近年來，細胞治療顯現出巨大的研究潛力和臨床價值。嵌合抗原受體T細胞（CAR-T細胞）治療在血液腫瘤領域已取得重大進展，CD19 CAR-T治療B-ALL完全緩解率高達90％。但CAR-T治療仍面臨諸多挑戰：①自體T細胞質量不足，異體T細胞引起移植物抗宿主病（GVHD）風險；②製備耗時；③細胞因數釋放綜合征（CRS）和免疫效應細胞相關神經毒性綜合征（ICANS）等不良反應；④復發；⑤價格高昂。CAR-自然殺傷（NK）細胞可以在一定程度上彌補CAR-T治療的局限，是最具潛力的新一代CAR細胞治療產品。2020年一項靶向CD19 CAR-NK治療B系腫瘤的臨床研究實現了73％的緩解率和64％的完全緩解率，並且無GVHD、CRS和ICANS發生，首次確定CAR-NK臨床應用的有效性和安全性。本文我們主要對NK細胞生物學特點、CAR-NK作用機制、CAR-NK與CAR-T的比較、血液腫瘤CAR-NK研究現狀、目前的優化措施進行了總結歸納。

一、NK細胞生物學特點

NK細胞屬於大顆粒淋巴細胞，在外周血中占10％～15％，是天然免疫反應的關鍵組分。作為第一道免疫防線，NK細胞可以自發殺傷腫瘤細胞而不需抗原提呈。NK細胞表面有大量的啟動型受體（NKG2D、NKp46、NKp44、NKp30、CD16、2B4、DNAM1等）和抑制性受體（NKG2A、KIRs、TIGIT、CD96、LAG3、TIM3、PD1、KLRG1、CD161等），對靶細胞的耐受或殺傷取決於這兩類受體信號輸入的動態平衡。NK細胞啟動後脫顆粒，釋放多種細胞毒性物質（顆粒酶B、穿孔素、粒溶素），導致靶細胞裂解。

NK細胞表面的CD16（FcγR Ⅲ）受體可以識別結合在靶細胞表面的抗體Fc段，通過抗體依賴的細胞介導的細胞毒作用（ADCC）以顆粒酶B依賴性機制發揮裂解靶細胞的功能。表面的Fas配體和腫瘤壞死因數相關凋亡誘導配體（TRAIL）可以分別和腫瘤細胞表面的Fas和TRAIL受體結合，誘導靶細胞內凋亡相關蛋白酶的活化，觸發靶細胞內死亡受體依賴性凋亡機制。啟動的NK細胞可以分泌多種趨化因數招募T細胞、單核細胞和中性粒細胞，分泌IFN-γ、TNF-α、GM-CSF和IL-10等細胞因數調節樹突狀細胞、巨噬細胞和T細胞，從而調動更多的免疫細胞參與抗腫瘤免疫反應。

二、CAR-NK作用機制

CAR結構是基於T細胞或NK細胞活化所依賴的信號設計的，包活啟動受體信號（信號1）、共刺激信號（信號2）和細胞因數信號（信號3）。CAR-NK細胞的CAR結構包含胞外段、跨膜段和胞內段，早期CAR-NK設計延用CAR-T細胞中的CAR結構。CAR-NK胞外段主要是抗體單鏈可變區。CAR-NK常用的跨膜段是由CD3ζ、CD8或CD28改造而來，其中T細胞特異性的CD8和CD28最常用。胞內段負責CAR-NK接收到靶抗原信號後的細胞啟動，是信號傳導下游所招募的共刺激分子和信號結構域的線性結構。目前CAR-NK中涉及的共刺激分子主要包括免疫球蛋白超家族成員（CD28），TNF受體超家族成員（4-1BB、CD27和OX40）, 信號通路淋巴細胞活化分子相關受體家族（2B4）。胞內段不同分子構成是區分目前四代CAR的主要分類依據。第一代CAR只包含CD3ζ，第二代和第三代則在第一代基礎上分別添加一個或兩個共刺激結構域，第四代則在第三代基礎上增加了細胞因數分泌段，以維持CAR細胞的細胞毒性和持久性。目前CAR-NK領域最常用的為CD28-CD3ζ和41BB-CD3ζ兩種二代CAR結構；而在第三代中，CD28-41BB-CD3ζ最常用。另外，回輸CAR-NK細胞的KIR與受者KIR配體不匹配可通過“迷失自我”機制增強NK細胞內在的非CAR依賴性抗腫瘤活性。

三、CAR-NK與CAR-T治療的比較

相比較而言，CAR-NK不僅可以彌補前述CAR-T的不足，而且顯示出額外的優勢（表1）。對於異體來源的細胞，異體CAR-T即使在相合情況下也有免疫排斥的風險，異體CAR-NK即使低HLA相合度（1/6）條件下也未觀察到GVHD事件。另外，KIR配體與受體的不匹配更能啟動NK細胞天然殺傷毒性。腫瘤細胞可以通過下調主要組織相容性複合物（MHC）Ⅰ類分子逃避T細胞的識別殺傷，但是基於“迷失自我”機制NK細胞可以識別殺傷這些細胞。另外，CAR-NK聯合單克隆抗體可以通過ADCC增強腫瘤清除效果，治療策略具有多樣性。在安全性方面，CAR-T細胞發揮效應過程中產生的INF-γ、TGF-α、IL-1和IL-6因數等可以引發CRS和ICANS。然而，NK細胞主要分泌IL-3和GM-CSF，引起CRS和ICANS風險極低，並且在臨床試驗（NCT03056339）中未觀察到相應不良事件。同時，由於腫瘤微環境中PD-1的表達，CAR-T細胞的功能受到抑制，而NK細胞受影響較小。CAR-NK細胞將保留其固有的通過啟動性受體識別和靶向腫瘤細胞的能力，使腫瘤細胞通過下調CAR靶抗原導致復發的可能性低於CAR-T細胞。多來源、多殺傷途徑以及低惡性不良反應風險使CAR-NK細胞更有潛力成為通用型產品（表2）。在血液腫瘤和實體瘤臨床前實驗中，CAR-NK在和CAR-T的對比殺傷中呈現早期快速高效殺傷和低毒性的特點。雖然可獲得的CAR-NK臨床資料有限，但是大量的臨床前研究所顯示的CAR-NK的腫瘤控制能力，展示了其未來應用於臨床的美好前景。

表1

CAR-T與CAR-NK細胞的特徵比較

注 CAR-T：嵌合抗原受體T細胞；CAR-NK：嵌合抗原受體自然殺傷細胞；GVHD：移植物抗宿主病；CRS：細胞因數釋放綜合征；ICANS：免疫效應細胞相關神經毒性綜合征

表2

嵌合抗原受體自然殺傷細胞（CAR-NK）來源

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注 PB-NK：外周血來源的NK細胞；CB-NK：臍血來源的NK細胞；iPSC-NK：誘導多能幹細胞來源的NK細胞。^a NK-92細胞系，該細胞系製備和編輯容易，對凍融迴圈的敏感性低，臨床輸注前需輻照

四、血液腫瘤領域CAR-NK研究現狀

截至2021年11月，在血液腫瘤領域的臨床前研究有50多篇，Clinicaltrials註冊的CAR-NK臨床試驗有20項，具體見表3。

表3

2021年11月Clinicaltrials註冊的嵌合抗原受體自然殺傷細胞（CAR-NK）臨床研究

注 CLL：慢性淋巴細胞白血病；NHL：非霍奇金淋巴瘤；ALL：急性淋巴細胞白血病；MM：多發性骨髓瘤；AML：急性髓系白血病；MDS：骨髓增生異常綜合征；PB-NK：外周血來源的NK細胞；CB-NK：臍血來源NK細胞；iPSC-NK：誘導多能幹細胞來源NK細胞；NK-92：NK-92細胞系；mIL-15：膜表達IL-15；IL-15RF：IL-15/IL-15Rα融合蛋白；–：未提及

1. B系淋巴瘤和白血病：基於CAR-T在B系腫瘤中的成功應用，CAR-NK在B系淋巴瘤和白血病中同樣取得矚目的成績。靶向CD19的CAR-NK治療B系腫瘤的臨床研究結果顯示CAR-NK細胞治療在患者中實現了73％的緩解率和64％的完全緩解率。首次確定CAR-NK臨床應用的可行性和有效性。現有的臨床前和臨床研究靶點主要有CD19、CD20、CD22、EBNA、WT-1和CD19/CD22雙靶。在目前註冊的CAR-NK臨床試驗中，針對B系腫瘤的占絕大多數。雙靶CAR-NK的研究也率先在B系腫瘤中開展。
2. 多發性骨髓瘤（MM）：在MM領域，CAR-NK研究的靶點主要有BCMA、CS1（SLAMF7）、CD138、CD19和NKG2DL。CD138 CAR-NK-92MI和CS1 CAR-NK92都呈現出良好的腫瘤控制能力並延長MM異種移植小鼠生存期。除了NK細胞系的應用，自體CAR-NK也顯示出優越的效果。從MM患者體內分離出啟動和擴增的NK細胞，並針對MM細胞表面高表達的NKG2DL（MICA、MICA/B、ULBP-1、ULBP-2、ULBP-3等）製備NKG2D CAR-NK細胞，顯示出高效的腫瘤清除率，且對正常細胞毒性低，小鼠體內也未觀察到GVHD和治療相關毒性。
3. T系腫瘤：在T系腫瘤領域，目前CAR-NK的研究靶點有CD3、CD4、CD5和CD7。Chen等給予3次CD3 CAR-NK92治療顯著改善了Jurkat細胞種植小鼠的生存情況，並且兩周內瘤負荷降低87％。CD4為成熟T細胞的標誌，CD4 CAR-NK在有效殺傷腫瘤細胞的情況下不影響造血幹細胞和早期祖細胞的功能，展示出較高的安全性，並且2次CAR-NK92輸注延長了小鼠生存時間。CAR-NK最早在T系腫瘤中應用的多次輸注模式為後續CAR-NK的臨床應用提供了新的思路。由於目前的T系靶點缺乏腫瘤特異性，往往引起T細胞再生障礙。基於CAR-NK治療的安全性，研究者提出在CD3 CAR-NK治療前/中/後聯合移植降低腫瘤負荷，同時通過清除供者來源T細胞避免CVHD，通過清除宿主T細胞避免急性器官排斥反應。
4. 急性髓系白血病（AML）：CAR-NK在AML領域目前的研究靶點主要有CD4、CD7、CD33、CD38、CD123、FLT3和NKG2D，由於目前的靶點在髓系細胞或其他系細胞上廣譜表達，細胞治療在AML上應用有限，更特異性的靶點目前正在探索中。CD70 KO CD70 CAR-NK和CLL-1 CAR-NK聯合CISH敲除的臨床前資料顯示靶向治療AML有一定潛力。新一代的FLT OR CD33 NOT MECN 邏輯門CAR-NK細胞研究（SENTI-202）顯示，一方面啟動性CAR可以識別FLT3或CD33，優於傳統的單靶FLT3或CD33 CAR-NK，另一方面抑制性CAR可以保護高達67％的FLT3陽性正常細胞免受啟動性CAR所介導的細胞毒性。邏輯門CAR-NK的應用在治療AML上有較大的探索空間。

五、提高CAR-NK治療的有效性

隨著CAR-NK研究的深入，研究者們採取一系列優化措施來提高CAR-NK的有效性。

（一）優化CAR結構

1. NK特異性CAR結構：NK細胞特異性的典型分子NKG2D、2B4和DNAM1被用來探索更優化的跨膜段，CD107a脫顆粒效應和細胞毒性更強。另外，跨膜段設計應遵循NK細胞上跨膜蛋白的自然方向（N→C端），天然NKG2D分子具有C→N端跨膜區域，且具有短的細胞質尾，直接應用效果受限，而逆轉NKG2D 跨膜段為N→C端可能增強CAR效應。

研究者對CAR-NK的CAR胞內段也進行了更深入的探索。在靶向CD5的CAR-NK治療T系腫瘤的臨床前實驗中，2B4ζ-CAR-NK相比於41BBζ-CAR-NK有更高水準的啟動受體（CD69、NKG2D、HLA-DR）表達和更高水準的細胞因數（IFN-γ和TNF-α）分泌。信號結構域除了CD3ζ，NK特異性的DAP10、DAP12也被用來進行了優化CAR結構設計的探索，但是效果欠佳。DAP12.CAR與CD3ζ.CAR的殺傷毒性無顯著差異，但是CD3ζ.CAR細胞有更慢的CAR表達下調速度和較強的脫顆粒能力。而在NKG2D-2B4ζ結構基礎上再添加DAP10或DAP12也並沒有對CAR-NK細胞功能引起差異性改變。

而對於整個CAR結構，NK特異性跨膜段和共刺激分子組合NKG2D-2B4ζ，相較於T細胞特異性CAR CD28-41BBζ，誘導CAR-NK的CD107a表達和IFN-γ分泌水準更高，並介導細胞內下游磷酸化分子水準升高提前。因此，NK細胞特異性結構域參與的不同排列組合在探索更優CAR結構中將有更大的潛能。

2. 雙靶CAR結構：單靶CAR細胞可能由於靶抗原下調或陰性而導致腫瘤細胞逃逸，而表達雙CAR的細胞可以提高CAR細胞的識別和靶向攻擊效率。同時表達並聯雙靶CD19/CD22的CAR-NK細胞可以高效殺傷CD19單表達和CD22單表達的RS4;11細胞，從而避免因一種抗原丟失導致的CAR-NK失效[12]。

（二）增強細胞毒性

1. 誘導型MyD88/CD40共刺激分子（iMC）：iMC是一種核糖核酸調節的蛋白開關，在CAR-T中可以作為細胞啟動劑促進CAR-T細胞增殖和改善持久性，應用到CAR-NK細胞中，研究者發現iMC啟動的CAR-NK顯示出細胞因數和趨化因數分泌增加，穿孔素和顆粒酶B脫顆粒水準提高，進而增強抗腫瘤細胞毒性。
2. 記憶NK分化：IL-12、IL-15和IL-18預處理NK細胞可以誘導記憶表型，即細胞因數誘導的記憶樣NK（ML NK）細胞。ML NK呈現出糖酵解代謝譜，啟動受體表達增加，並且不受KIR-KIRL相互作用的干擾，在NSG異種移植小鼠模型體內顯示出更長的存活時間，並顯著改善了針對一系列靶點的效應功能。ML NK分化表型和CAR工程化協同增強NK細胞對耐藥的白血病/淋巴瘤的反應性，並且體內實驗顯示19-CAR-ML NK可以降低人源化小鼠的瘤負荷並改善小鼠生存。
3. 增強ADCC作用：NK-92細胞系不表達CD16分子，通過修飾編輯使其表達IgG Fc受體的高親和力變異體（FcγRⅢ）同時聯合利妥昔單抗可以增強ADCC作用。同時表達高親和力非裂解性CD16的CAR-iPSC-NK（FT596）聯合利妥昔單抗目前也已用於臨床試驗中（NCT04245722）。

（三）延長持久性

1. IL-15：IL-15在NK的生存、發展、啟動、代謝改變方面發揮重要作用，與CAR-NK細胞在體內的存續性密切相關。目前的CAR-NK產品多為自分泌IL-15，自分泌模式可以使CAR-NK持續處於高濃度IL-15微環境中，延長CAR-NK細胞的體記憶體續時間長達12個月。另外，膜表達IL-15（mIL-15）配體可以通過細胞間交互介導的反式信號傳遞模式來傳遞更強的IL-15刺激信號，並應用於臨床試驗中（NCT04623944）。表達mIL-15/IL-15Rα融合蛋白的CAR-NK（FT596）產品目前也應用於治療B系血液腫瘤的臨床試驗（NCT04555811和NCT04245722）。細胞因數誘導型含SH2蛋白（CIS）是IL-15信號的關鍵的負性調節因數，CRISPR/Cas9基因編輯敲除CISH基因的CAR-NK細胞通過增強Akt/mTORC1軸和c-MYC信號，提高有氧糖酵解水準，進而增強CAR-NK細胞效應功能[27]。
2. 多次輸注：基於目前的臨床和臨床前資料來看，CAR-NK在體內的擴增和持續有限，單次輸注雖然有很強的腫瘤殺傷效果，但是可能不能完全清除腫瘤細胞，因此連續重複輸注大劑量CAR-NK細胞以維持體內CAR-NK動力學穩定和持久可能是未來CAR-NK治療的策略[28]。

（四）減少耗竭信號

NK細胞受免疫檢查點的影響相對T細胞較小，但是其在NK細胞耗竭過程中仍發揮著重要作用。PD-1在活化和更具反應性表型的NK細胞上的表達更為豐富。PD-L1阻斷劑可以提高NK細胞的體內持久性和保留其細胞毒性，同時提高體內NK細胞通過ADCC的抗腫瘤效應[29]。另外，抗PD-L1抗體作為PD-L1+NK細胞的功能性啟動抗原，通過p38信號通路提高NK細胞對白血病細胞的殺傷毒性[30]。TIGIT是表達在T細胞和NK細胞上的與耗竭相關的免疫檢查點，高表達TIGIT的NK細胞伴隨著CD107a、IFN-γ和TNF-α等活化因數的分泌減少，並與疾病進展和免疫逃逸相關[31]。研究顯示離體的NK細胞IL-15活化後伴隨有TIGIT表達上調，聯合抗TIGIT抗體顯著提高NK的腫瘤殺傷毒性[32]。阻斷TIGIT可以延緩NK細胞耗竭，並在多種小鼠荷瘤模型中促進了NK細胞依賴性腫瘤免疫，並以NK依賴性方式促進了腫瘤特異性T細胞免疫[33]。

目前，血液腫瘤領域尚無CAR-NK聯用免疫檢查點阻斷的應用，在實體瘤領域，靶向PD-L1的CAR-NK細胞（PD-L1 CAR t-haNK細胞）聯合使用抗PD-1抗體和N803呈現出良好的腫瘤控制效果（NCT04847466）[34]。CAR-NK聯合免疫檢查點阻斷的應用尚待進一步探索。

（五）避免自絞殺

CD38是MM已確立的免疫治療靶點，而其是否可以作為AML的治療靶點尚待探索。但是由於CD38在NK細胞上的基礎資料表達以及離體培養過程中進一步誘導上調成為設計靶向CD38的CAR-NK的障礙。通過敲除NK細胞的CD38製備的CD38 KO CD38 CAR-NK顯示出自絞殺減低和靶向攻擊AML原代細胞的能力增強的現象[35]。

（六）改善趨化性

CAR-NK可以趨向於腫瘤病變部位。回輸到淋巴瘤患者體內的CAR-NK淋巴結部位數目顯著高於骨髓和外周血[2]。然而，體外培養的NK細胞會下調CXCR4、上調CXCR3表達，導致NK細胞骨髓歸巢能力下降，而趨向於炎症部位，使NK細胞滯留在髓外組織[36]。共表達CXCR4的CAR-NK向骨髓巢的遷移能力增強，並顯著降低MM移植小鼠模型股骨區域的瘤負荷[21]。

六、CAR-NK治療的安全性

NK細胞表面抑制性受體識別正常細胞表面的MHC Ⅰ類分子通過“耐受”機制來抑制對正常細胞的毒性。異體輸注時也不會介導GVHD的發生。對於工程化的CAR-NK，為了避免和抵消增強療效相關措施帶來的毒性風險，相關“自殺”開關也同時被設計於CAR-NK中。通過加入一個正交調節的促凋亡開關，即雷帕黴素誘導的Caspase-9（iRC9），iRC9二聚化促進CAR-NK細胞凋亡，表現為雷帕黴素呈劑量依賴性的誘導細胞表面Annexin Ⅴ表達[22]。在已發表的臨床試驗中，CAR-NK顯示出較高的安全性，低GVHD、CRS和ICANS風險，研究者並沒有啟動iCR9開關[2]。

七、結語

CAR-NK在療效方面顯示出巨大的潛能，在安全性方面顯示出巨大的優越性。但是CAR-NK也存在大規模製備方法改進、凍存措施優化和療效增強的需求，同時體記憶體續時間短、耗竭問題尚待解決。總體來說，CAR-NK在未來更有可能成為通用型細胞產品，在單藥或者聯合移植、單抗等治療方面有較大的優勢。CAR-NK研究開創了細胞治療的新思路，相信在不久的將來隨著CAR-NK細胞治療技術的成熟將給更多腫瘤患者帶來福音，使人類向攻克難治復發性腫瘤治療的難題更進一步。

Zhonghua Xue Ye Xue Za Zhi. 2022 Dec; 43(12): 1051–1056.

Chinese. doi: 10.3760/cma.j.issn.0253-2727.2022.12.015

引言

NK細胞在癌症治療中的潛力已經被諸多研究證實，隨著研究的進展，科學家證實了其在癌症之外的多種疾病的治療潛力。近期，科學家發現，NK細胞有能力清除可能導致疼痛的受損神經細胞，在治療神經性退行性疾病方面展示出了其非凡的潛力，有助於阻止帕金森病的進展。

面對神經性疼痛，目前全球範圍內最主流的緩解方式是服用阿片類藥物。但是相關研究人員表示，使用阿片類藥物或抗抑鬱藥只是暫時緩解這些疼痛症狀，而無法從根本解決。同時有資料表明，在1999年至2020年期間，美國過量服用阿片類藥物達到56.4萬人，這對身體造成的風險和副作用不可估計。近日，一篇發表在國際醫學期刊《Trends in Neurosciences》的文章表示，自然殺傷(NK）細胞可能成為神經性疼痛的替代療法。研究人員收集了NK細胞對疼痛影響的現有證據，指出它們有能力清除可能導致疼痛的受損神經細胞，未來或成為安全有效的治療方式。

NK細胞通過多種途徑改善神經性疼痛:神經性慢性疼痛是由創傷、病毒感染、化療等各種病理條件導致神經系統的病變引起的。病變的神經元連接錯誤或停止正常功能後，將引起常駐免疫細胞的啟動，其產生和分泌各種炎症介質。這些介質促進神經免疫反應啟動，從而出現疼痛症狀。而引入NK細胞可以幫助消除這些異常的神經元，小鼠實驗表明，如果一個神經元處於功能異常狀態，它的軸突部位（負責傳遞資訊的部分）就會產生一種叫做RAE1應激配體分子，後者可以提醒NK細胞它們需要修剪。

因此從理論上講：

NK細胞可以通過特異性殺傷損傷細胞來解決周圍神經損傷所帶來的疼痛。

同時，NK細胞也能夠進行免疫調節，通過間接釋放細胞因數或趨化因數，或者通過直接殺死其他免疫細胞進行調節，理論上可用於減弱免疫反應所帶來的炎症性疼痛。

NK細胞有助於阻止帕金森的進展

除此之外，NK細胞在治療神經性退行性疾病方面也展示出了其非凡的潛力。

帕金森病（Parkinson’s disease，PD）又名震顫麻痹，是一種常見的神經系統變性疾病，在老年人群中多見。目前認為其發病原因與大腦中多巴胺神經元內一種名為α-突觸核蛋白（α-Syn）相關。它可以調節突觸囊泡內神經遞質的聚集和釋放，還可以在細胞核中通過與組蛋白結合調節自身基因的表達。在帕金森患者體內，異常的α-SYN錯誤折疊、堆積（聚集形成原纖維），無法發揮正常功能，從而導致神經元死亡。因此α-SYN是帕金森病發病機制中最重要的蛋白。帕金森病目前傳統的治療方式多以藥物治療和手術治療為主。但美國佐治亞大學再生生物科學中心的研究人員發現，NK細胞也有助於阻止帕金森病的進展。

一篇發表於《美國國家科學院院刊》的名為《NK cells clear α-synuclein and the depletion of NK cells exacerbates synuclein pathology in a mouse model of α-synucleinopathy》的文章表示NK細胞是攻擊“入侵者”的高效“清除劑”，可通過減少腦部炎症和清除、抑制異常蛋白質聚集而對大腦發揮保護作用。研究人員用不同濃度的α-syn處理了人類NK細胞後，發現NK細胞能夠有效地降解細胞外α-syn聚集體，這可能在病理上對調節和抑制神經退行性疾病至關重要。

隨著醫學發展，以往認為帕金森病是單一腦部疾病的認知也正在更新，越來越多研究證實免疫系統和中樞神經系統之間存在關聯。上述研究進一步證實了NK細胞在神經系統疾病方面治療的應用可能。

參考文獻：

[1] The therapeutic potential of natural killer cells in neuropathic pain

https://www.cell.com/trends/neurosciences/fulltext/S0166-2236(23)00133-9

[2] NK cells clear α-synuclein and the depletion of NK cells exacerbates synuclein pathology in a mouse model of α-synucleinopathyhttps://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/31900358/

Beijing Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban. 2019 Jun 18; 51(3): 591–595.

Chinese. doi: 10.19723/j.issn.1671-167X.2019.03.032

Abstract

目的

評估同種異體自然殺傷(natural killer, NK)細胞治療原發性肝癌的安全性和有效性,並探討其抗腫瘤機制。

方法

對21例經同種異體NK細胞治療的原發性肝細胞癌患者進行1年隨訪,通過對其生存期、影像學指標、血液學指標、生物化學指標及免疫學指標分析,評價該治療的安全性和有效性,分析患者經過治療後外周血淋巴細胞亞群的變化。

結果

(1)21例原發性肝癌患者中,11例患者治療1次,5例患者治療2次,5例患者治療3次,患者治療後未見嚴重不良反應,10例患者有一過性發熱,1例患者出現肝區疼痛,1例患者出現頭痛,未經治療均於8 h內自行緩解;(2)在一年隨訪中,總疾病控制率為76.2%,其中Barcelona分期(Barcelona clinic liver cancer, BCLC)A期患者中疾病控制率為100%, 病情穩定(stable disease, SD)10例;BCLC B期患者中疾病控制率為60%,部分緩解(partial response, PR)1例,SD 2例;BCLC C期患者中疾病控制率為50%,完全緩解(complete response, CR)1例,PR 2例;(3)患者治療後24 h外周血NK細胞和CD8+T細胞頻率較治療前顯著降低,CD4+T細胞頻率和CD4/CD8較治療前顯著上升。

結論:同種異體NK細胞治療原發性肝細胞癌有很好的安全性和有效性。

Keywords: NK細胞, 肝細胞癌, 同種異體, 外周免疫

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)目前是全球惡性腫瘤相關死亡的第三大原因,NK細胞是天然免疫的重要組成部分,在清除病毒感染的細胞和腫瘤細胞中起關鍵作用。在慢性肝炎發展為肝癌的過程中,NK細胞功能缺陷與疾病進展密切相關,同時也是造成腫瘤細胞免疫逃逸的重要原因^[1]。與正常肝組織相比,肝細胞癌患者瘤內NK細胞數量降低、細胞亞群分佈改變,識別和殺傷肝癌細胞的功能降低^[2,3]。近期研究表明,自體NK細胞治療在多種實體瘤的治療中可以提高外周迴圈中NK細胞的活性和數量,但由於很難遷移到腫瘤部位發揮功能,臨床療效有限^[4,5]。同種異體NK細胞治療近年來被廣泛應用於各種臨床試驗。殺傷細胞免疫球蛋白樣受體(killer cell immunoglobulin-like receptor, KIR)不匹配可以抑制自體組織相容性複合體(major histocompatibility conplex, MHC)分子的負向調控信號,保證足夠的NK細胞活化。在急性髓系白血病(acute myelocytic leukemia, AML)患者中,來自KIR不匹配供體的NK細胞過繼回輸可顯著降低造血幹細胞移植後的復發率^[6]。本研究以患者的健康直系血親為供者,分離外周血單個核細胞並進行NK細胞的體外培養,在培養後的第14、15天,分2次回輸給患者,通過對患者進行隨訪,同時評估同種異體NK細胞治療的安全性和有效性。

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1. 資料與方法

1.1. 研究物件

選擇2016年4月至2017年10月在解放軍總醫院第五醫學中心收治的HCC患者。

患者納入標準:(1)年齡16~65歲的男性或女性患者;(2)按照《原發性肝癌診療標準(2015年版)》, 患者經病理學和影像學確診為原發性肝細胞癌;肝功能Child-Pugh A/B級 (5~9分),美國東部腫瘤協作組評分標準(eastern cooperative oncology group score standard, ECOG)評分≤ 2分;(3)血小板計數>60×10⁹ /L;血紅蛋白>80 g/L;凝血:國際標準化比率(international normalized ratio, INR)<2.3,或者凝血時間延長<6 s;血清白蛋白>28 g/L,總膽紅素<51 mmol/L,穀丙/穀草轉氨酶<5倍正常值上限;(4)合併乙肝患者進行抗病毒治療,合併丙肝患者服用直接抗病毒(direct-acting antiviral agents, DAA)藥物治療。供者入組標準:(1)年齡18~40 歲的男性或女性且為患者直系血親;(2)理解並簽署知情同意書,且遵循自願、無償的原則;(3)排除糖尿病、高血壓、心臟病等慢性疾病,全身無其他重大器質性疾病和傳染性疾病;(4)沒有精神障礙,具有完全的行為能力。

患者排除標準:(1)妊娠或哺乳期婦女;(2)器官移植後患者;(3)2 周內進行過介入微創治療術或者1 個月內進行過切除手術的患者;(4)合併甲型肝炎、戊型肝炎、愛滋病等感染者,或有其他傳染性疾病;(5)合併其他嚴重的全身性疾病和精神病患者;(6)篩選前30 d內發生過急性感染、消化道出血等嚴重併發症;(7)半年內進行過其他生物治療,包括細胞因數誘導的殺傷細胞(cytokine-induced killer cells, CIK)、樹突狀細胞(dendritic cells,DCs)、嵌合抗原受體T細胞(chimeric antigen receptor T-cells, CAR-T)、程式性死亡受體1(programmed cell death protein 1, PD-1)和其他免疫治療的患者。

共入組HCC患者21例,其中男性18例,女性3例,基線資料見表1。本項臨床研究通過中國人民解放軍第三零二醫院醫學倫理委員會審查批准,所有入組患者和供者均理解並簽署知情同意書。

1

患者的人口學和基線特徵

Demographic and baseline characteristics of the patients

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1.2. 細胞製備及質控

包被:取NK細胞啟動劑2 mL至175 cm²培養瓶中,加入20 mL生理鹽水充分混勻並置於4 ℃冰箱過夜。

外周血單核細胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)分離:採集供者外周血50~80 mL,通過Ficoll-Hypaque密度梯度離心,800 ×g,25 min;收集上層血漿並於56 ℃滅活30 min;收集單核細胞層細胞,加入生理鹽水重懸,300 ×g,10 min洗滌2次。

細胞培養:用10 mL生理鹽水沖洗包被的培養瓶,將PBMC重懸於NK細胞活化培養基中,使其密度為1×10⁶/mL,分別按照終濃度為50 μg/L、1 000 IU/mL和2.5%分別加入重組人IL-15、重組人IL-2和滅活血漿,混勻後接種于包被培養瓶中;置於37 ℃,5% CO₂飽和濕度培養箱中培養72 h;觀察細胞生長狀況並加入擴增培養基,調節細胞密度至5×10⁵~8×10⁵/mL,按照初始培養濃度加入細胞因數和滅活血漿,每2~3天傳代1次。

細胞收穫:培養14 d和15 d後,用生理鹽水重量細胞300 ×g,8 min洗滌細胞2次,用含1%(體積分數)注射用人白蛋白的生理鹽水懸浮細胞,經70 μm細胞篩過濾後轉移至輸液袋。

細胞質控:分別于培養第0、7、14天取細胞培養懸液進行品質檢測,質檢內容包括微生物學安全性(細菌、真菌、支原體、內毒素檢測)和生物學活性(細胞活率、NK細胞純度、NK細胞分泌細胞因數水準、NK細胞殺傷功能檢測)。

1.3. 隨訪檢查

首次NK細胞治療開始後4周、8周、12周、24周、36周、48周定期隨訪。隨訪觀察指標包括安全性指標(發熱及其他不適、血常規、肝腎功能、心電圖)和有效性指標(臨床症狀及體征、腫瘤標誌物水準、生物化學指標、影像學指標、免疫學指標及生活品質評價)。

1.4. 統計學分析

採用SPSS 19.0統計軟體,統計結果用 x±s表示。採用配對t檢驗比較NK細胞治療前後臨床及實驗室檢查結果,P<0.05認為差異有統計學意義。

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2. 結果

2.1. 同種異體NK細胞治療安全性評價

21例患者中,10例患者治療1療程,5例患者治療2療程,5例患者治療3療程。所有患者未見噁心、嘔吐、感染、過敏、昏迷、急性和慢性移植物抗宿主反應(graft-versus-host disease, GVHD)。10例患者在細胞輸注後24 h內出現短暫發熱反應,其中9例患者體溫為37.3~38.5 ℃,1例患者體溫為38.5~39.5 ℃。1例患者接受NK細胞治療12 h後出現輕微肝痛,1例患者出現輕微頭痛。以上所有患者的症狀均在8 h內自然緩解,無需治療。結果表明,該劑量的NK細胞治療不超過患者的耐受限度。

在1年的隨訪中,同種異體NK細胞治療後3個月內患者淋巴細胞數量逐漸減少,但差異無統計學意義。治療3個月後淋巴細胞計數恢復至治療前水準,6個月後淋巴細胞計數高於基線,然後緩慢恢復到原水準。中性粒細胞和血小板水準無明顯變化。治療後患者谷丙轉氨酶(alanine aminotransferase, ALT)、穀草轉氨酶(aspartate aminotransferase, AST)、總膽紅素(total bilirubin, TBil)、白蛋白(albumin, ALB)均在正常範圍內波動,與基線比較差異無統計學意義,甲胎蛋白(alpha fetoprotein, AFP)水準較NK細胞治療前顯著降低。

2.2. 同種異體NK細胞治療療效評價

按照實體瘤療效評價(response evaluation criteria in solid tumors, RECIST)1.1標準^[7], 21例同種異體NK細胞治療的HCC患者1年隨訪中,1例(4%)完全緩解,3例(12%)部分緩解,12例(52%)病情穩定。所有患者的總疾病控制率為76.2%(表2),其中BCLC(Barcelona clinic liver cancer) A期患者中疾病控制率為100%, SD 10例;BCLC B期患者中疾病控制率為60%,部分緩解(partial response, PR) 1例,SD 2例;BCLC C期患者中疾病控制率為50%,完全緩解(complete response, CR) 1例,PR 2例。截至2019年5月,接受同種異體NK細胞治療的21例患者中有5例死亡。死亡患者中BCLC C期患者3例,存活時間分別為3個月、4個月和4個月;BCLC B期患者2例,存活時間分別為4個月後、10個月。

2

NK細胞治療療效評價

Summary of efficacy measures

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2.3. 同種異體NK細胞治療後外周免疫變化

同種異體NK細胞過繼回輸後24 h,患者CD4+ T細胞的頻率和CD4/CD8比值較基線顯著升高(圖1),而NK細胞和CD8+ T細胞的頻率較基線顯著下降,B細胞頻率較治療前差異無統計學意義。考慮到所培養的NK細胞和患者PBMC存在互相殺傷的可能,分別以患者PBMC和供者培養後的NK細胞為靶細胞進行單向混合淋巴細胞培養,發現無論是否加入IL-2,供者培養後的NK細胞對患者PBMC均無殺傷作用,但具有正常殺傷腫瘤細胞系的能力。

1

NK細胞治療24 h後患者外周血淋巴細胞亞群變化

Changes in the proportion of lymphocyte subsets 24 h after treatment

*P<0.05, ☆P<0.001.

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3. 討論

早期的基礎研究顯示,在造血幹細胞移植和骨髓移植過程中CD56(bright) NK細胞的百分比與GVHD的發生密切相關,當移植物中CD56(bright) NK細胞超過3%時,GVHD發生的概率接近於零^[8,9,10]。本實驗培養NK細胞的中位元頻率為80%,遠遠超過造血幹細胞移植和骨髓移植中CD56(bright) NK細胞的頻率,但在本試驗研究的1年隨訪過程中,研究沒有觀察到急性和慢性GVHD的發生,提示同種異體NK細胞在原發肝癌的臨床應用中有很好的安全性。本研究結果顯示,疾病控制率與同種異體NK細胞治療的療程有關,治療的療程數越多,疾病控制率越高,提示異體NK細胞在患者體內存在半衰期,多次治療可能會提高治療療效,但由於本臨床試驗樣本量較小,難以控制和調整混雜因素,這一結果還需要通過大樣本臨床試驗進一步驗證。

本研究檢測了同種異體NK細胞過繼輸注後HCC患者外周血淋巴亞群的變化,發現雖然短期內輸入了了大量的外源性NK細胞,但患者外周血中NK細胞的數量和頻率仍然低於治療前水準。同種異體NK細胞輸注後患者外周血CD8 T細胞和NK細胞數量在24 h內降至最低,B細胞在48 h內降至最低,1周後逐漸恢復至正常水準,這一結果與Qin等^[11]的報導相反。本研究將培養的NK細胞與未處理的HCC患者PBMC體外共培養24 h,未觀察到培養的NK細胞對患者PBMC的殺傷作用,也未觀察到患者PBMC對培養NK細胞的殺傷作用,這一結果可能與Miller等^[12]報導的單倍體NK細胞過繼回輸後異體NK細胞在患者體內嵌合現象有關。本研究推測,大劑量同種異體CD56(bright) NK細胞過繼輸注後,可能通過分泌細胞因數啟動患者的自然免疫和特異性免疫,誘導患者特異性CD8+T細胞和NK細胞向腫瘤部位遷移,改變腫瘤局部微環境並殺傷腫瘤細胞。

本研究6例晚期肝癌患者1例治療後完全緩解,回顧分析發現該患者在接收同種異體NK細胞治療同時也接受索拉非尼治療,提示同種異體NK細胞聯合索拉非尼可能會延長患者的生存時間。索拉非尼是晚期HCC的靶向治療藥物,據Llovet等^[13]在N Engl J Med報導,索拉非尼可使晚期HCC患者的中位生存期延長近3個月,但在299例單用索拉非尼治療的患者中,沒有一例患者達到CR。回顧2012—2018年在解放軍總醫院第五醫學中心感染性疾病診療與研究中心接受索拉非尼治療的患者,也沒有發現CR病例。此外,索拉非尼的副作用和耐藥性仍然存在,這極大地限制了索拉非尼的臨床應用。既往研究表明^[14,15],索拉非尼可觸發腫瘤相關巨噬細胞(tumor-associated macrophage, TAM)的促炎活性,繼而誘導抗腫瘤NK細胞反應,提示NK細胞治療聯合索拉非尼可使患者獲得更好的臨床療效。在研究3例同種異體NK細胞聯合索拉非尼患者的總生存時間分別為16個月、19個月、32個月,均存活到2019年5月,遠遠超過報導的10.3個月,提示同種異體NK細胞聯合索拉菲尼在晚期肝癌的治療中可能具有巨大的潛力。

綜上所述,同種異體NK細胞治療HCC有很好的安全性和有效性,對延長患者生存時間、提高生活品質可能具有良好的治療前景。但仍需要進一步通過大樣本、多中心、隨機對照研究評估同種異體NK細胞聯合索拉菲尼治療晚期肝癌的療效。

(本文編輯:王蕾)

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Biography

王福生,中國科學院院士,教授,主任醫師,博士生導師。國家傑出青年基金獲得者,國家自然科學基金創新研究群體牽頭人,國家感染性疾病臨床醫學研究中心牽頭人,解放軍總醫院第五醫學中心感染病診療與研究中心主任。擅長病毒性肝炎、愛滋病和疑難危重肝病的臨床診治工作,並結合臨床難題開展研究,系統地揭示了乙型肝炎臨床免疫學特徵及肝臟損傷機制,提出了優化慢性乙肝抗病毒治療與免疫應答恢復的“爬坡假說”,闡明了愛滋病免疫重建失敗的關鍵機制,開拓了疑難肝病和愛滋病細胞治療與研究的新方向。曾先後主持多項國家重大科研項目,以通信作者在N Engl J Med、Gastroenterology、Hepatology、Blood等期刊發表論文160餘篇,獲得國家科技進步獎二等獎3項、省部級獎一等獎3項。

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Funding Statement

國家自然科學基金(81721002,81571567)

Supported by the National Natural Science Foundation of China(81721002,81571567)

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導讀：NK細胞的細胞毒性在很大程度上取決於IgG Fc受體CD16a，其介導抗體依賴性細胞介導的細胞毒性（ADCC）。高親和力和不可切割的CD16（hnCD16）被開發並顯示出多腫瘤殺傷潛力。然而，hnCD16受體啟動單個CD16信號並提供有限的腫瘤抑制。如何利用hnCD16的特性並摻入NK細胞特異性活化結構域是進一步提高NK細胞抗腫瘤活性的有前景的發展方向。

6月14日，北京大學基礎醫學院李揚副教授和北京大學人民醫院趙翔宇教授合作在《Journal of Hematology&Oncology》雜誌線上發表題為“Leveraging CD16 Fusion Receptors to Remodel the Immune Response for Enhancing Anti-Tumor Immunotherapy in iPSC-Derived NK Cells”的研究論文，揭示了該融合受體通過重塑免疫應答以增強NK細胞抗腫瘤功能的機制，並將hnCD16FR在誘導多能幹細胞來源NK細胞（hnCD16FR-iPSC-NK）中進行工程化修飾，證明瞭hnCD16FR-iPSC-NK細胞具有良好的應用前景，可以為以NK細胞為基礎的抗腫瘤免疫療法提供新的策略和選擇。

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC10265820/

研究背景

使用工程免疫效應細胞的過繼細胞療法已成為治療血液學和實體惡性腫瘤的一種很有前途的新方法。在幾種免疫效應物的選擇中，自然殺傷（NK）細胞被證明在對惡性細胞和病毒感染的先天免疫應答中起關鍵作用。特別是嵌合抗原受體（CAR）工程的NK細胞由於其獨特的生物學特性而最近引起了相當大的關注 。與T細胞不同，NK細胞缺乏表面T細胞受體（TCR），不會引起移植物抗宿主病（GvHD），這是同種異體NK細胞療法的關鍵優勢，可實現工程化NK細胞的規模化製造和現成給藥用於癌症免疫治療。評估同種異體NK細胞過繼轉移的臨床試驗表明，這種療法是安全的，幾乎沒有證據表明細胞因數釋放綜合征（CRS）或神經毒性等毒性。此外，自體CAR-T細胞治療在移植後可以持續多年，而同種異體NK細胞通常在宿主中存活的時間較短。同種異體NK細胞的這種特性可能有助於更準確的給藥策略，允許多次組合給藥，並避免長期累積毒性，這在接受CAR-T治療的患者中很常見。

用於癌症免疫治療的NK細胞的來源多種多樣，即外周血來源的NK（PB-NK）細胞，臍帶血分離NK（UCB-NK）細胞和NK細胞系。PB-NK和UCB-NK過繼細胞療法在治療各種血液系統癌症方面取得了許多成功。然而，PB-NK細胞和UCB-NK細胞的NK細胞產量和亞群組成對供體的依賴性極強，因為這些細胞通常不是來自單一的可再生資源，使得產品標準化和多劑量策略變得困難。此外，原代NK細胞的遺傳修飾效率低，但變化很大，這使得難以利用一致且可重複的工程NK細胞療法。

研究進展

在我們的初步研究中篩選了三種不同的融合受體構建體，並測試了它們對NK細胞功能的啟動作用。所有融合受體均基於CD16a變體設計，可增加FcγRIIIa對抗體Fc片段（F158V）的親和力並抵抗ADAM17介導的切割（S197P），並針對增強NK細胞的活性進行了優化。我們設計了NK細胞特異性hnCD16融合受體構建體，其由信號肽，hnCD16的細胞外和跨膜結構域，通常在NK細胞中表達的細胞內1或2共刺激結構域（CD）以及刺激結構域（SD）CD3ζ或FcεRIγ組成。CD16a的細胞質尾部沒有任何ITAM結構域，因此需要含有ITAM結構域CD3ζ和FcεRIγ的細胞內鏈串聯的幫助，它們都與CD16a相關。

為了驗證hnCD16FR與不同的治療性mAb聯合使用可以有效殺死表達不同腫瘤相關抗原的癌細胞，我們使用表達三種hnCD16FR構建體中每種的NK細胞對肺癌細胞系A549進行了ADCC測定。與殺死Raji細胞的結果類似，FR1（hnCD16-2B4-DAP10-CD3ζ）構建體對A549細胞的ADCC作用優於其他構建體。FR2（hnCD16-DAP10-CD3ζ）和FR3（hnCD16-2B4-FcεRIγ） 構建介導的與hnCD16構建體相當的A549細胞殺傷。

我們的資料表明，與先前報導的hnCD16構建體相比，hnCD16與2B4-DAP10-CD3ζ的組合融合促進了ADCC功能的啟動，以增強抗體誘導的NK細胞介導的抗原依賴性抗腫瘤細胞毒性。

研究結果

在本研究中，我們篩選了殺死B細胞淋巴瘤的最有效組合，B細胞淋巴瘤與hnCD16a的外域，NK特異性共刺激劑（2B4和DAP10）和細胞質結構域中的CD3ζ融合在一起。篩選的構建體在NK細胞系和iNK細胞中顯示出優異的細胞毒性作用和敏銳的多種細胞因數釋放。hnCD16-和hnCD16FR轉導NK細胞的轉錄組學分析和驗證結果顯示，hnCD16FR轉導重塑了NK細胞中的免疫相關轉錄組，其中與hnCD16轉導相比，強調了與細胞毒性、高細胞因數釋放、誘導腫瘤細胞凋亡和ADCC相關的基因的顯著上調。體內異種移植研究表明，工程化hnCD16FR iPSC來源的NK細胞的單一低劑量方案與抗CD20 mAb治療共同給藥可介導有效的活性並顯著提高存活率。

總之，我們開發了一種新型hnCD16FR構建體，其表現出比報導的hnCD16更有效的細胞毒性，這是一種有前途的治療惡性腫瘤的方法，具有改善的ADCC特性。我們還為NK啟動結構域提供了基本原理，該啟動域重塑免疫反應以增強NK細胞中的CD16信號傳導。

參考資料：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC10265820/

2023年6月14日，北京大學基礎醫學院李揚副教授和北京大學人民醫院趙翔宇教授合作在Journal of Hematology & Oncology （(IF=23.168)）雜誌線上發表題為“Leveraging CD16 Fusion Receptors to Remodel the Immune Response for Enhancing Anti-Tumor Immunotherapy in iPSC-Derived NK Cells”（利用CD16融合蛋白重塑免疫應答以增強iPSC衍生NK細胞抗腫瘤免疫療法）的研究成果。本研究開發了一種新型hnCD16融合受體（high-affinity non-cleavable CD16 fusion receptor，hnCD16FR），該融合受體由hnCD16的胞外域、NK細胞特異性共刺激因數（2B4和DAP10）和CD3ζ構成的胞內段，它在體外和體內實驗中均表現出顯著增強的抗體依賴性細胞毒性，並初步揭示了該融合受體通過重塑免疫應答以增強NK細胞抗腫瘤功能的機制，並將hnCD16FR在誘導多能幹細胞來源NK細胞（hnCD16FR-iPSC-NK）中進行工程化修飾，證明了hnCD16FR-iPSC-NK細胞具有良好的應用前景，可以為以NK細胞為基礎的抗腫瘤免疫療法提供新的策略和選擇。

近年來，由於NK細胞相比於T細胞具有更好的治療安全性，更多的受體啟動機制，同時可以允許生產現貨型的產品的特點，使得其在過繼性細胞治療領域取得了廣泛的關注。目前開發出以誘導多能幹細胞（induced pluripotent stem cell, iPSC）為基礎的NK細胞生產方法已經可以用於臨床級的規模化生產，並用於癌症的免疫治療。當前，免疫療法正處於從基礎研究向轉化醫學邁進的時代，這催生了許多創新性免疫治療策略，其中一種重要的治療手段是通過使用治療型抗體來誘導抗體依賴性細胞介導的細胞毒性（ADCC）來靶向腫瘤並啟動NK細胞功能。

NK細胞的ADCC效應取決於在其膜表面表達的IgG受體CD16。最近的研究中開發了具有高親和力和不可剪切特性的CD16（hnCD16），並證明了其具有對多種腫瘤的殺傷潛力。然而，hnCD16受體只能啟動單一的CD16信號並提供有限的腫瘤抑制效果。由此，設計一種可以利用抗體療法優勢，並且能夠靶向多種腫瘤抗原的基於hnCD16的融合信號受體，使其在保留多抗原靶向性特點的基礎上，可以同時擴展抗腫瘤信號啟動是進一步提高NK細胞抗腫瘤活性的一個有前景的發展方向。

在本研究中，首先利用NK細胞系在體外篩選出可以介導最有效ADCC抗腫瘤活性的融合受體結構，該融合受體由hnCD16的胞外域、NK細胞特異性共刺激因數（2B4和DAP10）和CD3ζ構成的胞內段組成（圖1）。

圖1. 融合受體結構示意圖與抗B細胞淋巴瘤、肺癌細胞殺傷效果

進一步通過轉錄組學分析表明，hnCD16FR的表達重塑了NK細胞中的免疫相關轉錄組，與hnCD16相比hnCD16FR工程化的NK細胞與細胞毒性、細胞因數產生、誘導腫瘤細胞凋亡和ADCC作用相關的基因都發生了顯著上調。細胞因數釋放實驗證實了hnCD16FR工程化可以 介導NK功能相關細胞因數的大量釋放（圖2）。

圖2. hnCD16FR重塑了NK細胞中的免疫相關轉錄組並介導NK功能相關細胞因數的大量釋放

將篩選出的hnCD16FR在 iPSC 中進行工程化修飾，並將其分化為hnCD16FR-iNK（induced NK）細胞進行腫瘤免疫細胞治療。與NK細胞系得到結果一致，與對照相比，hnCD16FR-iNK表現出顯著的細胞因數釋放和體外ADCC抗腫瘤活性（圖3）。

圖3. hnCD16FR-iPSC其衍生NK細胞的體外抗腫瘤活性

最後，在小鼠B細胞淋巴瘤異種移植動物模型中進一步驗證hnCD16FR-iPSC衍生NK細胞體內的ADCC抗腫瘤功能。研究結果顯示，工程化修飾的hnCD16FR-iPSC衍生NK細胞的單次、低劑量注射方案與抗CD20 mAb的聯合治療策略，可以有效介導ADCC抗腫瘤活性並顯著延長生存期（圖4）。

圖4:在腫瘤異種移植模型中hnCD16FR-iNK細胞聯合治療的抗腫瘤效果。

綜上所述，本研究設計並篩選了由NK細胞啟動結構域構成的hnCD16融合受體，並使用iPSC平臺在體外構建了均質表達hnCD16FR的iNK細胞，這些hnCD16FR-iNK細胞可以與治療型mAb聯用以觸發有效的ADCC效應並產生多種細胞因數以響應抗腫瘤免疫。同時這些經過hnCD16FR工程化的iNK細胞與抗體聯合使用可以在體內介導有效的腫瘤控制。這項研究將有助於擴展iPSC-NK細胞在腫瘤免疫治療領域的應用前景。

北京大學基礎醫學院碩士研究生孟繁一為該文章的第一作者，北京大學基礎醫學院李揚副教授、北京大學人民醫院趙翔宇教授、北京大學基礎醫學院周士新副教授為共同通訊作者。該研究得到國家重點研發計畫、國家自然科學基金、瑞臻再生醫學研究基金、北大醫學交叉研究種子基金的資助。

原文連結：https://jhoonline.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13045-023-01455-z

科技共同撰寫的《2023年港股18A生物科技行業發展白皮書》正式發佈。《白皮書》基於已上市和擬上市的生物科技企業，從公司全景、行業分析、發行資料、指數分析、公司研究等不同維度勾勒生物科技行業發展全貌。《白皮書》認為，生物製藥、醫療器械及前沿科技賽道仍被看好。根據研究，生物製藥賽道可能是未來3-5年內資金追逐的戰場，同時，醫療器械賽道受產品國產化率的提升、技術的進步、滲透率增加及中國不斷加大政策支持等主要驅動因素的推動，“18A”生物科技公司將受益於行業大趨勢發展，未來可期。

Part 1 全景掃描：生物科技市場回暖，發展空間廣闊

《白皮書》顯示，恒生香港上市生物科技指數覆蓋港股上市的生物科技領域細分行業優質龍頭，分享生物科技長期發展紅利。2022年10月以來，受集采預期溫和、財政貼息政策、全球美元資產再平衡，一級市場投融資資料環比逐步向好、海外超預期加息終結等因素催化，港股生物科技市場迎來估值修復行情。截至2022年12月31日，恒生香港上市生物科技指數的歷史市銷率PS(TTM)在經過1年多的時間深度調整消化估值，釋放風險，其市銷率PS(TTM)僅為1.6倍，處於2020年以來36.6%低點分位，估值處於相對低位，具有較高吸引力。中國生物科技行業作為國內醫藥政策紅利和巨大未滿足的臨床需求的最直接受益者，其發展空間廣闊。

Part 2 行業分析：上市規則實施5年，生物科技板塊多元發展

自2018年香港交易所(295.4, -6.00, -1.99%)推行18A上市規則以來，香港成為越來越多生物科技企業上市的首選地，截止至2022年12月31日，共有64家企業通過18A規則遞表或上市，包括56家已上市公司，8家遞表公司，其中6家公司已摘B。企業分佈於製藥、醫療器械、前沿科技，其中製藥行業共有45家企業，醫療器械17家，前沿科技2家。其中，已摘B企業的6家企業均為製藥企業，在腫瘤和自免細分賽道分佈最多。

製藥是主要賽道，專注新藥研發生產商業化業務。截止至2022年12月31日，共45家企業，占18A企業總數70.3%，包含已上市40家、已遞表5家，其中6家上市企業已摘B。隨著全球製藥市場的發展，在經濟增長和(48.05, -0.10, -0.21%)中國對醫藥健康需求的帶動下，2021年中國製藥行業市場規模為15,912億元，預計整體以6.7%年複合增速增長，2025年市場規模預計擴張至20,645億元。從細分行業市場特點來看，全球增速最快的是細胞免疫治療行業，預計2021-2025年全球細胞免疫治療行業市場規模年複合增長率達47.5%;行業體量最高的為腫瘤藥物行業，2021年全球腫瘤藥物市場規模為1,817億美元。中國增速最快的也是細胞免疫治療行業，預計2021-2025年中國細胞免疫治療行業市場規模年複合增長率達87.9%。

醫療器械賽道主要專注於血管介入、神經外科、非血管介入、糖尿病、診療設備、分子診斷等領域，其中血管介入領域是企業佈局最大的子行業，共有10家，其中上市企業9家。2015-2020年，中國醫療器械市場複合增速為19.3%，預計2020-2024年會保持13.9%年複合增速增長。

前沿科技以AI醫療影像和手術機器人行業為主，中國AI診療設備市場規模由2019年的1.2億元大幅增加至2020年的2.9億元，預計2030年將增加至755.7億元。隨著醫療AI第一股鷹瞳科技上市，標誌著AI+醫療行業隨著人工智慧技術的發展將加速發展。

《白皮書》認為，生物製藥、醫療器械及前沿科技賽道仍被看好。根據研究，生物製藥賽道可能是未來3-5年內資金追逐的戰場，同時，醫療器械賽道受產品國產化率的提升、技術的進步、滲透率增加及中國不斷加大政策支持等主要驅動因素的推動，“18A”生物科技公司將受益於行業大趨勢發展，未來可期。全球新冠疫情的爆發加速了新興醫療子行業的發展，受醫療保健需求激增、AI賦能優勢認知增加、有利的政策等主要驅動因素所推動，越來越多前沿科技企業赴港上市。受益于香港資本市場的創新扶持制度，18A企業擁有更通暢的上市路徑，並可獲得更多的資金扶持，促進自身產品和技術的國際化和全球化。在巨大的未被填補的臨床需求下，我們關注到PD-1/L1、CAR-T、ADC、mRNA、基因編輯等不斷湧現的新興技術所展現的巨大潛力，也會有更多的18A企業脫穎而出。未來，在政策、資本及技術的多項推動因素下，18A生物科技行業未來可期。

Part 3 發行資料：18A公司IPO募資額超千億

2018年港交所推出《上市規則》第18A章後，香港成為18A公司重要的融資中心，18A公司的從遞表到上市的週期較非18A公司普遍縮短。資料顯示，截至2022年12月31日，已上市的18A公司共有 56家，累計募集資金總額超過千億港元，累計發行總市值超過7,000億港元。平均募集資金約19億港元，募集資金最多的百濟神州(110.5, 1.50, 1.38%)約70.85億港元。

據LiveReport大資料，已上市18A公司普遍在上市前已經進行了較為頻繁的融資，上市前融資輪次為2-6輪的有46家，占比85%;上市前融資輪次最多的公司高達12輪;大部分公司的估值較首輪融資增長突出，且過半18A公司的發行估值較最後一輪溢價50%以上。

基石投資者方面，已上市的56家18A公司中，有51家公司有基石參與，其共計158位基石投資者，總持倉市值占56家18A公司全球發售市值的40.82%。而參投家數前三的基石投資者均為知名的投資機構，其分別為奧博參投17家，清池資本參投15家，高瓴資本參投13家等;但從參投金額來看，GIC集團位居第一，共計參投超28億港元，其次高瓴參投超24億港元。仲介機構方面，高盛、摩根士丹利和中金公司(13.36, 0.04, 0.30%)是參與18A公司發行最多的保薦人，說明頭部大行在生物科技行業內專案資源很強。沙利文在行業顧問的佔有率排名第一，參與了46家18A公司的發行，占比高達82.14%。18A發行的核數師及申報會計師主要為四大會計師事務所，安永占比四成。律所方面，擔任發行人律師的律所分佈比較均勻，邁普達、通商、美邁斯參與較多。

Part 4 指數及未來展望：18A仍是港股IPO市場的重要組成部分

為刻畫18A生物科技板塊的整體運行表現，捷利交易寶編制了沙利文捷利生物科技指數系列，包括沙利文捷利生物科技精選30和沙利文捷利生物科技綜合。

沙利文捷利生物科技綜合於2022年新增8只成分股，目前共有56只成分股。截至2022年12月31日，生物科技綜合指數的成分股合計市值約7000億港元，前十大權重股合計約4700億港元，占比約七成;其中，市值前三的成分股百濟神州、君實生物(22.7, 0.80, 3.65%)、信達生物(30.6, 0.15, 0.49%)均已實現摘B。

自2018年12月31日至2022年12月31日，生物精選指數錄得累計收益率33.7%，生物綜合指數錄得累計收益率12.8%，同期恒生指數(18824.24, -65.73, -0.35%)錄得虧損，累計收益率為-23.5%。可見，港股18A經歷過探索期、狂熱期、調整期之後，整體市場表現仍然強於大盤。

18A公司發行受全球宏觀經濟、港股新股市場冷熱、生物醫藥板塊冷暖影響。2018-2022年18A公司的發行家數分別為5家、9家、14家、20家、8家。2021年上市家數最多，2022年因新股市場遇冷，上市家數出現回落。我們相信18A未來仍然是港股IPO市場的重要組成部分。