試驗技術指導原則（徵求意見稿）》的發佈，為免疫細胞治療提出了針對性的建議和指南。

免疫細胞可自體也可異體

視情況而定

《意見稿》上是這樣表述的：“免疫細胞治療是利用人體自身或供者來源的免疫細胞，經過體外培養擴增或活化，再回輸到患者體內，激發或增強機體的免疫功能，從而清除腫瘤細胞、病原體或病毒感染等異常細胞的治療方法，包括過繼性細胞治療（ adoptive cell therapy，ACT），治療性疫苗等……。”

並在免疫細胞產品的特性介紹裡，再次強調起始原材料來源多樣，如自體來源、同種異體來源等。

可見，《意見稿》是承認免疫細胞治療可以用自身的，也可以用別人的，都會對治療有效。

那麼，什麼時候需要用到異體來源的呢？

《意見稿》同樣指出，“選擇免疫細胞治療產品，疾病分期或嚴重程度是最重要的考慮要素之一。”“病情進展迅速的晚期或病情嚴重的受試者可能無法採集到合格的製備原材料、或無法製備出符合標準的細胞產品……必須考慮對受試者所造成風險的預期性質和嚴重程度，以及這些風險在不同分期或嚴重程度疾病中的影響。”

所以，對於腫瘤較多較大，疾病進展較嚴重，是無法立即進入治療，需要配合其他治療將腫瘤負荷降低後，再進行免疫細胞治療。

對於身體狀況特別差的患者，如白細胞數量低於一定值，採用自體細胞培養，可能無法製備出符合標準的細胞產品。此時，為確保療效，需要選擇異體來源的細胞產品。

但不得不指出的是，異體來源的免疫細胞可能會有免疫排斥反應，用他人的細胞首先要考慮組織相容性抗原是否匹配，也就是我們常說的“配型”，來判斷發生免疫排斥的風險大不大。因此，在臨床實踐中，異體來源的免疫細胞往往更傾向于腫瘤患者的直系親屬，盡可能降低排斥反應。

總而言之，使用異體來源的免疫細胞，是療效與安全性兩相權衡下的考量，相對要慎重，能用自體的當然更好。因此，也誕生了另一個需求，將自己免疫細胞在身體條件還好的情況下存儲起來，待到有需要時再取出來使用，也不失為一種選擇。

異體免疫細胞治療療效如何？

安全性如何？

在不得不採用異體來源的免疫細胞治療時，它的療效如何呢，安全性如何，這又成為患者及家屬關心的下一個問題。

中國研究團隊在國際雜誌《Oncology Letters》上發表了一篇文章，比較了自體CIK治療和同種異體CIK治療在多種實體瘤上的安全性，並進一步評估同種異體CIK在晚期非小細胞肺癌上的有效性。

該研究共招募了303例接受CIK治療的實體瘤患者，包括肺癌、乳腺癌、結直腸癌、腎癌、胃癌等，在這些患者中，133例接受了從自體血源（自體組）獲得的CIKs的治療，170例接受了直系親屬血源（同種異體組）獲得的同種異體CIKs的治療。自體組和同種異體組回輸CIK的平均數為2.11±0.32×10¹⁰和 2.29±0.36×10¹⁰，兩者之間無明顯差別。

在輸注CIK期間和之後，自體組的133例患者和同種異體組的170例患者中，觀察到66例（49.6%）和86例（50.6%）患者的欣快，21例（15.8%）和28例（16.5%）患者的身體改善，15例（11.3%）和20例（11.8%）患者的疼痛緩解。主要不良事件包括失眠、發熱、噁心、嘔吐和輕度腹痛，自體組分別為9例（6.8%）、8例（6.0%）、2例（1.5%）和1例（0.8%），同種異體組分別為11例（6.5%）、10例（5.9%）、1例（0.6%）和1例（0.6%）。兩組間不良事件差異無顯著差異（P>0.05）。

與接受自體CIK治療的患者相比，接受同種異體CIK治療的患者免疫排斥反應沒有增加。值得注意的是，兩個月後，四名從兩個後代的血液中接受CIK治療的患者沒有觀察到明顯的排斥反應。

此外，研究招募了54名晚期非小細胞肺癌患者，平均分配到同種異體CIK組和最佳支持組。在同種異體CIK組和最佳支援組中，中位隨訪時間為13.0個月和14.0個月，中位生存期分別為11.0個月和8.0個月（P=0.018）,具有統計學意義上的差異。

同種異體CIK組與最佳支持組OS對比

研究表明，異體CIK治療，同樣能顯著改善患者的生存品質，延長患者的生存期；在不良事件上，也與自體CIK沒有差別，排斥反應也不常見。

總結

免疫細胞治療是腫瘤的綠色療法，適合與常規手段聯用，清除殘餘腫瘤細胞，有效抑制腫瘤的復發和轉移，降低常規治療手段帶來的副作用。對於晚期腫瘤患者而言，癌痛和無休止的化療，在治療腫瘤的同時，同樣帶來極大的痛苦，身體極度虛弱。免疫細胞的聯用，是一項不錯的選擇，恢復患者的免疫功能，減弱副作用，極大提升患者的生存品質和生存期。無法使用自體免疫細胞治療的人群，還可以選擇異體來源的免疫細胞治療，同樣可以給生命多一層保障！

參考文獻：

1.《免疫細胞治療產品臨床試驗技術指導原則（徵求意見稿）》

2.Human leukocyte antigen-haploidentical donor-derived cytokine-induced killer cells are safe and

 

腫瘤異質性是包括免疫療法在內癌症治療方法面臨的主要挑戰之一。異質性可通過獲得新突變而產生，從而產生抗治療腫瘤亞克隆。此外，癌細胞可以通過改變其細胞狀態來適應治療壓力。因此，我們面臨的任務是如何積極設計免疫療法，防止耐藥腫瘤細胞的選擇。

T細胞和自然殺傷（NK）細胞在腫瘤免疫中具有互補作用，這些淋巴細胞群體使用不同的識別策略來識別癌細胞，NK細胞可以殺死逃脫CD8+T細胞識別的癌細胞。因此T細胞和NK細胞的雙重攻擊為加深免疫治療的影響提供了機會。最近的研究還表明，NK細胞在向腫瘤招募樹突狀細胞中發揮重要作用，從而增強CD8+T細胞應答的誘導，而T細胞分泌的IL-2啟動NK細胞。

有趣的是，T細胞和NK細胞還共用幾種重要的抑制和啟動受體，這些受體可以作為增強T細胞和NK-細胞免疫作用的靶點。這些抑制性受體配體系統包括CD161-CLEC2D、TIGIT-CD155和NKG2A/CD94-HLA-E。此外，基於抑制和啟動細胞因數的新的治療策略也可以發揮T細胞和NK細胞的協同作用，這些基於T細胞和NK細胞協同作用的療法將深刻影響目前的癌症免疫治療。

T細胞和NK細胞識別腫瘤細胞的分子邏輯

T細胞和NK細胞在腫瘤細胞識別的分子機制上有根本不同。T細胞通過TCR介導的MHC結合肽抗原識別腫瘤細胞。T細胞的所有關鍵功能都在TCR的控制下，包括細胞毒性、細胞因數產生和增殖。因此，腫瘤可以通過下調或丟失MHC-I表達逃避CD8+T細胞的作用。

相反，NK細胞利用一系列啟動和抑制受體來識別應激和轉化的細胞，如NKG2D、NKp46、NKp30和NKp44受體。與T細胞相比，NK細胞識別腫瘤細胞不依賴於任何唯一的啟動受體，這一事實為識別應激和轉化的細胞提供了更大的靈活性。因此，T細胞和NK細胞對腫瘤細胞施加不同的選擇壓力，為T細胞和NK細胞雙重靶向腫瘤提供了理論依據。

T細胞和NK細胞的共用受體

T細胞和NK細胞從生物學上經常被認為是適應性免疫識別和固有免疫識別的嚴格區分。然而，NK細胞和CD8+T細胞的受體-配體系統也存在大量重疊。因此，CD8+T細胞和NK細胞表達的活化和抑制受體提供了使它們參與協同抗腫瘤免疫的機會。

CD161及其配體CLEC2D

CD161受體屬於C型凝集素受體家族，並形成同源二聚體。它最初被鑒定為NK細胞上的一種抑制性受體，其阻斷對表達CLEC2D配體的腫瘤細胞的殺傷。最近，CD161也被確定為腫瘤浸潤T細胞的重要抑制受體。CLEC2D是一種C型凝集素受體，在幾種人類癌症的腫瘤細胞和浸潤性髓系細胞上表達。CLEC2D在生髮中心B細胞中高水準表達。因此，起源于生髮中心B細胞的B細胞淋巴瘤可以表達高水準的CLEC2D，包括濾泡性淋巴瘤、伯基特淋巴瘤和具有生髮中心B-細胞樣基因表達特徵的彌漫性大B細胞淋巴瘤亞型。在Toll樣受體（TLR）啟動後，DC和B細胞也表達CLEC2D。因此，靶向這種抑制性受體可以增強T細胞和NK細胞的抗腫瘤活性。

NKG2A/CD94及其配體HLA-E

HLA-E是一種非經典MHC Ib分子，與NK細胞和CD8+T細胞亞群表達的抑制性NKG2A/CD94受體結合。在許多實體瘤中，HLA-E在腫瘤細胞過表達，並且在腫瘤浸潤巨噬細胞和DC上也檢測到這種蛋白的表達。NKG2A/CD94受體由大多數迴圈和腫瘤浸潤的NK細胞組成性表達。雖然只有一小部分血液CD8+T細胞表達NKG2A/CD94，但其表達會在共表達PD-1和其他抑制性受體的腫瘤浸潤CD8+T細胞中上調。

CD226受體和抑制性對應受體TIGIT、CD96和PVRIG

CD226受體是NK細胞和CD8+T細胞表達的重要共刺激受體。這種啟動性受體的主要配體CD155在人類癌細胞中廣泛表達，此外，CD226還與第二配體PVRL2（CD112）結合。有趣的是，啟動CD226受體的活性被三種抑制性受體TIGIT、CD96和PVRIG拮抗。TIGIT和CD96抑制性受體對共有CD155配體的親和力高於CD226，並且可以在配體結合方面勝過CD226。在這三種抑制性受體中，TIGIT的研究最為廣泛。TIGIT由NK細胞、CD8+T細胞和調節性T細胞（Tregs）表達。TIGIT在不同實體瘤和淋巴瘤中的腫瘤浸潤CD8+T細胞高表達。TIGIT也是NK細胞中的一種重要抑制受體，並導致腫瘤中的NK細胞功能障礙。PD-1和TIGIT都抑制CD226，但通過不同的機制：PD-1在CD226的胞質結構域中去磷酸化Tyr-322，而TIGIT在CD155結合方面超過CD226。CD96和PVRIG受體的研究較少。在小鼠模型中，CD8+T細胞或NK細胞中CD96受體的失活增強了抗腫瘤免疫，但其在人類細胞中的作用尚不清楚。PVRIG也由T細胞和NK細胞表達，其主要配體是PVRL2。

NKG2D受體及其應激誘導配體

NKG2D受體由人NK細胞、CD8+T細胞和先天性T細胞（NKT細胞和γδT細胞）表達。啟動後，NKG2D通過銜接蛋白DAP10發出信號，誘導NK細胞、γδT細胞和NKT細胞的穿孔素依賴性細胞裂解；它還為CD8+T細胞提供共刺激信號。

NKG2D受體識別一組受應激和轉化細胞上調的配體。在人類中，這些配體包括MICA/MICB和ULBP1-6蛋白；在小鼠中，這些配體包括Rae1α–ε、H60a–c和Mult1。這種受體-配體系統對腫瘤免疫很重要，因為這些配體被DNA損傷和cGAS STING信號上調，但很少被健康細胞表達。本質上，NKG2D配體的上調標誌著應激細胞被細胞毒性淋巴細胞清除。NKG2D配體的表達經常在多種實體瘤和血液瘤中檢測到，包括前列腺癌、卵巢癌和乳腺癌以及黑色素瘤和多發性骨髓瘤。

MICA/B的蛋白水解脫落通過顯著降低腫瘤細胞表面上這些刺激性NKG2D配體的密度而導致免疫逃逸。二硫異構酶ERp5參與脫落的啟動：它破壞MICA/Bα3結構域中的結構二硫鍵，使其可通過ADAM-10/17和MMP14進行蛋白水解。脫落MICA與許多人類癌症的疾病進展密切相關，但在健康受試者的血清中未檢測到。

NK細胞-DC細胞-T細胞軸

NK細胞不僅充當細胞毒性效應細胞，還可以將DC細胞招募到實體瘤中，從而形成T細胞介導的腫瘤免疫。傳統DC目前分為兩個主要子集，cDC1和cDC2。通過將凋亡腫瘤細胞的細胞相關抗原呈遞給CD8+和CD4+T細胞，cDC1亞群對保護性抗腫瘤免疫至關重要。除了這種傳遞作用外，cDC1還通過招募和啟動腫瘤特異性CD8+T細胞在腫瘤中發揮關鍵作用。

兩項主要研究表明，NK細胞在向腫瘤募集cDC1中起著關鍵作用。第一項研究表明，NK細胞分泌趨化因數，介導cDC1募集到腫瘤中，特別是XCL1、XCL2和CCL5。這是一個重要的發現，因為cDC1選擇性表達XCL1/2的XCR1趨化因數受體。第二項研究側重於FLT3配體，這是一種調節DC分化和存活的關鍵細胞因數。在NK細胞中檢測到這種重要細胞因數的表達。研究顯示， NK細胞（而不是T細胞）的清除大大減少了cDC1向腫瘤的募集。這些研究證明了腫瘤中NK細胞和T細胞反應之間的重要聯繫：NK細胞募集並支援DC的存活，而DC又對T細胞介導的腫瘤免疫至關重要。

靶向T細胞和NK細胞協同作用的免疫治療方法

癌症疫苗

大多數當前的癌症疫苗都關注肽表位，由於個體之間MHC等位基因的巨大多樣性，需要個性化設計。此外，細胞毒性T細胞施加巨大的選擇壓力，導致MHC-I表達下調或缺失的腫瘤克隆出現。一種引發T細胞和NK細胞雙重攻擊的疫苗可以防止MHC-I缺陷型腫瘤克隆的出現，因為MHC-I表達的缺失使腫瘤細胞更容易被NK細胞殺死。人類腫瘤通過活化的MICA和MICB配體在腫瘤細胞上的蛋白水解脫落來逃避活化NKG2D受體的識別。靶向參與蛋白水解脫落的MICA/Bα3結構域的癌症疫苗誘導高滴度抗體，可以抑制脫落並增加腫瘤細胞表面MICA/B蛋白的密度。該疫苗誘導多種T細胞和NK細胞群體顯著歸巢小鼠腫瘤。這種疫苗誘導的抗體在抗腫瘤免疫應答中發揮著重要作用：腫瘤結合的MICA/B抗體增強了DC對CD8+T細胞的腫瘤抗原交叉呈遞，並通過啟動NK細胞上的CD16-Fc受體增加了NK細胞介導的腫瘤細胞殺傷。

靶向抑制性細胞因數

TGF-β是一種主要的免疫抑制細胞因數，可有效抑制腫瘤內的T細胞和NK細胞功能。TGF-β強烈抑制T細胞增殖和效應器功能。在NK細胞中，TGF-β信號抑制mTOR調節的關鍵代謝程式，從而抑制增殖和細胞毒性。TGF-β還抑制腫瘤浸潤NK細胞的多種活化受體的表達，包括NKG2D受體。PGE2在免疫抑制中起著重要作用，也與增強癌細胞存活和侵襲性有關。環氧化酶（COX）-1和2是PGE2合成的關鍵酶，在許多人類癌症中經常過表達。通過Ptgs1和Ptgs2基因的失活抑制小鼠黑色素瘤細胞系中PGE2的合成，導致TME從促腫瘤細胞因數（IL-1β和IL-6）向抗腫瘤的細胞因數/趨化因數（IL-12、IFN-γ和CXCL10）轉變。重要的是，CD103+cDC1在這些Ptgs1/2−/−小鼠的TME中顯著增加，而NK細胞通過分泌XCL1和CCL5在cDC1的募集中發揮核心作用。

工程化刺激性細胞因數

幾種主要的細胞因數同時作用於T細胞和NK細胞，包括IL-2、IL-12、IL-15和IL-18，為增強T細胞和NK細胞功能提供了機會。例如，NKTR-214是一種聚乙二醇形式的IL-2，在一項1期臨床試驗中，NKTR-214單藥治療，26名患者中有14名（53.8%）疾病穩定，迴圈CD4+T細胞、CD8+T細胞和NK細胞大量增殖。同時，IL-15作為治療藥物也在大力開發中，因為它啟動效應T細胞和NK細胞，但不啟動Treg。IL-15對記憶性T細胞的存活很重要，並誘導NK細胞增殖和活化。在一項血液惡性腫瘤復發患者的1期臨床試驗中，IL-15超級激動劑ALT-803在19%的治療患者中誘導了治療反應。與其作用機制一致，ALT-803誘導血液中NK細胞和CD8+T細胞的顯著增殖，並通過迴圈NK細胞增強活化受體（NKG2D、NKp30）和顆粒酶B的表達。

結合T細胞和NK細胞的聯合療法

對在小鼠模型系統中有效治療腫瘤的聯合療法已經確定了四種藥物的組合，簡稱AIPV，其由抗腫瘤抗體（A）、延長半衰期的IL-2（I）、抗PD-1（P）和肽疫苗（V）組成。該方案可以進一步簡化為單劑量AIP（抗腫瘤抗體、IL-2和PD-1抗體）。單劑量AIP治療可誘導快速早期反應，NK細胞和巨噬細胞發揮顯著作用，包括促炎性趨化因數和細胞因數的表達上調。腫瘤結合抗體和延長半衰期的IL-2有助於早期NK細胞活化，這使得能夠招募DC和CD8+T細胞，從而使腫瘤對ICB更敏感。

此外，天然免疫刺激物也提供活化CD8+T細胞和NK細胞的機會。STING激動劑在小鼠模型中誘導由CD8+T細胞和NK細胞介導的強大抗腫瘤反應。STING激動劑通過動員T細胞和NK細胞，與IL-2顯示出強烈的協同作用，以對抗MHC-I缺陷和MHC-I陽性小鼠腫瘤。

最近的研究表明，腫瘤中T細胞的生物學與NK細胞的生物學高度相關。NK細胞在T細胞介導的腫瘤免疫中發揮著重要作用，通過招募DC細胞並支持其生存。儘管NK細胞和T細胞屬於免疫系統的固有和適應性分支，但它們也共用重要的活化和抑制受體配體系統，為免疫治療提供了機會。對人類腫瘤的這些特徵更深入的分子理解可能會發現新的免疫治療靶點，並指導有效參與DC、NK細胞和T細胞的聯合療法的開發。

參考文獻：

1.DesigningCancer Immunotherapies That Engage T Cells and NK Cells. Annu Rev Immunol.2022Nov 29

 

綜述

當前中國細胞行業真實業態多樣，細胞領域臨床研究、研發、生產產能及市場需求均有較大釋放空間；另一方面，從主要監管部門到各地地方政府，或在具體監管案例中謹慎處理，為日後完善監管留白預留充分政策空間，或積極探索細胞行業發展模式和監管路徑。

一、我國細胞行業當前業態及典型投建模式

（一）當前細胞行業主要業態

根據市場公開信息，目前我國細胞行業主要業態包括細胞商業存儲、細胞生產與製備、細胞醫美大健康、按藥物申報、雙備案的幹細胞臨床試驗、臨床轉化治療等實際業態，整體如下圖：

1.細胞商業存儲現狀

目前我國細胞存儲業務分為公共血庫造血幹細胞存儲和商業有償存儲，涉及的組織樣本主要包括新生兒臍帶、臍帶血和胎盤樣本、骨髓液樣本、牙齒樣本、脂肪組織、滑膜組織等。公共庫主要系原衛生部依據《臍帶血造血幹細胞庫設置管理規範（試行）》等規定，以公益為目的進行採集和存儲，供有需求的患者配型使用而先後批准設立的北京、天津、上海、浙江、山東、廣東、四川等7個臍帶血造血幹細胞庫。商業存儲則由相關企業面向社會公眾從事有償細胞存儲和製備，以新生兒自體圍產組織幹細胞和成人自體細胞為主。目前各省基本均有細胞有償存儲業務業態，且呈現頭部企業虹吸效應。如中源協和（600645）在2022年報中披露其已在全國20 個省市建立細胞資源庫，開展臍帶血造血幹細胞、臍帶間充質幹細胞、胎盤亞全能幹細胞、脂肪幹細胞及免疫細胞的檢測、製備與存儲服務，構建了全國性細胞資源存儲網路。

2.細胞生產與製備現狀

除細胞藥物研發製備企業及相關CDMO企業外，當前細胞製備業務主要指細胞企業為臨床研究醫院、科研及企事業單位提供細胞製品。如天晴股份（832035）年報披露，公司的製備服務專案“主要集中在省內及東三省的專業的腫瘤醫院及綜合性醫院的腫瘤科、普通外科等產生腫瘤病人的科室，公司為他們的生物治療癌症臨床研究提供高效 NK細胞”。截止2022年底，我國獲得中檢院幹細胞質量檢驗報告機構的數量約50家。近年，隨著誘導多能幹細胞（IPSC）技術及其應用的不斷成熟和拓展，IPSC來源的種子細胞、前體細胞製劑製備的市場需求不斷擴容。

在各地政府鼓勵發展細胞與基因治療背景下，頭部細胞企業多被當地科技、發改等部門認定為當地“工程技術中心”、“工程研究中心”、“區域細胞製備中心”等。如賽萊拉（831049）曾在信披檔中披露，廣東省（賽萊拉）區域細胞製備中心即是廣東省發改委、省科技廳、省衛計委、省食藥監局聯合發函批復，由賽萊拉承擔建設的省級區域細胞製備中心。

3.細胞醫美與大健康業務現狀

細胞大健康業務常見的有幹細胞、免疫細胞回輸及相關醫美製品或服務。如冠昊生物在2021年報中即披露，公司“紮根大健康前沿領域，適時推出免疫增強方案、牙髓幹細胞儲存等新技術服務，借助產品線擴充升級，自建中醫養生保健館–天佑延年堂、高端綜合門診–廣州百尼夫等技術落地運營機構，完善產品應用閉環”。

值得一提的是，由於人源細胞因數尚未列入國家藥監局化妝品原料藥目錄，目前國內尚無獲批的幹細胞化妝品。國家藥監局曾在2021年9月發文強調“幹細胞化妝品”屬於偽概念。當前合規化生產、銷售的化妝品也並非是以“人源細胞”作為原料的化妝品。如賽萊拉曾披露“公司依託掌握的幹細胞核心技術，延伸到動植物細胞提取物技術研發，將自主研發、自主生產的包含專利技術的動植物細胞提取物原料轉化為功能性護膚品”。

4.按藥物進行申報

隨著2021年兩款CAR-T產品在中國批准上市，細胞治療產品按照藥品監管的路徑全面打通。根據CDE官網資訊，截至2023年2月28日，國內共有42家企業的62款幹細胞藥物臨床試驗申請（IND）獲得受理，30家企業的47款獲得臨床默示許可，主要為來源臍帶、胎盤、骨髓、脂肪、牙髓、宮血等間充質幹細胞藥物。同時，IPSC類幹細胞藥物IND申請也逐漸增多。目前在該方面較活躍的企業包括安徽中盛溯源、南京艾爾普、浙江霍得生物、呈諾醫學、武漢睿健醫藥等。值得一提的是，今年4月西比曼生物科技正式宣佈啟動公司旗下“異體人源脂肪間充質祖細胞注射液AlloJoin”的 III 期臨床試驗。這也標誌著我國幹細胞藥物研發進入III期臨床時代。

5.雙備案的臨床試驗現狀

雙備案即非註冊臨床研究（IIT）的研究機構、研究專案雙備案。

經檢索，目前全國已有137家研究機構（含軍隊醫院22家）在衛健委、藥監局或後勤保障部衛生局完成臨床研究機構備案，共有112個幹細胞臨床研究專案備案。相關適應症涉及循環系統（如急性心梗、心衰）、神經系統（如帕金森病、缺血性卒中）、泌尿生殖系統（如宮頸粘連、卵巢早衰）、免疫系統（如狼瘡性腎炎）、運動系統（如膝骨關節炎、半月板損傷等）等多系統疾病的治療。

6.臨床轉化治療現狀

儘管監管政策前後有所變化，在醫療實踐中，醫院或企業通過多種方式嘗試或實施細胞臨床轉化治療的行為從未終止。許多地方政府或自貿區也積極探索，希望打通細胞臨床轉化治療的支付路徑。如中源協和在2021年報中披露，“2021 年 6 月，血研所與公司等主體合作建設中國(天津)自由貿易試驗區聯動創新示範基地，該基地計畫依託國家幹細胞工程產品產業化基地細胞存儲、研發、生產製備、臨床轉化應用等全閉環管理環境，探索在細胞治療臨床試驗同情用藥、進口國外已上市國內未上市藥品與醫療器械、細胞治療按照醫療技術准入開展臨床收費應用等方面實現突破”。

（二）當前細胞企業典型投建模式

鑒於細胞治療藥品研發週期長、資本密集的特點，國內多數細胞企業同時佈局多種業態，以構建細胞產業全閉環。以國內上市或掛牌的細胞企業為例，其業態佈局情況如下：

再如，根據市場公開資料，北京漢氏聯合生物技術股份有限公司同時佈局漢氏生物、漢氏藥業、漢氏醫學、希諾神州四個產業板塊，其中漢氏生物負責細胞存儲、製備和CXO服務；漢氏醫學承擔集團精准醫療大健康產業的建設運營任務，主要包括三級醫院、綜合門診部、高端體檢中心、協力廠商醫學檢驗中心、互聯網醫院、醫美護膚中心、醫療旅遊等業務；漢氏醫藥則以細胞類新藥研發為主，現有多個幹細胞1類新藥臨床試驗申請獲得批准。

二、現有業態的法律評價與司法監管實踐

（一）當前司法監管實踐的整體特徵

目前我國細胞領域的司法裁判以零星案例為主，尚未形成體系化的裁判標準，針對同類型案例，不同法院裁判口徑不一；行政監管實踐以相關主體投訴、舉報等發起的被動型監管為主，主動研判型、體系化監管相對偏少。值得一提的是，為應對行業發展帶來的監管挑戰，部分地方開始加強主動型監管的研究。如2021年9月深圳市坪山區人民法院發佈《生物醫藥產業全流程法律風險及司法應對研究》專項調研課題投標公告，2022年12月深圳坪山區發佈《深圳市坪山區生物醫藥企業刑事合規工作指引》，均系主動構建當地裁判或監管體系。

（二）各業態典型司法、監管案例及執行口徑

1.商業存儲業務的法律評價與裁判

（1）商業存儲合約效力認定

泰州中院（2017）蘇12民終570號一案中，在案由上，法院將臍帶血存儲糾紛界定為消費者權益糾紛；在合約效力上，針對上述人（存儲臍帶血的自然人）提出的“案涉合同違反法律、行政法規的強制性規定應當無效”的訴請，法院認為，上訴人 “既是臍帶血造血幹細胞的提供者，也是臍帶血造血幹細胞的所有者，臍帶血造血幹細胞僅僅供本人或者近親屬使用，並不涉及其他公民，亦不會對公共安全造成影響”，故“被上訴人接受上訴人委託製備、存儲臍帶血造血幹細胞並不違反《中華人民共和國獻血法》等法律、行政法規的強制性規定”，最終判決臍帶血有償存儲合約有效。

經筆者在裁判文書網檢索，尚未發現人遺條例頒佈後的商業存儲糾紛判例。

（2）商業存儲與保藏審批的監管實踐

目前的從事細胞商業存儲的企業多將存儲行為定位成基於“未來臨床治療目的”，未申請保藏許可。部分企業因兼有未來科學研究目的或承擔了特定平臺職能，則申請並獲得了保藏審批，如河南省華隆生物技術有限公司河南省人類幹細胞資源庫等。

目前尚無商業存儲方因未取得保藏許可而被人遺監管部門處罰的案例。

2.細胞回輸協議效力的司法實踐

在已有的細胞回輸相關糾紛案例中，針對細胞回輸協議的效力，出現“有效”和“無效”兩種不同的裁判結果。

（1）協議有效的案例

在煙臺中院（2020）魯06民終1331號一案中，上述人（接受回輸方）提出“被上訴人在未獲得國家批准情況下，直接將‘幹細胞回輸液’注射到上訴人體內，並向上訴人收取費用，違反上述管理辦法及《中華人民共和國藥品管理法》、《醫療機構管理條例》等法律規定，被上訴人以‘免疫細胞保健’名義向上訴人有償提供的‘幹細胞套餐’服務依法應當認定無效。二審法院最終認為，“本案雙方簽訂的‘幹細胞套餐’服務合同，系雙方真實意思表示，且雙方在簽訂合同時，該合同並未違反法律或行政法規的強制性規定”，即判決細胞保健合同有效。

（2）協議無效的案例

在上海一中院（2020）滬01民終4321號一案中，法院認為 “與幹細胞相關的管理規範具有公共利益屬性，雖然《幹細胞臨床研究管理辦法（試行）》不屬於法律、行政法規，在法律規範的效力位元階上屬於部門規章，但是該管理辦法系依據《中華人民共和國藥品管理法》《醫療機構管理條例》等法律、行政法規而制定，旨在規範和促進幹細胞臨床研究健康、有序發展”，因此，“聚仁公司銷售‘幹細胞’給他人直接用於人體回輸，違反了《幹細胞臨床研究管理辦法（試行）》第五十二條關於禁止幹細胞直接進入臨床應用的規定的同時，嚴重違背了倫理規範，破壞國家醫療監管制度，危及不特定個體生命健康安全，進而損害社會公共利益”，最終判決協議無效。綜上，對於細胞醫美和細胞大健康服務的法律評價，司法實踐中尚無統一認定標準。

3.“細胞化妝品”的監管實踐

國家市場監督管理總局廣告監督司《關於加強幹細胞廣告監管的工作提示》（廣函字（2021）187號）、國家藥監局《關於開展化妝品“線上淨網、線下清源”專項行行動的通知》（國藥監妝（2021）47號）等檔均明確不得違規宣稱相關產品含有幹細胞且存在美容、抗衰等功效，多地亦出現行政處罰案例。因此，針對“細胞化妝品”的監管口徑比較清晰。

4.臨床轉化治療的司法監管實踐

一直以來，國內因臨床轉化治療涉刑案件較少，較有代表性的是（2020）滬0101刑初76號許某等人非法經營罪案。該案判決書載明，2016年12月至2017年4月期間，許某以上海某高校轉化醫學研究院名義對外招攬病患，汪某負責在涉案公司辦公地製作幹細胞注射液，最終在涉案醫院腫瘤科或公司辦公地為患有漸凍症、腦溢血等不同病症的患者有償注射幹細胞。

該案的審理過程頗有看點。最初，上海市黃浦區法院一審判決許某等人犯生產、銷售假藥罪，公訴機關及原審被告人均不服，分別提出抗訴、上訴。上海三中院以“涉案幹細胞是否假藥以及各被告人在共同犯罪中的地位、作用等事實尚需進一步查明”為由，裁定發回重審。2020年1月，黃浦區法院重審立案，黃浦區檢察院變更指控罪名為非法經營罪。最終，黃浦區法院判決被告人許某等“違反國家藥品專營、專賣管理法律法規，未經許可經營藥品”，構成非法經營罪。許某的刑罰從生產銷售假藥罪項下的有期徒刑11年，變更為非法經營罪項下的有期徒刑6年。

同時，針對細胞臨床轉化治療，近兩年典型行政處罰案件如下：

截止目前，上述案件相關方均未涉及刑事處罰。

5.與細胞領域相關的其他司法實踐

目前與細胞行業關聯的刑事罪名主要包括銷售假藥罪、詐騙罪以及走私、妨礙檢驗檢疫等進出口類犯罪，其中以詐騙罪案例居首，這也與我國當前細胞治療知識普及度和監管留白有關。近年來典型案件如下：

綜上，儘管僅有少量司法裁判和監管處罰案例，但亦能看出，相關法院和監管部門在處理具體案件時，為行業發展預留政策空間的謹慎克制，在司法裁判上也似有輕刑化趨勢。

三、我國細胞行業監管趨勢研判與分析

（一）研判分析的基準

1.基於國外監管模式的共同底層邏輯或最大公約數

我們認為，無論是基於《公共衛生服務法案》將人體細胞和組織分為低風險產品（PHS ACT 351章節）和高風險產品（PHS ACT 361章節）而構建監管體系的美國“單軌制”（歐盟與之類似），還是將再生細胞治療產品與藥物、醫療器械平行立法的日本“雙軌制”，均具有共性的底層邏輯和要素支撐。主要體現在以下兩點：

（1）依託完善的風險分級制度

FDA依據細胞和組織產品風險的高低，將產品分為如下兩大類，並明確界定“最小操作”和“同源性使用”的含義：

 

來源：《中國食品藥品監管》

日本則由厚生勞動省（MHLW）按照三級風險對細胞治療進行申報備案管理的，如下：

來源：《中國食品藥品監管》

（2）依託完備的細胞製備體系和市場

針對細胞製備體系，美國FDA制定了較為完備的指南，包括工藝相關指南、臨床前期相關指南、針對特定疾病或特定細胞的指南、有效性和安全性指南等。日本細胞治療指導檔也涵蓋不同的疾病領域、細胞類型，聚焦細胞採集、細胞製備、品質評價、療效安全評估以及運輸和存儲標準等環節，基本實現細胞製備標準化。

關於細胞製備與流通市場，以幹細胞為例，根據市場公開資料，日本在2020年底發放細胞製備許可證已超過2700家。

2.基於我國細胞行業監管模式的沿革邏輯

未來的監管模式即是對過去、當前現狀的延伸和完善。

我國曾實行一段時間的“雙軌制”，2016年“魏則西事件”之後，原國家衛計委終止細胞治療收費，藥監部門則逐漸強化、明晰和完善按藥品監管的路徑和體系。根據當前法律法規、規範體系，我國細胞基因治療領域的“正清單”如下：

“正清單”之外領域的監管暫時留白，但趨勢邏輯卻在相關表徵中有所體現。如2019年國家衛健委曾發佈《生物醫學新技術臨床應用管理條例（徵求意見稿）》《體細胞治療臨床研究和抓華應用管理辦法（試行）》（徵求意見稿），雖至今仍未頒佈，但被業界認為是“雙軌制”回歸的信號。2023年5月9日衛健委發佈的《體細胞臨床研究工作指引（徵求意見稿）》，即進一步體現了體細胞IIT與幹細胞IIT監管模式逐漸趨同的趨勢。

3.基於我國細胞領域政策趨勢和立法邏輯

政策方面，繼納入十三五、十四五規劃、健康中國 2030 後，2022年初，工信部、發改委、科技部、衛健委等九部門聯合發佈《“十四五”醫藥工業發展規劃》，提出重點發展細胞治療等新型生物藥的產業化製備技術。2022年5月，發改委發佈《“十四五”生物經濟發展規劃》，提出發展基因診療、幹細胞治療、免疫細胞治療等新技術，加快相關技術產品轉化和臨床應用，推動形成再生醫學和精准醫學治療新模式，並推動政策先行先試。

立法方面，我國在科技進步、生物安全、人遺資源管理、資料安全、科學倫理、外商投資、技術進出口等領域密集立法或修訂，構建更符合當前國內外經濟、科技發展形勢的法律體系。

我們認為，我國針對細胞治療等生物科技行業的政策和立法基本邏輯整體為“鼓勵發展、守住紅線”，具體如下：

（二）監管趨勢與中國版“雙軌制”分析

1.商業存儲的監管趨勢分析

我們認為，一段時間內將商業存儲自體庫納入保藏審批監管的可能性不大。對於“存儲”行為，仍將根據“存儲目的”進行區分監管，即僅對基於科學研究目的的樣本庫要求保藏資質，具體如下圖：

特別指出的是，無論是否取得保藏許可，從事幹細胞存儲的企業和機構均應無差別遵守《生物安全法》、人遺條例、《刑法》等法律法規中關於人遺資源出境、國際合作、人遺資訊對外提供等監管的規定。

2.細胞醫美與大健康的監管趨勢分析

一方面，部分地方政府將幹細胞醫美作為地方特色經濟來支持。如昆明市於2022年8月發佈的《昆明市細胞產業發展規劃（2021-2035年）》，在“近期重點推進”部分提出，“以臨床技術（疾病治療、醫美應用）為行業突破點，打通臨床應用環節和支付環節，實現臨床技術在多病種上的突破”；在“重點任務”部分明確，“積極發展幹細胞美容製品，引進一批擁有核心技術的醫美製造企業；推進昆明醫療機構整形美容科室建設，推動幹細胞研發等多方向研究及在修復重建、組織再生、創傷修復等的治療應用；發揮昆明旅遊勝地的流量優勢，開發以幹細胞醫療美容服務為主題的旅遊產品”。

另一方面，2021年國家藥監局修訂發佈的《已使用化妝品原料目錄》中，並未收錄“幹細胞”作為化妝品原料。我國當前備案的幹細胞臨床研究中，也少有幹細胞在美容、抗衰方面的研究。

我們認為，長遠來看，細胞技術在醫美和大健康領域的應用將分別納入低風險臨床轉化細胞項目或保健品、化妝品等管道監管。但因我國細胞製備體系和市場相對滯後、幹細胞臨床研究“雙備案”門檻較高等現實因素，將“幹細胞製品”納入化妝品、保健品原料，或按照風險分級原則調整“雙備案”門檻，在短期內落地的可能性不大，因此，未來一段時間內該領域大概率仍處於監管留白。但相關探索不會停止，如2021年1月，《中國美容整形外科雜誌》即刊發《幹細胞在整形修復美容領域研究和臨床試驗的專家共識》，旨在為幹細胞在整形修復美容領域的研究與未來臨床轉化提供參考與支援。

3.細胞治療的中國版“雙軌制”模式分析

針對是否支持細胞治療臨床轉化應用，不同地方政府表現出不同的態度，代表性的地方政策包括：

鑒於當前多數備案醫院均不具備細胞製備能力，我國細胞製備工藝成熟度和市場容量也無法滿足全面放開IIT項目臨床轉化的需求，因此完全按實施主體性質進行分類監管的可能性不大；同時，若僅依風險分級進行監管，將封閉現有多數“雙備案”專案的臨床轉化通路，使得現有IIT研究的價值大打折扣，可行性亦受限。二種模式的優劣如下：

與之對應，我國細胞行業研發、生產產能和市場需求容量又亟需釋放。

綜上，我們認為，我國對細胞治療的監管大概率將出現如下變化或趨勢（各項內容或同步推進）：

（1）對體細胞、幹細胞臨床研究的監管日漸趨同，即均施行“雙備案”；

（2）率先在“雙備案”專案中開展風險分級管理，並嘗試放開低風險專案臨床轉化應用與收費；

（3）分類型、分病種完善細胞製備體系，統一或趨同不同監管通道的同類型細胞製備標準，擴容細胞製備市場和協力廠商檢驗檢測市場；

（4）加強IIT與IST並軌管理，完善和優化IIT資料用於新藥註冊申請的路徑和機制，進一步打通“雙備案”專案成果轉化通路；

（5）利用區域創新試點機制，擇較成功區域擴大試點。

具體如下圖

結語

儘管我國細胞行業的監管存在一定不確定性，但基於影響監管模式選擇的底層邏輯和要素分析，我們仍能捕捉較多的確定性。對於不同的組織或機構，宜提前佈局應對。如從事細胞醫美的機構，積極推動細胞在美容、抗衰方面的IIT研究與轉化，逐步將細胞醫美大健康項目納入各級、各類醫療機構經營範圍，或是其合規化發展趨勢。再如，對於地方政府，積極進行主動型管理佈局，或是提高當地營商監管環境，促進當地細胞產業發展的有力措施。

參考文獻

[1]山東省煙臺市中級人民法院（2020）魯06民終1331號民事判決書；

[2]上海市第一中級人民法院（2020）滬01民終4321號民事判決書；

[3]江蘇省泰州市中級人民法院（2017）蘇12民終570號民事判決書；

[4]《注釋刑法全書》陳興著，2022版；

[5]《細胞和基因治療產品監管科學研究進展和展望》，國家藥品監督管理局藥品審評中心高建超，韋薇，張旻，高晨燕，《中國新藥雜誌》2022年第31卷

[6]《國際細胞和基因治療製品監管比較及對我國的啟示》，虞淦軍等，《中國食品藥品監管》，2019年08期；

[7]冠昊生物科技股份有限公司2021、2022年度報告；

[8]中源協和細胞基因工程股份有限公司2021、2022年度報告；

[9]廣州賽萊拉幹細胞科技股份有限公司2021、2022年度報告；

[10]《誘導多能幹細胞（IPSC）技術及轉化、應用核心法律機制與問題研究》德恒律師，左玉傑等。

Zhonghua Xue Ye Xue Za Zhi. 2022 May; 43(5): 400–407.

Chinese. doi: 10.3760/cma.j.issn.0253-2727.2022.05.009

Abstract

目的

比較不同擴增體系NK細胞生物學特性的差異以及治療異基因造血幹細胞移植後（allo-HSCT）白血病復發的療效。

方法

分別採用CD3/CD52單抗擴增法和飼養層細胞擴增法誘導供者來源NK細胞大量擴增，檢測擴增前後NK細胞表型、因數分泌、細胞毒的變化規律；選取16例allo-HSCT後復發白血病患者，8例輸注CD3/CD52單抗擴增NK細胞，8例輸注飼養層細胞擴增NK細胞，觀察患者的治療反應和長期生存情況。

結果

①與CD3/CD52單抗擴增體系相比，飼養層細胞擴增體系NK細胞純度較高、NK細胞表面活化性受體DNAM-1及NKp30表達較高、抑制性受體CTLA-4表達較低，而兩種NK細胞NKG2D/CD25/CD69/Trail/PD-1/TIM-3/TIGIT表達差異無統計學意義。②兩種擴增體系NK細胞Ki-67指數均明顯增加，以飼養層細胞擴增NK細胞尤為明顯；飼養層細胞擴增NK細胞穿孔素及顆粒酶B表達水平均明顯高於CD3/CD52單抗擴增NK細胞。③16例allo-HSCT後復發白血病患者NK細胞輸注過程中均未觀察到明顯不良反應。NK細胞輸注後中位隨訪時間為2554（917～2583）d，CD3/CD52單抗擴增組中3例患者無白血病存活，5例死亡；飼養層細胞擴增組中6例患者長期存活，2例死亡。5例患者在NK細胞輸注前存在移植物抗宿主病，NK細胞輸注後移植物抗宿主病未加重甚至緩解。

結論

CD3/CD52單抗擴增與飼養層細胞擴增體系NK細胞的生物學特性具有明顯差異；NK細胞輸注對allo-HSCT後復發白血病患者的療效仍需要進一步驗證。

Keywords: 白血病, 復發, 擴增, NK細胞

異基因造血幹細胞移植（allo-HSCT）是白血病的有效治療手段，移植後復發是影響移植療效的主要原因。目前，移植後白血病復發的常規治療方法包括化療及供者淋巴細胞輸注（DLI），但DLI可使移植物抗宿主病（GVHD）的發生風險增加[1]。因此，探討新的復發後治療方法是提高白血病患者移植療效的關鍵。

自然殺傷（NK）細胞是構成機體重要的天然免疫屏障之一，無需致敏即可殺傷腫瘤細胞或感染的細胞，通過分泌穿孔素、顆粒酶等介導靶細胞殺傷[2]–[3]，另一方面可通過分泌IFN-γ、TNF-α等活化適應性免疫系統而發揮協同免疫防禦作用[4]。除此之外，抗體依賴的細胞介導細胞毒性作用（ADCC）也是NK細胞效應功能發揮的重要途徑。

NK細胞效應功能強度受NK細胞活化性受體與抑制性受體的平衡、NK細胞的成熟度及對細胞因數的回應體內外多種因素調控。內源性NK細胞往往受疾病及自身HLA分子抑制等多方面影響，數量及效應功能受損，但研究證明來自健康供者的NK細胞具有殺傷腫瘤細胞功能[5]。然而，若輸注的NK細胞數量少、療程短，患者仍面臨腫瘤復發的風險。目前，CD3/CD52單抗法和K562飼養層細胞法是臨床應用較多的兩種NK細胞體外擴增方法[6]–[7]。本研究比較了以上兩種擴增體系NK細胞的生物學特性，並回顧性分析比較了兩種擴增體系NK細胞過繼性輸注治療allo-HSCT後白血病復發患者的安全性及初步療效。

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物件與方法

一、NK細胞擴增方法

採集健康供者外周血，提取單個核細胞，CD3/CD52單抗擴增法參照文獻[6]，飼養層細胞擴增法參照文獻[8]。

二、NK細胞採集時間點

NK細胞擴增前采外周血檢測表型及功能，體外擴增2周後檢測擴增後NK細胞表型及功能各項指標。

三、NK細胞表型及功能評估方法

1. 表型評估：外周血來源的單個核細胞及擴增後的NK細胞，加入膜表面抗體標記，避光孵育30 min，溶血並PBS洗滌後上機檢測。抗體選擇見表1。

表1

流式細胞術評估NK細胞表型及功能所用抗體

生產商	抗體	標誌抗體	克隆號
BD	CD56	BUV737	NCAM16.2
BD	CD158a	BV421	HP-3E4
BD	CD45	V500	HI30
Biolegend	NKG2D	BV605	1D11
Biolegend	CXCR3	BV650	G025H7
Biolegend	CTLA-4	BV785	BNL3
BD	CD158e	FITC	DX9
Biolegend	CD158f	PE	UP-R1
Biolegend	CD57	PE-CF594	12G5
BD	PD-1	PE-Cy7	EH12.1
MACS	NKG2C	AF647	FAB138N
Biolegend	CD3	AF700	UCHT1
BD	CD16	APC-Cy7	3G8
BD	CD25	BUV395	2A3
BD	CD69	BUV737	FN50
Biolegend	4-1BB	BV421	4B4-1
Biolegend	CXCR4	BV605	12G5
Biolegend	CD27	BV650	O323
BD	TIM-3	BV711	7D3
Biolegend	LFA-1	FITC/AF488	m24
BD	CD94	Percp-Cy5.5	HP-3D9
BD	NKP46	PE	9E2/NKp46
Biolegend	CD96	PE-CF594	NK92.39
BD	CD62L	PE-Cy7	DREG-56
BD	DNAM-1	APC/AF647	DX11
Biolegend	CD56	APC-Cy7	HCD56
BD	NKP30	BV421	p30-15
Biolegend	TIGIT	BV605	A15153G
Biolegend	CX3CR1	BV650	2A9-1
BD	CD107a	BV786	H4A3
RD	TRAIL	FITC	FAB687G
Biolegend	NKP44	Percp-Cy5.5	P44-8
MACS	NKG2A	PE-Cy7	REA110
Biolegend	NKp80	APC/AF647	5D12

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2. 功能評估：對於NK細胞擴增前後細胞增殖及細胞毒的評估，則在膜表面抗體標記後，按照Cytofix/Cytoperm試劑盒（美國Becton Dickinson公司產品）說明固定破膜後標記細胞內免疫因數。抗體選擇見表1。

四、入組病例及移植方案

1. 病例：16例患者納入本研究。8例患者輸注CD3/CD52擴增NK細胞，均為2011年2月至2014年2月在北京大學血液病研究所進行allo-HSCT且移植後白血病復發患者；8例患者輸注K562飼養層擴增NK細胞，為2016年8月至2018年6月在北京大學血液病研究所進行allo-HSCT且移植後白血病復發患者。所有患者均簽署知情同意書。
2. 預處理方案：全部採用常規的改良BU/CY（白消安/環磷醯胺）方案，HLA配型不合患者移植預處理方案中加用抗胸腺細胞球蛋白（ATG）[9]。
3. 幹細胞的動員和採集：全部患者採用骨髓聯合外周血幹細胞移植，所有患者均以G-CSF動員5～6 d（−3 d開始），劑量為5 µg/kg[10]–[11]。
4. 急性GVHD的預防：採用環孢素A（CsA）聯合黴酚酸酯（MMF）及短程甲氨蝶呤（MTX）方案。
5. 植活標準：連續3 d中性粒細胞絕對計數（ANC）≥0.5×10⁹/L為粒細胞植活，PLT≥20×10⁹/L連續7 d且脫離血小板輸注為血小板植活[12]。

五、患者移植後微小殘留病（MRD）監測

多參數流式細胞術（MFC）和即時螢光定量PCR（RT-PCR）用來檢測MRD[13]。MRD陽性：①MFC連續兩次陽性或者WT1連續兩次陽性抑或是在同一標本中MFC或WT1陽性各1次；②移植後出現基因重排或突變。MRD緩解：在NK細胞輸注後達到MRD陰性狀態並維持至少1個月[14]。對於骨髓中原始細胞>5％定義為血液學復發。

六、隨訪

通過查閱住院/門診病歷及電話隨訪方式獲取患者生存資料。

七、統計學處理

採用GraphPad Prism8分析資料，採用非配對t檢驗進行單因素分析，P<0.05為差異有統計學意義。

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結果

一、兩種擴增體系NK細胞生物學差異

1. 兩種擴增體系NK細胞活化性受體的表達：CD3/CD52單抗擴增組NK細胞在CD45陽性淋巴亞群中的中位占比為18.9％，而飼養層細胞擴增的NK細胞中位數比例為85.0％，純度更高。通過對不同體系擴增前後NK細胞活化性受體的表達評估，我們發現滋養層擴增的NK細胞的活化性受體DNAM-1及NKp30的表達都明顯高於CD3/CD52單抗擴增組（P＝0.016，P＝0.006），而NKG2D、Trail占NK細胞的百分比在兩組間差異無統計學意義（P>0.05）（圖1、圖2）。CD25及CD69分別被認為是NK細胞早期活化和晚期活化的重要指標[15]。在我們的佇列中，CD25及CD69占NK細胞百分比在CD3/CD52單抗擴增組及飼養層擴增組均無明顯差別（P>0.05），提示兩種擴增NK細胞儘管在活化性受體表達方面存在差異，但兩者綜合的活化程度相當（圖1、圖2）。圖1兩種不同擴增體系NK細胞活化性受體表達

   1、2、3分別為擴增前組、CD3/CD52單抗擴增組、飼養層細胞擴增組。ns：差異無統計學意義；^a P<0.05

   圖2

   兩種不同擴增體系NK細胞活化性受體平均螢光強度（MFI）

   1、2、3分別為擴增前組、CD3/CD52單抗擴增組、飼養層細胞擴增組。ns：差異無統計學意義；^a P<0.05

   2. 兩種擴增體系NK細胞抑制性受體的表達：兩種體系擴增的NK細胞抑制性受體CTLA4、PD-1、TIM-3的平均螢光強度（MFI）較擴增前均明顯上調（P<0.001，P＝0.003，P＝0.001），然而Tigit的平均螢光強度無明顯變化（P>0.05）（圖3）。飼養層細胞擴增組NK細胞CTLA4（占NK細胞百分比）的表達明顯低於CD3/CD52單抗擴增組（P<0.001），而其他抑制性受體（PD-1、TIM-3、Tigit）在兩組間無論是平均螢光強度還是在NK細胞中占比差異均無統計學意義（P>0.05）。提示體外擴增誘導NK細胞活化的同時可能一定程度上伴隨功能耗竭。圖3兩種不同擴增體系NK細胞抑制性受體平均螢光強度（MFI）

      1、2、3分別為擴增前組、CD3/CD52單抗擴增組、飼養層細胞擴增組。ns：差異無統計學意義；^a P<0.05

      3. 兩種擴增體系NK細胞趨化型受體的表達：NK細胞向組織臟器中的遷移依賴於其表面的各種黏附性分子及趨化性受體的表達。為此，我們評估了不同擴增體系對NK細胞表面黏附性分子及趨化性受體表達的影響，結果顯示在飼養層細胞擴增組NK細胞中CXCR3、CD96的比例明顯高於CD3/CD52單抗擴增組（P＝0.004，P＝0.037），CX3CR1及4-1BB在NK細胞的表達比例在飼養層擴增組更低，CXCR4、CD94、CD27及CD62L的比例在兩種擴增體系NK細胞間差異均無統計學意義（P>0.05），提示從黏附分子和趨化受體表達角度，兩種擴增方法各有利弊（圖4）。圖4兩種不同擴增體系NK細胞趨化性受體表達

         1、2、3分別為擴增前組、CD3/CD52單抗擴增組、飼養層細胞擴增組。MFI：平均螢光強度；ns：差異無統計學意義；^a P<0.05

         4. 兩種擴增體系NK細胞功能表達差異：我們通過檢測擴增NK細胞的Ki-67指標評估其不同體系的擴增能力。結果顯示，飼養層擴增NK細胞的增殖潛能明顯高於CD3/CD52單抗擴增NK細胞（P＝0.033），穿孔素及顆粒酶B的表達水準也明顯高於抗體擴增NK細胞（圖5）。圖5兩種不同擴增體系NK細胞生物學功能比較

            1、2、3分別為擴增前組、CD3/CD52單抗擴增組、飼養層細胞擴增組。MFI：平均螢光強度；ns：差異無統計學意義；^a P<0.05。Perforin：穿孔素；Granzyme B：顆粒酶B

            二、入組患者的臨床特點

            CD3/CD52單抗擴增組中男5例、女3例，4例接受同胞HLA全相合allo-HSCT，4例接受haplo-HSCT，7例患者移植時處於完全緩解狀態，1例移植前為復發狀態。至2021年6月隨訪終止時，中位隨訪時間為2 554 d，共有3例患者死亡。

            飼養層擴增組中男4例、女4例，5例接受同胞HLA全相合allo-HSCT，3例接受haplo-HSCT，8例患者移植時均處於完全緩解狀態。患者首次接受供者來源NK細胞輸注的中位時間是移植後482 d。至2021年6月隨訪終止時，中位隨訪時間1 015.5（917～1 068）d，共有2例患者死亡。

            患者主要臨床特點和NK細胞治療前情況見表2。

            表2

            16例異基因造血幹細胞移植後復發白血病患者的一般資料及NK細胞治療前情況

            例號	性別	年齡	疾病類型	移植模式	急性GVHD	NK細胞輸注前化療方案	NK細胞輸注前疾病狀態
            1	男	37	AML-M2	HLA全相合	無	FLAG，HAA	血液學復發
            2	男	52	B-ALL	單倍型	無	COPD	血液學復發
            3	男	26	AML-M2	HLA全相合	無	HAA	髓外復發
            4	女	12	AML-M2	單倍型	Ⅰ度，皮膚Ⅱ度	無	MRD（+）
            5	男	21	MDS-RAEB2	單倍型	Ⅳ度（皮膚、肝）	無	MRD（+）
            6	女	46	AML-M2	單倍型	無	無	MRD（+）
            7	男	47	B-ALL	HLA全相合	無	COPD	髓外復發，MRD（+）
            8	女	33	AML-M2	HLA全相合	腸道Ⅰ度	無	血液學復發
            9	女	40	AML-M2	HLA全相合	無	無	MRD（+）
            10	男	31	AML-M2	單倍型	Ⅰ度，皮膚Ⅱ度	AA	MRD（+）
            11	女	54	AML-M4	HLA全相合	無	無	血液學復發，髓外復發，MRD（+）
            12	女	24	AML-M5	單倍型	皮膚Ⅰ度	AA	MRD（+）
            13	男	31	AML-M2	單倍型	無	無	血液學復發
            14	男	30	AML-M2	HLA全相合	無	FLAG	MRD（+）
            15	男	49	AML-M2	HLA全相合	無	無	血液學復發
            16	女	33	AML-M2	HLA全相合	無	無	MRD（+）

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            注：AML：急性髓系白血病；B-ALL：急性B淋巴細胞白血病；MDS-RAEB2：骨髓增生異常綜合征-難治性貧血伴有原始細胞增多2型；MRD：微小殘留病；FLAG方案：氟達拉賓+阿糖胞苷+G-CSF；HAA方案：高三尖杉酯堿+阿糖胞苷+阿柔比星；COPD方案：環磷醯胺+長春新堿+柔紅黴素+潑尼松；AA方案：阿柔比星+阿糖胞苷；GVHD：移植物抗宿主病

            三、安全性評價

            兩組患者在NK細胞輸注後均未觀察到發熱、血象下降、臟器功能損害等不良反應。

            四、NK細胞治療情況及療效評價

            飼養層細胞擴增組平均接受NK細胞輸注次數為1.25次，CD3/CD52單抗擴增組為2.4次。兩組共觀察到血液學復發5例（伴髓外復發1例），單純MRD持續陽性8例，單純髓外復發1例，髓外復發合併MRD陽性1例。患者NK細胞中位輸注次數為1次，移植後接受NK細胞輸注治療的中位時間為移植後434（103～1 225）d。NK細胞輸注後中位隨訪時間為2 554（917～2 583）d，復發患者緩解率為16.7％（1/6），MRD陽性患者轉陰率為54.5％（6/11），無白血病生存（LFS）率為43.75％（7/16），總生存（OS）率為56.25％（9/16）。對於持續緩解的患者，NK細胞治療後有6例患者接受化療聯合DLI，4例行2次移植。

            飼養層擴增組8例患者中6例有治療反應，其中HLA全相合移植4例，haplo-HSCT 2例，輸注過程均無明顯不良反應，其中5例患者至今無白血病長期生存，1例患者因血液復發死亡。CD3/CD52單抗擴增組8例患者中4例有治療反應，其中HLA全相合移植2例，haplo-HSCT 2例，輸注過程均無明顯不良反應，其中3例患者至今無白血病長期生存，1例因重症肺炎導致呼吸衰竭而死亡。

            而對NK細胞回輸治療無反應患者中，CD3/CD52單抗擴增組8例患者中4例無治療反應（1例為持續MRD陽性，3例為血液學復發），經化療、DLI等治療均未得到緩解，4例均死亡（死於中樞神經系統感染、重度GVHD合併TMA各1例，血液學復發2例）。在飼養層細胞擴增組8例患者中有2例無治療反應（均為MRD持續陽性），經化療後分子學及血液學復發指標均未得到緩解，其中1例NK細胞輸注後MRD仍持續陽性，但後續再行DLI治療後MRD轉陰，至今無白血病生存；另一例患者死于髓外復發。

            CD3/CD52單抗擴增組、飼養層擴增組NK細胞輸注後MRD轉陰率分別為50％（2/4）、50％（3/6）。

            滋養層擴增組的例11在接受NK細胞治療前有重度慢性GVHD（累及肺、皮膚、口腔等器官）；另有3例在移植後分別表現為皮膚、口腔及指甲、皮膚及肺部急性GVHD表現，輸注後症狀緩解。

            在CD3/CD52單抗擴增組，我們觀察到3例患者GVHD症狀在NK細胞輸注後緩解，提示NK細胞可能有抗GVHD的功能。NK細胞治療情況及療效見表3。

            表3

            16例異基因造血幹細胞移植後復發白血病患者的NK細胞治療情況及隨訪結果

            例號	NK細胞輸注次數	NK細胞輸注量（×109/L）	療效評估	隨訪時間（d）	隨訪結果
            1	2	6.20	無效	2 560	死亡（中樞神經系統感染）
            2	1	4.76	無效	2 560	死亡（重度GVHD/TMA）
            3	5	6.62	有效	2 583	存活
            4	1	4.19	有效	2 540	存活
            5	3	6.02	有效	2 540	存活
            6	1	0.36	無效	2 554	死亡（血液學復發）
            7	5	10.31	有效	2 554	死亡（重症肺炎）
            8	1	6.44	無效	2 552	死亡（血液學復發）
            9	1	6.18	有效	1 068	存活
            10	2	7.02	有效	1 064	存活
            11	1	7.10	有效	1 019	存活
            12	1	4.40	無效	917	存活
            13	1	7.32	有效	1 012	死亡（血液學復發）
            14	2	3.14	無效	994	死亡（血液學復發）
            15	1	3.82	有效	917	存活
            16	1	2.48	有效	1 047	存活

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            注：GVHD：移植物抗宿主病；TMA：血栓性微血管病

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            討論

            NK細胞是機體天然免疫屏障的重要組成，是抗病毒和抗腫瘤的主力軍之一[7]。除此之外，供者KIR不相合的NK細胞輸注至受者體內，可通過抑制受者來源的抗原提呈細胞及T細胞，降低移植物抗宿主病的發生。因此，過繼性輸注NK細胞的免疫療法已成為了潛在抗腫瘤的有效治療方式。然而，由於外周血NK細胞比例低，獲取數量少，使得NK細胞治療療效受限。體外細胞擴增體系的發展使得NK細胞可在短期（2～3周）內獲取，並且輸注的NK細胞在動物及人體中均顯示發揮抗腫瘤效應的同時不增加GVHD的發生率[5]。但是，不同擴增體系產出的NK細胞生物學特性和臨床療效存在較大差異[16]–[17]。Masuyama等[6]首次通過CD3/CD52單抗體外刺激外周血單個核細胞後聯合自體血漿及IL-2，在無飼養層細胞體系中實現了NK細胞的量級擴增，且抗腫瘤功能增強。儘管該無飼養層體系擴增NK細胞比例相對較高，但培養14 d後的擴增細胞中CD8⁺T細胞及CD4⁺T細胞比例中位值分別為60％、15％。隨著體外擴增體系的完善，體外飼養層細胞擴增體系擴增NK細胞效率更佳[14]。然而體外飼養層細胞擴增體系需要大量且持續的因數刺激，當輸注至體內後，細胞因數刺激驟失將導致輸注後NK細胞代謝加快。本研究首次對CD3/CD52單抗擴增NK細胞與K562飼養層擴增NK細胞的生物學差異進行探討，結果顯示，以K562飼養層擴增的NK細胞純度較高、T細胞含量較低。兩種不同擴增體系NK細胞活化性受體表達及KI-67均明顯高於擴增前NK細胞，說明NK細胞擴增同時伴隨著功能活化，尤以飼養層擴增組NK細胞的增殖水準及活化性受體DNAM-1及NKP30的表達水準更高，而抑制性受體CTLA4表達明顯低於CD3/CD52單抗擴增組，抑制性受體PD-1、Tigit及Tim-3的表達在兩組間無明顯差異。以上結果提示飼養層擴增的NK細胞的抗腫瘤能力可能更強。值得注意的是，兩組擴增後NK細胞的活化性受體明顯增加，抑制性受體相較於擴增前組也明顯上調，這與Judge等[18]的報導一致，可能是擴增NK細胞為了防止過度活化的適應性調控。

            既往有研究前瞻性評估不同體系擴增的NK細胞在治療AML中的療效，結果提示過繼性NK細胞輸注在治療低白血病負荷中有優勢[8],[14]，然而尚未有研究報導不同體系擴增的NK細胞在治療AML中的療效差異。在本研究中，兩種不同擴增體系NK細胞在生物學特性上存在差異，兩種擴增體系NK細胞輸注對移植後血液學復發白血病患者均無顯著療效；而對持續MRD陽性患者來說，在CD3/CD52單抗擴增組和飼養層擴增組，分別有50％（2/4）、50％（3/6）的MRD陽性患者NK細胞治療後轉陰，提示NK細胞治療可能有清除體內MRD作用，並且以飼養層擴增NK細胞效果更好，這可能與飼養層擴增的NK細胞活化性受體表達更高有關；與此同時，本研究結果表明飼養層擴增NK細胞趨化型因數受體CXCR3與CXCR4的表達均明顯高於CD3/CD52單抗擴增NK細胞，提示飼養層擴增NK細胞的遷移速度與向骨髓的趨化能力更高，也更有利於擴增NK細胞向腫瘤部位的遷移[19]。同時，Denman等[20]的研究表明裝載IL-21的K562細胞作為飼養層細胞體外擴增NK細胞的端粒酶更長，提示滋養層擴增NK細胞可能體內存活時間更長。

            在本研究中，兩種擴增體系NK細胞治療移植後復發白血病患者並未引起或加重GVHD，且兩組均有部分患者的急慢性GVHD症狀在NK細胞輸注後得以緩解，提示NK細胞輸注治療的安全性良好。既往研究表明NK細胞在抗白血病細胞的同時具有抗GVHD效應[5]，這得益於NK細胞對效應性T細胞的功能和數量制約：一方面NK細胞可殺傷供者來源的T細胞，同時可通過殺傷不成熟的樹突狀細胞減少抗原提呈[21]–[22]。與此同時，異基因來源的NK細胞不損傷患者的靶器官，因此不會發生GVHD和細胞因數風暴（CRS）。

            本研究結果初步顯示，CD3/CD52單抗擴增與飼養層細胞擴增體系NK細胞的表型和功能具有明顯差異，兩種擴增體系NK細胞在治療移植後持續MRD陽性均有效。本研究為回顧性研究且佇列樣本數少，因此NK細胞輸注對allo-HSCT後復發白血病患者的療效仍需要進一步驗證。

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            Footnotes

            利益衝突 本研究所用NK細胞產品由北京賽傲生物技術有限公司提供

            作者貢獻聲明 曹勳紅：資料收集、資料分析、文章撰寫；趙翔宇：研究設計、寫作指導；其他：資料收集

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            References

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