最近，上海長征醫院輸血科、上海交通大學免疫研究所等單位合作在《Frontiers in Immunology》上發文，首次從資料層面證實了自體NK細胞輸注能顯著緩解T細胞衰老、衰竭，抑制關鍵成分SASP(衰老相關分泌表型）的有效方法，特別是針對免疫系統，衰老可以通過NK細胞輸注讓其向更年輕的方向發展。

該研究合作招募了37名中年健康參與者，其中32名靜脈注射擴增的NK細胞，5名靜脈注射生理鹽水。

然後使用流式細胞術檢測輸注後4周內外周血衰老和衰竭T細胞比例的變化，以及血清中衰老相關分泌表型相關因數(SASP)的水準。體外共培養實驗研究了NK細胞介導對衰老或衰竭T細胞的細胞毒活性。

• 結果顯示在NK細胞輸注後，代表衰老細胞的 CD28-, CD57+, CD28-CD57+, CD28-KLRG1+ CD4+ 和CD8+T-cell 數量顯著降低，PD-1+和TIM-3+t細胞也是如此。該變化被連續觀察了4周，同時在生理鹽水組中沒有觀察到顯著的變化。
• 此外，SASP相關因數包括IL-6、IL-8、IL-1α、IL-17、MIP-1α、MIP-1β和MMP1在NK細胞輸注後顯著降低。
• 進一步的共培養分析表明，擴增的NK細胞特異性地消除了 CD4+ T cells 而非 CD28+CD4+ T cells。它們還表現出改善的細胞毒性活性。

 

最終研究表明，T細胞衰老和衰竭在健康個體中是可逆的過程，可以引入自體NK細胞給藥來緩解衰老。
自體NK細胞輸注的安全性

施用NK細胞後，所有受試者的體溫和血壓都正常。沒有人出現皮疹、局部感染和出血、發熱、寒戰、呼吸困難、噁心和嘔吐。然而，一名受試者在細胞輸注後1周內出現失眠，之後康復。一個受試者在細胞輸注後1周內出現頭暈，這種現象持續了2周才恢復。兩名受試者出現疲勞，其中一名出現輕度疲勞，另一名出現中度疲勞，兩人都在2周內恢復。此外，在細胞輸注後1個月，進行了常規血液檢查、血液學檢查以及尿液和病毒學檢查。根據ALT、AST、尿素和肌酐的正常血清水準，未觀察到肝毒性和腎毒性。此外，沒有觀察到異常的C反應蛋白(CRP)、抗甲狀腺球蛋白抗體(TGAb)和抗甲狀腺過氧化物酶自身抗體(TPOAb)活性，表明沒有發生免疫反應和自身免疫效應。此外，1個月後沒有觀察到甲胎蛋白(AFP)和癌胚抗原(CEA)的血漿水準增加，有力地證實了自體NK細胞輸注在致瘤性方面是安全的。

NK細胞輸注後衰老T細胞減少

研究結果顯示，NK細胞輸注後1周和4周，表現為CD28-、KLRG1+的CD4+ T細胞和CD8+ T細胞顯著減少。這代表T細胞衰老指標顯著得到改善。

細胞輸注後，衰老T細胞減少NK細胞輸注緩解T細胞衰竭狀態研究結果表明，NK細胞輸注可以通過緩解T細胞的衰竭狀態來改善T細胞的功能。

在NK細胞輸注後1周和4周得到的PD-1和TIM-3 T細胞的百分比，顯示衰竭T細胞減少 NK細胞輸注後關鍵SASP相關因數減少衰老細胞隨著年齡的增長而積累並導致 SASP 相關因數的釋放，包括促炎細胞因數（IL-1α、IL-17 和 IL-6）、趨化因數（IL-8）和蛋白酶（MMP-1、MMP-1α 和 MMP-1β）。研究結果表明，NK細胞輸注顯著降低了包括IL-6、IL-8、IL-1α、IL-17、MIP-1α、MMP-1β以及MMP1在內的SASP相關因數，進一步提示NK細胞輸注能夠有效改善衰老指標。

關鍵衰老相關分泌表型（SASP）成分在NK細胞輸注後減少

 

細胞類型影響NK細胞輸注誘導的效果

為了探索使用冷凍保存後復蘇的NK細胞輸注是否會對誘導效果產生影響，研究人員為32名參與者中的14名志願者輸注冷凍保存後復蘇的PBMC擴增的NK細胞，18名志願者輸注新鮮PBMCs擴增的NK細胞。

最終 統計結果表明，凍存PBMC或新鮮PBMC擴增NK有類似改善T細胞衰竭和衰老的效果。

結論

本研究首次揭示了NK細胞輸注對中年健康個體T細胞功能障礙和細胞衰老的影響。自體NK細胞給藥是一種有效的方法，可以顯著緩解T細胞衰老和衰竭，以及SASP的關鍵成分。至少對於免疫系統來說，衰老可以通過自體NK細胞的輸注，向更年輕的方向發展。

參考文獻：Tang X, Deng B, Zang A, He X, Zhou Y, Wang D, Li D, Dai X, Chen J, Zhang X, Liu Y, Xu Y, Chen J, Zheng W, Zhang L, Gao C, Yang H, Li B, Wang X. Characterization of age-related immune features after autologous NK cell infusion: Protocol for an open-label and randomized controlled trial. Front Immunol. 2022 Sep 29;13:940577. doi: 10.3389/fimmu.2022.940577. PMID: 36248873; PMCID: PMC9562930

 

腫瘤異質性是包括免疫療法在內癌症治療方法面臨的主要挑戰之一。異質性可通過獲得新突變而產生，從而產生抗治療腫瘤亞克隆。此外，癌細胞可以通過改變其細胞狀態來適應治療壓力。因此，我們面臨的任務是如何積極設計免疫療法，防止耐藥腫瘤細胞的選擇。T細胞和自然殺傷（NK）細胞在腫瘤免疫中具有互補作用，這些淋巴細胞群體使用不同的識別策略來識別癌細胞，NK細胞可以殺死逃脫CD8＋T細胞識別的癌細胞。因此T細胞和NK細胞的雙重攻擊為加深免疫治療的影響提供了機會。最近的研究還表明，NK細胞在向腫瘤招募樹突狀細胞中發揮重要作用，從而增強CD8＋T細胞應答的誘導，而T細胞分泌的IL－2啟動NK細胞。

有趣的是，T細胞和NK細胞還共用幾種重要的抑制和啟動受體，這些受體可以作為增強T細胞和NK－細胞免疫作用的靶點。這些抑制性受體配體系統包括CD161－CLEC2D、TIGIT－CD155和NKG2A／CD94－HLA－E。此外，基於抑制和啟動細胞因數的新的治療策略也可以發揮T細胞和NK細胞的協同作用，這些基於T細胞和NK細胞協同作用的療法將深刻影響目前的癌症免疫治療。

T細胞和NK細胞識別腫瘤細胞的分子邏輯

T細胞和NK細胞在腫瘤細胞識別的分子機制上有根本不同。T細胞通過TCR介導的MHC結合肽抗原識別腫瘤細胞。T細胞的所有關鍵功能都在TCR的控制下，包括細胞毒性、細胞因數產生和增殖。因此，腫瘤可以通過下調或丟失MHC－I表達逃避CD8＋T細胞的作用。

相反，NK細胞利用一系列啟動和抑制受體來識別應激和轉化的細胞，如NKG2D、NKp46、NKp30和NKp44受體。與T細胞相比，NK細胞識別腫瘤細胞不依賴於任何唯一的啟動受體，這一事實為識別應激和轉化的細胞提供了更大的靈活性。因此，T細胞和NK細胞對腫瘤細胞施加不同的選擇壓力，為T細胞和NK細胞雙重靶向腫瘤提供了理論依據。

T細胞和NK細胞的共用受體

T細胞和NK細胞從生物學上經常被認為是適應性免疫識別和固有免疫識別的嚴格區分。然而，NK細胞和CD8＋T細胞的受體－配體系統也存在大量重疊。因此，CD8＋T細胞和NK細胞表達的活化和抑制受體提供了使它們參與協同抗腫瘤免疫的機會。

CD161及其配體CLEC2D

CD161受體屬於C型凝集素受體家族，並形成同源二聚體。它最初被鑒定為NK細胞上的一種抑制性受體，其阻斷對表達CLEC2D配體的腫瘤細胞的殺傷。最近，CD161也被確定為腫瘤浸潤T細胞的重要抑制受體。

CLEC2D是一種C型凝集素受體，在幾種人類癌症的腫瘤細胞和浸潤性髓系細胞上表達。CLEC2D在生髮中心B細胞中高水準表達。因此，起源于生髮中心B細胞的B細胞淋巴瘤可以表達高水準的CLEC2D，包括濾泡性淋巴瘤、伯基特淋巴瘤和具有生髮中心B－細胞樣基因表達特徵的彌漫性大B細胞淋巴瘤亞型。在Toll樣受體（TLR）啟動後，DC和B細胞也表達CLEC2D。因此，靶向這種抑制性受體可以增強T細胞和NK細胞的抗腫瘤活性。

NKG2A／CD94及其配體HLA－E

HLA－E是一種非經典MHC Ib分子，與NK細胞和CD8＋T細胞亞群表達的抑制性NKG2A／CD94受體結合。在許多實體瘤中，HLA－E在腫瘤細胞過表達，並且在腫瘤浸潤巨噬細胞和DC上也檢測到這種蛋白的表達。NKG2A／CD94受體由大多數迴圈和腫瘤浸潤的NK細胞組成性表達。雖然只有一小部分血液CD8＋T細胞表達NKG2A／CD94，但其表達會在共表達PD－1和其他抑制性受體的腫瘤浸潤CD8＋T細胞中上調。

CD226受體和抑制性對應受體TIGIT、CD96和PVRIG

CD226受體是NK細胞和CD8＋T細胞表達的重要共刺激受體。這種啟動性受體的主要配體CD155在人類癌細胞中廣泛表達，此外，CD226還與第二配體PVRL2（CD112）結合。有趣的是，啟動CD226受體的活性被三種抑制性受體TIGIT、CD96和PVRIG拮抗。TIGIT和CD96抑制性受體對共有CD155配體的親和力高於CD226，並且可以在配體結合方面勝過CD226。

在這三種抑制性受體中，TIGIT的研究最為廣泛。TIGIT由NK細胞、CD8＋T細胞和調節性T細胞（Tregs）表達。TIGIT在不同實體瘤和淋巴瘤中的腫瘤浸潤CD8＋T細胞高表達。TIGIT也是NK細胞中的一種重要抑制受體，並導致腫瘤中的NK細胞功能障礙。PD－1和TIGIT都抑制CD226，但通過不同的機制：PD－1在CD226的胞質結構域中去磷酸化Tyr－322，而TIGIT在CD155結合方面超過CD226。

CD96和PVRIG受體的研究較少。在小鼠模型中，CD8＋T細胞或NK細胞中CD96受體的失活增強了抗腫瘤免疫，但其在人類細胞中的作用尚不清楚。PVRIG也由T細胞和NK細胞表達，其主要配體是PVRL2。

NKG2D受體及其應激誘導配體

NKG2D受體由人NK細胞、CD8＋T細胞和先天性T細胞（NKT細胞和γδT細胞）表達。啟動後，NKG2D通過銜接蛋白DAP10發出信號，誘導NK細胞、γδT細胞和NKT細胞的穿孔素依賴性細胞裂解；它還為CD8＋T細胞提供共刺激信號。

NKG2D受體識別一組受應激和轉化細胞上調的配體。在人類中，這些配體包括MICA／MICB和ULBP1－6蛋白；在小鼠中，這些配體包括Rae1α–ε、H60a–c和Mult1。這種受體－配體系統對腫瘤免疫很重要，因為這些配體被DNA損傷和cGAS STING信號上調，但很少被健康細胞表達。本質上，NKG2D配體的上調標誌著應激細胞被細胞毒性淋巴細胞清除。NKG2D配體的表達經常在多種實體瘤和血液瘤中檢測到，包括前列腺癌、卵巢癌和乳腺癌以及黑色素瘤和多發性骨髓瘤。

MICA／B的蛋白水解脫落通過顯著降低腫瘤細胞表面上這些刺激性NKG2D配體的密度而導致免疫逃逸。二硫異構酶ERp5參與脫落的啟動：它破壞MICA／Bα3結構域中的結構二硫鍵，使其可通過ADAM－10／17和MMP14進行蛋白水解。脫落MICA與許多人類癌症的疾病進展密切相關，但在健康受試者的血清中未檢測到。

NK細胞－DC細胞－T細胞軸

NK細胞不僅充當細胞毒性效應細胞，還可以將DC細胞招募到實體瘤中，從而形成T細胞介導的腫瘤免疫。傳統DC目前分為兩個主要子集，cDC1和cDC2。通過將凋亡腫瘤細胞的細胞相關抗原呈遞給CD8＋和CD4＋T細胞，cDC1亞群對保護性抗腫瘤免疫至關重要。除了這種傳遞作用外，cDC1還通過招募和啟動腫瘤特異性CD8＋T細胞在腫瘤中發揮關鍵作用。

兩項主要研究表明，NK細胞在向腫瘤募集cDC1中起著關鍵作用。第一項研究表明，NK細胞分泌趨化因數，介導cDC1募集到腫瘤中，特別是XCL1、XCL2和CCL5。這是一個重要的發現，因為cDC1選擇性表達XCL1／2的XCR1趨化因數受體。第二項研究側重於FLT3配體，這是一種調節DC分化和存活的關鍵細胞因數。在NK細胞中檢測到這種重要細胞因數的表達。研究顯示， NK細胞（而不是T細胞）的清除大大減少了cDC1向腫瘤的募集。這些研究證明了腫瘤中NK細胞和T細胞反應之間的重要聯繫：NK細胞募集並支援DC的存活，而DC又對T細胞介導的腫瘤免疫至關重要。

靶向T細胞和NK細胞協同作用的免疫治療方法

癌症疫苗

大多數當前的癌症疫苗都關注肽表位，由於個體之間MHC等位基因的巨大多樣性，需要個性化設計。此外，細胞毒性T細胞施加巨大的選擇壓力，導致MHC－I表達下調或缺失的腫瘤克隆出現。

一種引發T細胞和NK細胞雙重攻擊的疫苗可以防止MHC－I缺陷型腫瘤克隆的出現，因為MHC－I表達的缺失使腫瘤細胞更容易被NK細胞殺死。人類腫瘤通過活化的MICA和MICB配體在腫瘤細胞上的蛋白水解脫落來逃避活化NKG2D受體的識別。靶向參與蛋白水解脫落的MICA／Bα3結構域的癌症疫苗誘導高滴度抗體，可以抑制脫落並增加腫瘤細胞表面MICA／B蛋白的密度。該疫苗誘導多種T細胞和NK細胞群體顯著歸巢小鼠腫瘤。

這種疫苗誘導的抗體在抗腫瘤免疫應答中發揮著重要作用：腫瘤結合的MICA／B抗體增強了DC對CD8＋T細胞的腫瘤抗原交叉呈遞，並通過啟動NK細胞上的CD16－Fc受體增加了NK細胞介導的腫瘤細胞殺傷。

靶向抑制性細胞因數

TGF－β是一種主要的免疫抑制細胞因數，可有效抑制腫瘤內的T細胞和NK細胞功能。TGF－β強烈抑制T細胞增殖和效應器功能。在NK細胞中，TGF－β信號抑制mTOR調節的關鍵代謝程式，從而抑制增殖和細胞毒性。TGF－β還抑制腫瘤浸潤NK細胞的多種活化受體的表達，包括NKG2D受體。

PGE2在免疫抑制中起著重要作用，也與增強癌細胞存活和侵襲性有關。環氧化酶（COX）－1和2是PGE2合成的關鍵酶，在許多人類癌症中經常過表達。通過Ptgs1和Ptgs2基因的失活抑制小鼠黑色素瘤細胞系中PGE2的合成，導致TME從促腫瘤細胞因數（IL－1β和IL－6）向抗腫瘤的細胞因數／趨化因數（IL－12、IFN－γ和CXCL10）轉變。重要的是，CD103＋cDC1在這些Ptgs1／2?／?小鼠的TME中顯著增加，而NK細胞通過分泌XCL1和CCL5在cDC1的募集中發揮核心作用。

工程化刺激性細胞因數

幾種主要的細胞因數同時作用於T細胞和NK細胞，包括IL－2、IL－12、IL－15和IL－18，為增強T細胞和NK細胞功能提供了機會。例如，NKTR－214是一種聚乙二醇形式的IL－2，在一項1期臨床試驗中，NKTR－214單藥治療，26名患者中有14名（53．8％）疾病穩定，迴圈CD4＋T細胞、CD8＋T細胞和NK細胞大量增殖。

同時，IL－15作為治療藥物也在大力開發中，因為它啟動效應T細胞和NK細胞，但不啟動Treg。IL－15對記憶性T細胞的存活很重要，並誘導NK細胞增殖和活化。在一項血液惡性腫瘤復發患者的1期臨床試驗中，IL－15超級激動劑ALT－803在19％的治療患者中誘導了治療反應。與其作用機制一致，ALT－803誘導血液中NK細胞和CD8＋T細胞的顯著增殖，並通過迴圈NK細胞增強活化受體（NKG2D、NKp30）和顆粒酶B的表達。

結合T細胞和NK細胞的聯合療法

對在小鼠模型系統中有效治療腫瘤的聯合療法已經確定了四種藥物的組合，簡稱AIPV，其由抗腫瘤抗體（A）、延長半衰期的IL－2（I）、抗PD－1（P）和肽疫苗（V）組成。該方案可以進一步簡化為單劑量AIP（抗腫瘤抗體、IL－2和PD－1抗體）。

單劑量AIP治療可誘導快速早期反應，NK細胞和巨噬細胞發揮顯著作用，包括促炎性趨化因數和細胞因數的表達上調。腫瘤結合抗體和延長半衰期的IL－2有助於早期NK細胞活化，這使得能夠招募DC和CD8＋T細胞，從而使腫瘤對ICB更敏感。

此外，天然免疫刺激物也提供活化CD8＋T細胞和NK細胞的機會。STING激動劑在小鼠模型中誘導由CD8＋T細胞和NK細胞介導的強大抗腫瘤反應。STING激動劑通過動員T細胞和NK細胞，與IL－2顯示出強烈的協同作用，以對抗MHC－I缺陷和MHC－I陽性小鼠腫瘤。

小結

最近的研究表明，腫瘤中T細胞的生物學與NK細胞的生物學高度相關。NK細胞在T細胞介導的腫瘤免疫中發揮著重要作用，通過招募DC細胞並支持其生存。儘管NK細胞和T細胞屬於免疫系統的固有和適應性分支，但它們也共用重要的活化和抑制受體配體系統，為免疫治療提供了機會。

未來的研究應該著重於調查DC細胞、NK細胞和T細胞在小鼠和人類腫瘤中形成的環境生態位，並確定抑制NK細胞和T細胞募集的分子機制及其在腫瘤中的功能。對人類腫瘤的這些特徵更深入的分子理解可能會發現新的免疫治療靶點，並指導有效參與DC、NK細胞和T細胞的聯合療法的開發。

參考文獻：

1．DesigningCancer Immunotherapies That Engage T Cells and NK Cells． Annu Rev Immunol．2022Nov 29

近年來，細胞治療顯現出巨大的研究潛力和臨床價值。嵌合抗原受體T細胞（CAR-T細胞）治療在血液腫瘤領域已取得重大進展，CD19 CAR-T治療B-ALL完全緩解率高達90％。但CAR-T治療仍面臨諸多挑戰：①自體T細胞質量不足，異體T細胞引起移植物抗宿主病（GVHD）風險；②製備耗時；③細胞因數釋放綜合征（CRS）和免疫效應細胞相關神經毒性綜合征（ICANS）等不良反應；④復發；⑤價格高昂。CAR-自然殺傷（NK）細胞可以在一定程度上彌補CAR-T治療的局限，是最具潛力的新一代CAR細胞治療產品。2020年一項靶向CD19 CAR-NK治療B系腫瘤的臨床研究實現了73％的緩解率和64％的完全緩解率，並且無GVHD、CRS和ICANS發生，首次確定CAR-NK臨床應用的有效性和安全性。本文我們主要對NK細胞生物學特點、CAR-NK作用機制、CAR-NK與CAR-T的比較、血液腫瘤CAR-NK研究現狀、目前的優化措施進行了總結歸納。

一、NK細胞生物學特點

NK細胞屬於大顆粒淋巴細胞，在外周血中占10％～15％，是天然免疫反應的關鍵組分。作為第一道免疫防線，NK細胞可以自發殺傷腫瘤細胞而不需抗原提呈。NK細胞表面有大量的啟動型受體（NKG2D、NKp46、NKp44、NKp30、CD16、2B4、DNAM1等）和抑制性受體（NKG2A、KIRs、TIGIT、CD96、LAG3、TIM3、PD1、KLRG1、CD161等），對靶細胞的耐受或殺傷取決於這兩類受體信號輸入的動態平衡。NK細胞啟動後脫顆粒，釋放多種細胞毒性物質（顆粒酶B、穿孔素、粒溶素），導致靶細胞裂解。

NK細胞表面的CD16（FcγR Ⅲ）受體可以識別結合在靶細胞表面的抗體Fc段，通過抗體依賴的細胞介導的細胞毒作用（ADCC）以顆粒酶B依賴性機制發揮裂解靶細胞的功能。表面的Fas配體和腫瘤壞死因數相關凋亡誘導配體（TRAIL）可以分別和腫瘤細胞表面的Fas和TRAIL受體結合，誘導靶細胞內凋亡相關蛋白酶的活化，觸發靶細胞內死亡受體依賴性凋亡機制。啟動的NK細胞可以分泌多種趨化因數招募T細胞、單核細胞和中性粒細胞，分泌IFN-γ、TNF-α、GM-CSF和IL-10等細胞因數調節樹突狀細胞、巨噬細胞和T細胞，從而調動更多的免疫細胞參與抗腫瘤免疫反應。

二、CAR-NK作用機制

CAR結構是基於T細胞或NK細胞活化所依賴的信號設計的，包活啟動受體信號（信號1）、共刺激信號（信號2）和細胞因數信號（信號3）。CAR-NK細胞的CAR結構包含胞外段、跨膜段和胞內段，早期CAR-NK設計延用CAR-T細胞中的CAR結構。CAR-NK胞外段主要是抗體單鏈可變區。CAR-NK常用的跨膜段是由CD3ζ、CD8或CD28改造而來，其中T細胞特異性的CD8和CD28最常用。胞內段負責CAR-NK接收到靶抗原信號後的細胞啟動，是信號傳導下游所招募的共刺激分子和信號結構域的線性結構。目前CAR-NK中涉及的共刺激分子主要包括免疫球蛋白超家族成員（CD28），TNF受體超家族成員（4-1BB、CD27和OX40）, 信號通路淋巴細胞活化分子相關受體家族（2B4）。胞內段不同分子構成是區分目前四代CAR的主要分類依據。第一代CAR只包含CD3ζ，第二代和第三代則在第一代基礎上分別添加一個或兩個共刺激結構域，第四代則在第三代基礎上增加了細胞因數分泌段，以維持CAR細胞的細胞毒性和持久性。目前CAR-NK領域最常用的為CD28-CD3ζ和41BB-CD3ζ兩種二代CAR結構；而在第三代中，CD28-41BB-CD3ζ最常用。另外，回輸CAR-NK細胞的KIR與受者KIR配體不匹配可通過“迷失自我”機制增強NK細胞內在的非CAR依賴性抗腫瘤活性。

三、CAR-NK與CAR-T治療的比較

相比較而言，CAR-NK不僅可以彌補前述CAR-T的不足，而且顯示出額外的優勢（表1）。對於異體來源的細胞，異體CAR-T即使在相合情況下也有免疫排斥的風險，異體CAR-NK即使低HLA相合度（1/6）條件下也未觀察到GVHD事件。另外，KIR配體與受體的不匹配更能啟動NK細胞天然殺傷毒性。腫瘤細胞可以通過下調主要組織相容性複合物（MHC）Ⅰ類分子逃避T細胞的識別殺傷，但是基於“迷失自我”機制NK細胞可以識別殺傷這些細胞。另外，CAR-NK聯合單克隆抗體可以通過ADCC增強腫瘤清除效果，治療策略具有多樣性。在安全性方面，CAR-T細胞發揮效應過程中產生的INF-γ、TGF-α、IL-1和IL-6因數等可以引發CRS和ICANS。然而，NK細胞主要分泌IL-3和GM-CSF，引起CRS和ICANS風險極低，並且在臨床試驗（NCT03056339）中未觀察到相應不良事件。同時，由於腫瘤微環境中PD-1的表達，CAR-T細胞的功能受到抑制，而NK細胞受影響較小。CAR-NK細胞將保留其固有的通過啟動性受體識別和靶向腫瘤細胞的能力，使腫瘤細胞通過下調CAR靶抗原導致復發的可能性低於CAR-T細胞。多來源、多殺傷途徑以及低惡性不良反應風險使CAR-NK細胞更有潛力成為通用型產品（表2）。在血液腫瘤和實體瘤臨床前實驗中，CAR-NK在和CAR-T的對比殺傷中呈現早期快速高效殺傷和低毒性的特點。雖然可獲得的CAR-NK臨床資料有限，但是大量的臨床前研究所顯示的CAR-NK的腫瘤控制能力，展示了其未來應用於臨床的美好前景。

表1

CAR-T與CAR-NK細胞的特徵比較

細胞類型	來源	製備	殺傷毒性	不良反應	微環境抑制	復發
CAR-T	自體（患者T細胞的數量和品質問題）；異體（GVHD風險）	個體化的T細胞採集和製備耗時	CAR依賴性細胞毒性	CRS和ICANS發生率高，嚴重的不良反應可導致患者死亡	免疫檢查點表達水準較高	多種復發機制
CAR-NK	異體原代NK細胞（外周血、臍血、幹細胞）；自體原代NK細胞；NK細胞系（NK-92細胞系）	通用型，現貨	CAR依賴性和非CAR依賴性細胞毒性	CRS和ICANS發生率低	免疫檢查點表達水準較低	復發可能性相對較小

注 CAR-T：嵌合抗原受體T細胞；CAR-NK：嵌合抗原受體自然殺傷細胞；GVHD：移植物抗宿主病；CRS：細胞因數釋放綜合征；ICANS：免疫效應細胞相關神經毒性綜合征

表2

嵌合抗原受體自然殺傷細胞（CAR-NK）來源

細胞來源	獲得性	功能表型	製備過程	細胞產品屬性
PB-NK	需要供者或自體NK細胞，占外周淋巴細胞的10%~15%	成熟表型	NK細胞分選，CAR表達載體轉染/轉導，擴增	異質性產品
CB-NK	來自全球臍血庫，數量極少，占CB淋巴細胞的15%~30%	抑制性受體NKG2A表達水準高，對K562細胞殺傷毒性弱		異質性產品
iPSC-NK	增殖能力高	不成熟表型，低CD16表達	分化，轉染/轉導和擴增；或轉染/轉導、分化和擴增	同質性產品
NK-92 a	NK淋巴瘤細胞系，增殖能力高	缺乏CD16表達	轉染/轉導，擴增，輻射	同質性產品

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注 PB-NK：外周血來源的NK細胞；CB-NK：臍血來源的NK細胞；iPSC-NK：誘導多能幹細胞來源的NK細胞。^a NK-92細胞系，該細胞系製備和編輯容易，對凍融迴圈的敏感性低，臨床輸注前需輻照

四、血液腫瘤領域CAR-NK研究現狀

截至2021年11月，在血液腫瘤領域的臨床前研究有50多篇，Clinicaltrials註冊的CAR-NK臨床試驗有20項，具體見表3。

表3

2021年11月Clinicaltrials註冊的嵌合抗原受體自然殺傷細胞（CAR-NK）臨床研究

疾病	靶點	NK細胞來源	CAR結構（包括細胞因數）	劑量	預處理方案	治療方案	期	NCT號	狀態
難治/復發B系腫瘤	CD19	–	OX40-CD3ζ；mIL-15	3×108（<50 kg者2×106/kg），d 0、7、14，28 d為1週期	–	單藥	1期	NCT05020678	招募
B系腫瘤	CD19	CB-NK	–；自分泌IL-15	1×105/kg、1×106/kg、1×107/kg（±20%）	氟達拉濱、環磷醯胺	單藥	1期	NCT04796675	招募
B系腫瘤	CD19	CB-NK	CD28-CD3ζ；自分泌IL-15	1×105/kg、1×106/kg、1×107/kg	氟達拉濱、環磷醯胺、美司鈉	單藥	1/2期	NCT03056339	招募
B系腫瘤	CD19	–	CD28-4-1BB-CD3ζ	–	–	移植前的橋接治療	1/2期	NCT02892695	未知
難治/復發B系淋巴瘤	CD19/22	–	–	（0.5~6）×105/kg	–	單藥	1期（早）	NCT03824964	未知
難治/復發B系淋巴瘤和CLL	CD19	iPSC-NK	NKG2D-2B4-CD3ζ；IL-15RF	–	氟達拉濱、環磷醯胺	單藥或聯合利妥昔單抗	1期	NCT04245722	招募
難治B系淋巴瘤	CD22	–	–	（0.5~6）×105/kg	–	單藥	1期（早）	NCT03692767	未招募
難治B系淋巴瘤	CD19	–	–	（0.5~6）×105/kg	–	單藥	1期（早）	NCT03690310	未招募
難治B系淋巴瘤	CD19	–	–	–	–	單藥	1期（早）	NCT03824951	未知
B系淋巴瘤	CD19	CB-NK	CD28-CD3ζ；自分泌IL-15	–	卡莫司汀、阿糖孢苷、依託泊苷、馬法蘭、利妥昔單抗（移植前的化療方案）	聯合大劑量化療和自體移植	1/2期	NCT03579927	撤銷
自體移植後的NHL	CD19	iPSC-NK	NKG2D-2B4-CD3ζ；IL-15RF	9×107、3×108、9×108	–	聯合利妥昔單抗	1期	NCT04555811	招募
NHL	CD19	–	–	2×106/kg、6×106/kg、2×107/kg	氟達拉濱、環磷醯胺	單藥	1期（早）	NCT04639739	未招募
NHL	CD19	–	–	–	–	單藥	1期	NCT04887012	招募
難治/復發ALL	CD19	PB-NK	4-1BB-CD3ζ	–	–	單藥	1期	NCT00995137	完成
MM	BCMA	CB-NK	–	（1~3）×106/kg、（3~6）×106/kg、（0.6~1.2）×107/kg	氟達拉濱、環磷醯胺	單藥	1期（早）	NCT05008536	未招募
MM	BCMA	NK-92	–	–	–	單藥	1/2期	NCT03940833	招募
難治/復發AML	CD33	NK-92	CD28-CD137-CD3ζ	–	–	單藥	1/2期	NCT02944162	完成
AML	CD33	–	–	（1~3）×106/kg、（3~6）×106/kg、（0.6~1.2）×107/kg	氟達拉濱、環磷醯胺	單藥	1期	NCT05008575	未招募
AML、MDS	NKG2D	–	OX40-CD3ζ；mIL-15	方案A：1×108（< 50 kg者2×106/kg），d 0、7、14，28 d為1週期；方案B：1.5×108（< 50 kg者3×106/kg），d 0、7，28 d為1週期	氟達拉濱、環磷醯胺	單藥	1期	NCT04623944	招募
CD7+白血病和淋巴瘤	CD7	–	CD28-4-1BB-CD3ζ	–	–	單藥	1/2期	NCT02742727	未知

注 CLL：慢性淋巴細胞白血病；NHL：非霍奇金淋巴瘤；ALL：急性淋巴細胞白血病；MM：多發性骨髓瘤；AML：急性髓系白血病；MDS：骨髓增生異常綜合征；PB-NK：外周血來源的NK細胞；CB-NK：臍血來源NK細胞；iPSC-NK：誘導多能幹細胞來源NK細胞；NK-92：NK-92細胞系；mIL-15：膜表達IL-15；IL-15RF：IL-15/IL-15Rα融合蛋白；–：未提及

1. B系淋巴瘤和白血病：基於CAR-T在B系腫瘤中的成功應用，CAR-NK在B系淋巴瘤和白血病中同樣取得矚目的成績。靶向CD19的CAR-NK治療B系腫瘤的臨床研究結果顯示CAR-NK細胞治療在患者中實現了73％的緩解率和64％的完全緩解率。首次確定CAR-NK臨床應用的可行性和有效性。現有的臨床前和臨床研究靶點主要有CD19、CD20、CD22、EBNA、WT-1和CD19/CD22雙靶。在目前註冊的CAR-NK臨床試驗中，針對B系腫瘤的占絕大多數。雙靶CAR-NK的研究也率先在B系腫瘤中開展。
2. 多發性骨髓瘤（MM）：在MM領域，CAR-NK研究的靶點主要有BCMA、CS1（SLAMF7）、CD138、CD19和NKG2DL。CD138 CAR-NK-92MI和CS1 CAR-NK92都呈現出良好的腫瘤控制能力並延長MM異種移植小鼠生存期。除了NK細胞系的應用，自體CAR-NK也顯示出優越的效果。從MM患者體內分離出啟動和擴增的NK細胞，並針對MM細胞表面高表達的NKG2DL（MICA、MICA/B、ULBP-1、ULBP-2、ULBP-3等）製備NKG2D CAR-NK細胞，顯示出高效的腫瘤清除率，且對正常細胞毒性低，小鼠體內也未觀察到GVHD和治療相關毒性。
3. T系腫瘤：在T系腫瘤領域，目前CAR-NK的研究靶點有CD3、CD4、CD5和CD7。Chen等給予3次CD3 CAR-NK92治療顯著改善了Jurkat細胞種植小鼠的生存情況，並且兩周內瘤負荷降低87％。CD4為成熟T細胞的標誌，CD4 CAR-NK在有效殺傷腫瘤細胞的情況下不影響造血幹細胞和早期祖細胞的功能，展示出較高的安全性，並且2次CAR-NK92輸注延長了小鼠生存時間。CAR-NK最早在T系腫瘤中應用的多次輸注模式為後續CAR-NK的臨床應用提供了新的思路。由於目前的T系靶點缺乏腫瘤特異性，往往引起T細胞再生障礙。基於CAR-NK治療的安全性，研究者提出在CD3 CAR-NK治療前/中/後聯合移植降低腫瘤負荷，同時通過清除供者來源T細胞避免CVHD，通過清除宿主T細胞避免急性器官排斥反應。
4. 急性髓系白血病（AML）：CAR-NK在AML領域目前的研究靶點主要有CD4、CD7、CD33、CD38、CD123、FLT3和NKG2D，由於目前的靶點在髓系細胞或其他系細胞上廣譜表達，細胞治療在AML上應用有限，更特異性的靶點目前正在探索中。CD70 KO CD70 CAR-NK和CLL-1 CAR-NK聯合CISH敲除的臨床前資料顯示靶向治療AML有一定潛力。新一代的FLT OR CD33 NOT MECN 邏輯門CAR-NK細胞研究（SENTI-202）顯示，一方面啟動性CAR可以識別FLT3或CD33，優於傳統的單靶FLT3或CD33 CAR-NK，另一方面抑制性CAR可以保護高達67％的FLT3陽性正常細胞免受啟動性CAR所介導的細胞毒性。邏輯門CAR-NK的應用在治療AML上有較大的探索空間。

五、提高CAR-NK治療的有效性

隨著CAR-NK研究的深入，研究者們採取一系列優化措施來提高CAR-NK的有效性。

（一）優化CAR結構

1. NK特異性CAR結構：NK細胞特異性的典型分子NKG2D、2B4和DNAM1被用來探索更優化的跨膜段，CD107a脫顆粒效應和細胞毒性更強。另外，跨膜段設計應遵循NK細胞上跨膜蛋白的自然方向（N→C端），天然NKG2D分子具有C→N端跨膜區域，且具有短的細胞質尾，直接應用效果受限，而逆轉NKG2D 跨膜段為N→C端可能增強CAR效應。

研究者對CAR-NK的CAR胞內段也進行了更深入的探索。在靶向CD5的CAR-NK治療T系腫瘤的臨床前實驗中，2B4ζ-CAR-NK相比於41BBζ-CAR-NK有更高水準的啟動受體（CD69、NKG2D、HLA-DR）表達和更高水準的細胞因數（IFN-γ和TNF-α）分泌。信號結構域除了CD3ζ，NK特異性的DAP10、DAP12也被用來進行了優化CAR結構設計的探索，但是效果欠佳。DAP12.CAR與CD3ζ.CAR的殺傷毒性無顯著差異，但是CD3ζ.CAR細胞有更慢的CAR表達下調速度和較強的脫顆粒能力。而在NKG2D-2B4ζ結構基礎上再添加DAP10或DAP12也並沒有對CAR-NK細胞功能引起差異性改變。

而對於整個CAR結構，NK特異性跨膜段和共刺激分子組合NKG2D-2B4ζ，相較於T細胞特異性CAR CD28-41BBζ，誘導CAR-NK的CD107a表達和IFN-γ分泌水準更高，並介導細胞內下游磷酸化分子水準升高提前。因此，NK細胞特異性結構域參與的不同排列組合在探索更優CAR結構中將有更大的潛能。

2. 雙靶CAR結構：單靶CAR細胞可能由於靶抗原下調或陰性而導致腫瘤細胞逃逸，而表達雙CAR的細胞可以提高CAR細胞的識別和靶向攻擊效率。同時表達並聯雙靶CD19/CD22的CAR-NK細胞可以高效殺傷CD19單表達和CD22單表達的RS4;11細胞，從而避免因一種抗原丟失導致的CAR-NK失效[12]。

（二）增強細胞毒性

1. 誘導型MyD88/CD40共刺激分子（iMC）：iMC是一種核糖核酸調節的蛋白開關，在CAR-T中可以作為細胞啟動劑促進CAR-T細胞增殖和改善持久性，應用到CAR-NK細胞中，研究者發現iMC啟動的CAR-NK顯示出細胞因數和趨化因數分泌增加，穿孔素和顆粒酶B脫顆粒水準提高，進而增強抗腫瘤細胞毒性。
2. 記憶NK分化：IL-12、IL-15和IL-18預處理NK細胞可以誘導記憶表型，即細胞因數誘導的記憶樣NK（ML NK）細胞。ML NK呈現出糖酵解代謝譜，啟動受體表達增加，並且不受KIR-KIRL相互作用的干擾，在NSG異種移植小鼠模型體內顯示出更長的存活時間，並顯著改善了針對一系列靶點的效應功能。ML NK分化表型和CAR工程化協同增強NK細胞對耐藥的白血病/淋巴瘤的反應性，並且體內實驗顯示19-CAR-ML NK可以降低人源化小鼠的瘤負荷並改善小鼠生存。
3. 增強ADCC作用：NK-92細胞系不表達CD16分子，通過修飾編輯使其表達IgG Fc受體的高親和力變異體（FcγRⅢ）同時聯合利妥昔單抗可以增強ADCC作用。同時表達高親和力非裂解性CD16的CAR-iPSC-NK（FT596）聯合利妥昔單抗目前也已用於臨床試驗中（NCT04245722）。

（三）延長持久性

1. IL-15：IL-15在NK的生存、發展、啟動、代謝改變方面發揮重要作用，與CAR-NK細胞在體內的存續性密切相關。目前的CAR-NK產品多為自分泌IL-15，自分泌模式可以使CAR-NK持續處於高濃度IL-15微環境中，延長CAR-NK細胞的體記憶體續時間長達12個月。另外，膜表達IL-15（mIL-15）配體可以通過細胞間交互介導的反式信號傳遞模式來傳遞更強的IL-15刺激信號，並應用於臨床試驗中（NCT04623944）。表達mIL-15/IL-15Rα融合蛋白的CAR-NK（FT596）產品目前也應用於治療B系血液腫瘤的臨床試驗（NCT04555811和NCT04245722）。細胞因數誘導型含SH2蛋白（CIS）是IL-15信號的關鍵的負性調節因數，CRISPR/Cas9基因編輯敲除CISH基因的CAR-NK細胞通過增強Akt/mTORC1軸和c-MYC信號，提高有氧糖酵解水準，進而增強CAR-NK細胞效應功能[27]。
2. 多次輸注：基於目前的臨床和臨床前資料來看，CAR-NK在體內的擴增和持續有限，單次輸注雖然有很強的腫瘤殺傷效果，但是可能不能完全清除腫瘤細胞，因此連續重複輸注大劑量CAR-NK細胞以維持體內CAR-NK動力學穩定和持久可能是未來CAR-NK治療的策略[28]。

（四）減少耗竭信號

NK細胞受免疫檢查點的影響相對T細胞較小，但是其在NK細胞耗竭過程中仍發揮著重要作用。PD-1在活化和更具反應性表型的NK細胞上的表達更為豐富。PD-L1阻斷劑可以提高NK細胞的體內持久性和保留其細胞毒性，同時提高體內NK細胞通過ADCC的抗腫瘤效應[29]。另外，抗PD-L1抗體作為PD-L1+NK細胞的功能性啟動抗原，通過p38信號通路提高NK細胞對白血病細胞的殺傷毒性[30]。TIGIT是表達在T細胞和NK細胞上的與耗竭相關的免疫檢查點，高表達TIGIT的NK細胞伴隨著CD107a、IFN-γ和TNF-α等活化因數的分泌減少，並與疾病進展和免疫逃逸相關[31]。研究顯示離體的NK細胞IL-15活化後伴隨有TIGIT表達上調，聯合抗TIGIT抗體顯著提高NK的腫瘤殺傷毒性[32]。阻斷TIGIT可以延緩NK細胞耗竭，並在多種小鼠荷瘤模型中促進了NK細胞依賴性腫瘤免疫，並以NK依賴性方式促進了腫瘤特異性T細胞免疫[33]。

目前，血液腫瘤領域尚無CAR-NK聯用免疫檢查點阻斷的應用，在實體瘤領域，靶向PD-L1的CAR-NK細胞（PD-L1 CAR t-haNK細胞）聯合使用抗PD-1抗體和N803呈現出良好的腫瘤控制效果（NCT04847466）[34]。CAR-NK聯合免疫檢查點阻斷的應用尚待進一步探索。

（五）避免自絞殺

CD38是MM已確立的免疫治療靶點，而其是否可以作為AML的治療靶點尚待探索。但是由於CD38在NK細胞上的基礎資料表達以及離體培養過程中進一步誘導上調成為設計靶向CD38的CAR-NK的障礙。通過敲除NK細胞的CD38製備的CD38 KO CD38 CAR-NK顯示出自絞殺減低和靶向攻擊AML原代細胞的能力增強的現象[35]。

（六）改善趨化性

CAR-NK可以趨向於腫瘤病變部位。回輸到淋巴瘤患者體內的CAR-NK淋巴結部位數目顯著高於骨髓和外周血[2]。然而，體外培養的NK細胞會下調CXCR4、上調CXCR3表達，導致NK細胞骨髓歸巢能力下降，而趨向於炎症部位，使NK細胞滯留在髓外組織[36]。共表達CXCR4的CAR-NK向骨髓巢的遷移能力增強，並顯著降低MM移植小鼠模型股骨區域的瘤負荷[21]。

六、CAR-NK治療的安全性

NK細胞表面抑制性受體識別正常細胞表面的MHC Ⅰ類分子通過“耐受”機制來抑制對正常細胞的毒性。異體輸注時也不會介導GVHD的發生。對於工程化的CAR-NK，為了避免和抵消增強療效相關措施帶來的毒性風險，相關“自殺”開關也同時被設計於CAR-NK中。通過加入一個正交調節的促凋亡開關，即雷帕黴素誘導的Caspase-9（iRC9），iRC9二聚化促進CAR-NK細胞凋亡，表現為雷帕黴素呈劑量依賴性的誘導細胞表面Annexin Ⅴ表達[22]。在已發表的臨床試驗中，CAR-NK顯示出較高的安全性，低GVHD、CRS和ICANS風險，研究者並沒有啟動iCR9開關[2]。

七、結語

CAR-NK在療效方面顯示出巨大的潛能，在安全性方面顯示出巨大的優越性。但是CAR-NK也存在大規模製備方法改進、凍存措施優化和療效增強的需求，同時體記憶體續時間短、耗竭問題尚待解決。總體來說，CAR-NK在未來更有可能成為通用型細胞產品，在單藥或者聯合移植、單抗等治療方面有較大的優勢。CAR-NK研究開創了細胞治療的新思路，相信在不久的將來隨著CAR-NK細胞治療技術的成熟將給更多腫瘤患者帶來福音，使人類向攻克難治復發性腫瘤治療的難題更進一步。

Zhonghua Xue Ye Xue Za Zhi. 2022 Dec; 43(12): 1051–1056.

Chinese. doi: 10.3760/cma.j.issn.0253-2727.2022.12.015

 

引言

NK細胞在癌症治療中的潛力已經被諸多研究證實，隨著研究的進展，科學家證實了其在癌症之外的多種疾病的治療潛力。近期，科學家發現，NK細胞有能力清除可能導致疼痛的受損神經細胞，在治療神經性退行性疾病方面展示出了其非凡的潛力，有助於阻止帕金森病的進展。

面對神經性疼痛，目前全球範圍內最主流的緩解方式是服用阿片類藥物。但是相關研究人員表示，使用阿片類藥物或抗抑鬱藥只是暫時緩解這些疼痛症狀，而無法從根本解決。同時有資料表明，在1999年至2020年期間，美國過量服用阿片類藥物達到56.4萬人，這對身體造成的風險和副作用不可估計。近日，一篇發表在國際醫學期刊《Trends in Neurosciences》的文章表示，自然殺傷(NK）細胞可能成為神經性疼痛的替代療法。研究人員收集了NK細胞對疼痛影響的現有證據，指出它們有能力清除可能導致疼痛的受損神經細胞，未來或成為安全有效的治療方式。

NK細胞通過多種途徑改善神經性疼痛:神經性慢性疼痛是由創傷、病毒感染、化療等各種病理條件導致神經系統的病變引起的。病變的神經元連接錯誤或停止正常功能後，將引起常駐免疫細胞的啟動，其產生和分泌各種炎症介質。這些介質促進神經免疫反應啟動，從而出現疼痛症狀。而引入NK細胞可以幫助消除這些異常的神經元，小鼠實驗表明，如果一個神經元處於功能異常狀態，它的軸突部位（負責傳遞資訊的部分）就會產生一種叫做RAE1應激配體分子，後者可以提醒NK細胞它們需要修剪。

因此從理論上講：

NK細胞可以通過特異性殺傷損傷細胞來解決周圍神經損傷所帶來的疼痛。

同時，NK細胞也能夠進行免疫調節，通過間接釋放細胞因數或趨化因數，或者通過直接殺死其他免疫細胞進行調節，理論上可用於減弱免疫反應所帶來的炎症性疼痛。

NK細胞有助於阻止帕金森的進展

除此之外，NK細胞在治療神經性退行性疾病方面也展示出了其非凡的潛力。

帕金森病（Parkinson’s disease，PD）又名震顫麻痹，是一種常見的神經系統變性疾病，在老年人群中多見。目前認為其發病原因與大腦中多巴胺神經元內一種名為α-突觸核蛋白（α-Syn）相關。它可以調節突觸囊泡內神經遞質的聚集和釋放，還可以在細胞核中通過與組蛋白結合調節自身基因的表達。在帕金森患者體內，異常的α-SYN錯誤折疊、堆積（聚集形成原纖維），無法發揮正常功能，從而導致神經元死亡。因此α-SYN是帕金森病發病機制中最重要的蛋白。帕金森病目前傳統的治療方式多以藥物治療和手術治療為主。但美國佐治亞大學再生生物科學中心的研究人員發現，NK細胞也有助於阻止帕金森病的進展。

一篇發表於《美國國家科學院院刊》的名為《NK cells clear α-synuclein and the depletion of NK cells exacerbates synuclein pathology in a mouse model of α-synucleinopathy》的文章表示NK細胞是攻擊“入侵者”的高效“清除劑”，可通過減少腦部炎症和清除、抑制異常蛋白質聚集而對大腦發揮保護作用。研究人員用不同濃度的α-syn處理了人類NK細胞後，發現NK細胞能夠有效地降解細胞外α-syn聚集體，這可能在病理上對調節和抑制神經退行性疾病至關重要。

隨著醫學發展，以往認為帕金森病是單一腦部疾病的認知也正在更新，越來越多研究證實免疫系統和中樞神經系統之間存在關聯。上述研究進一步證實了NK細胞在神經系統疾病方面治療的應用可能。

參考文獻：

[1] The therapeutic potential of natural killer cells in neuropathic pain

https://www.cell.com/trends/neurosciences/fulltext/S0166-2236(23)00133-9

[2] NK cells clear α-synuclein and the depletion of NK cells exacerbates synuclein pathology in a mouse model of α-synucleinopathyhttps://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/31900358/

Beijing Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban. 2019 Jun 18; 51(3): 591–595.

Chinese. doi: 10.19723/j.issn.1671-167X.2019.03.032

Abstract

目的

評估同種異體自然殺傷(natural killer, NK)細胞治療原發性肝癌的安全性和有效性,並探討其抗腫瘤機制。

方法

對21例經同種異體NK細胞治療的原發性肝細胞癌患者進行1年隨訪,通過對其生存期、影像學指標、血液學指標、生物化學指標及免疫學指標分析,評價該治療的安全性和有效性,分析患者經過治療後外周血淋巴細胞亞群的變化。

結果

(1)21例原發性肝癌患者中,11例患者治療1次,5例患者治療2次,5例患者治療3次,患者治療後未見嚴重不良反應,10例患者有一過性發熱,1例患者出現肝區疼痛,1例患者出現頭痛,未經治療均於8 h內自行緩解;(2)在一年隨訪中,總疾病控制率為76.2%,其中Barcelona分期(Barcelona clinic liver cancer, BCLC)A期患者中疾病控制率為100%, 病情穩定(stable disease, SD)10例;BCLC B期患者中疾病控制率為60%,部分緩解(partial response, PR)1例,SD 2例;BCLC C期患者中疾病控制率為50%,完全緩解(complete response, CR)1例,PR 2例;(3)患者治療後24 h外周血NK細胞和CD8+T細胞頻率較治療前顯著降低,CD4+T細胞頻率和CD4/CD8較治療前顯著上升。

結論:同種異體NK細胞治療原發性肝細胞癌有很好的安全性和有效性。

Keywords: NK細胞, 肝細胞癌, 同種異體, 外周免疫

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)目前是全球惡性腫瘤相關死亡的第三大原因,NK細胞是天然免疫的重要組成部分,在清除病毒感染的細胞和腫瘤細胞中起關鍵作用。在慢性肝炎發展為肝癌的過程中,NK細胞功能缺陷與疾病進展密切相關,同時也是造成腫瘤細胞免疫逃逸的重要原因^[1]。與正常肝組織相比,肝細胞癌患者瘤內NK細胞數量降低、細胞亞群分佈改變,識別和殺傷肝癌細胞的功能降低^[2,3]。近期研究表明,自體NK細胞治療在多種實體瘤的治療中可以提高外周迴圈中NK細胞的活性和數量,但由於很難遷移到腫瘤部位發揮功能,臨床療效有限^[4,5]。同種異體NK細胞治療近年來被廣泛應用於各種臨床試驗。殺傷細胞免疫球蛋白樣受體(killer cell immunoglobulin-like receptor, KIR)不匹配可以抑制自體組織相容性複合體(major histocompatibility conplex, MHC)分子的負向調控信號,保證足夠的NK細胞活化。在急性髓系白血病(acute myelocytic leukemia, AML)患者中,來自KIR不匹配供體的NK細胞過繼回輸可顯著降低造血幹細胞移植後的復發率^[6]。本研究以患者的健康直系血親為供者,分離外周血單個核細胞並進行NK細胞的體外培養,在培養後的第14、15天,分2次回輸給患者,通過對患者進行隨訪,同時評估同種異體NK細胞治療的安全性和有效性。

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1. 資料與方法

1.1. 研究物件

選擇2016年4月至2017年10月在解放軍總醫院第五醫學中心收治的HCC患者。

患者納入標準:(1)年齡16~65歲的男性或女性患者;(2)按照《原發性肝癌診療標準(2015年版)》, 患者經病理學和影像學確診為原發性肝細胞癌;肝功能Child-Pugh A/B級 (5~9分),美國東部腫瘤協作組評分標準(eastern cooperative oncology group score standard, ECOG)評分≤ 2分;(3)血小板計數>60×10⁹ /L;血紅蛋白>80 g/L;凝血:國際標準化比率(international normalized ratio, INR)<2.3,或者凝血時間延長<6 s;血清白蛋白>28 g/L,總膽紅素<51 mmol/L,穀丙/穀草轉氨酶<5倍正常值上限;(4)合併乙肝患者進行抗病毒治療,合併丙肝患者服用直接抗病毒(direct-acting antiviral agents, DAA)藥物治療。供者入組標準:(1)年齡18~40 歲的男性或女性且為患者直系血親;(2)理解並簽署知情同意書,且遵循自願、無償的原則;(3)排除糖尿病、高血壓、心臟病等慢性疾病,全身無其他重大器質性疾病和傳染性疾病;(4)沒有精神障礙,具有完全的行為能力。

患者排除標準:(1)妊娠或哺乳期婦女;(2)器官移植後患者;(3)2 周內進行過介入微創治療術或者1 個月內進行過切除手術的患者;(4)合併甲型肝炎、戊型肝炎、愛滋病等感染者,或有其他傳染性疾病;(5)合併其他嚴重的全身性疾病和精神病患者;(6)篩選前30 d內發生過急性感染、消化道出血等嚴重併發症;(7)半年內進行過其他生物治療,包括細胞因數誘導的殺傷細胞(cytokine-induced killer cells, CIK)、樹突狀細胞(dendritic cells,DCs)、嵌合抗原受體T細胞(chimeric antigen receptor T-cells, CAR-T)、程式性死亡受體1(programmed cell death protein 1, PD-1)和其他免疫治療的患者。

共入組HCC患者21例,其中男性18例,女性3例,基線資料見表1。本項臨床研究通過中國人民解放軍第三零二醫院醫學倫理委員會審查批准,所有入組患者和供者均理解並簽署知情同意書。

1

患者的人口學和基線特徵

Demographic and baseline characteristics of the patients

Variable	Data
ECOG, eastern cooperative oncology group score standard; BCLC, Barcelona clinic liver cancer.
Age/years	56.1±7.6
Gender, n(%)
Male	18 (86)
Female	3 (14)
Cause ofdisease, n(%)
Alcoholic liver disease	1 (5)
Hepatitis B only	16 (76)
Other	4 (19)
ECOG performancestatus, n(%)
0	8 (38)
1	11 (52)
2	2 (10)
BCLC stage, n(%)
A	10 (48)
B	5 (24)
C	6 (28)
Child-Pugh class, n(%)
A	17(81)
B	4(19)
Biochemical analysis
albumin/(g/L)
Median	40.6
Range	27.0-46.0
Totalbilirubin/(μmol/L)
Median	14.3
Range	8.9-63.6
Alpha-fetoprotein/(μg/L)
Median	20.6
Range	2.2-1210.0

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1.2. 細胞製備及質控

包被:取NK細胞啟動劑2 mL至175 cm²培養瓶中,加入20 mL生理鹽水充分混勻並置於4 ℃冰箱過夜。

外周血單核細胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)分離:採集供者外周血50~80 mL,通過Ficoll-Hypaque密度梯度離心,800 ×g,25 min;收集上層血漿並於56 ℃滅活30 min;收集單核細胞層細胞,加入生理鹽水重懸,300 ×g,10 min洗滌2次。

細胞培養:用10 mL生理鹽水沖洗包被的培養瓶,將PBMC重懸於NK細胞活化培養基中,使其密度為1×10⁶/mL,分別按照終濃度為50 μg/L、1 000 IU/mL和2.5%分別加入重組人IL-15、重組人IL-2和滅活血漿,混勻後接種于包被培養瓶中;置於37 ℃,5% CO₂飽和濕度培養箱中培養72 h;觀察細胞生長狀況並加入擴增培養基,調節細胞密度至5×10⁵~8×10⁵/mL,按照初始培養濃度加入細胞因數和滅活血漿,每2~3天傳代1次。

細胞收穫:培養14 d和15 d後,用生理鹽水重量細胞300 ×g,8 min洗滌細胞2次,用含1%(體積分數)注射用人白蛋白的生理鹽水懸浮細胞,經70 μm細胞篩過濾後轉移至輸液袋。

細胞質控:分別于培養第0、7、14天取細胞培養懸液進行品質檢測,質檢內容包括微生物學安全性(細菌、真菌、支原體、內毒素檢測)和生物學活性(細胞活率、NK細胞純度、NK細胞分泌細胞因數水準、NK細胞殺傷功能檢測)。

1.3. 隨訪檢查

首次NK細胞治療開始後4周、8周、12周、24周、36周、48周定期隨訪。隨訪觀察指標包括安全性指標(發熱及其他不適、血常規、肝腎功能、心電圖)和有效性指標(臨床症狀及體征、腫瘤標誌物水準、生物化學指標、影像學指標、免疫學指標及生活品質評價)。

1.4. 統計學分析

採用SPSS 19.0統計軟體,統計結果用 x±s表示。採用配對t檢驗比較NK細胞治療前後臨床及實驗室檢查結果,P<0.05認為差異有統計學意義。

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2. 結果

2.1. 同種異體NK細胞治療安全性評價

21例患者中,10例患者治療1療程,5例患者治療2療程,5例患者治療3療程。所有患者未見噁心、嘔吐、感染、過敏、昏迷、急性和慢性移植物抗宿主反應(graft-versus-host disease, GVHD)。10例患者在細胞輸注後24 h內出現短暫發熱反應,其中9例患者體溫為37.3~38.5 ℃,1例患者體溫為38.5~39.5 ℃。1例患者接受NK細胞治療12 h後出現輕微肝痛,1例患者出現輕微頭痛。以上所有患者的症狀均在8 h內自然緩解,無需治療。結果表明,該劑量的NK細胞治療不超過患者的耐受限度。

在1年的隨訪中,同種異體NK細胞治療後3個月內患者淋巴細胞數量逐漸減少,但差異無統計學意義。治療3個月後淋巴細胞計數恢復至治療前水準,6個月後淋巴細胞計數高於基線,然後緩慢恢復到原水準。中性粒細胞和血小板水準無明顯變化。治療後患者谷丙轉氨酶(alanine aminotransferase, ALT)、穀草轉氨酶(aspartate aminotransferase, AST)、總膽紅素(total bilirubin, TBil)、白蛋白(albumin, ALB)均在正常範圍內波動,與基線比較差異無統計學意義,甲胎蛋白(alpha fetoprotein, AFP)水準較NK細胞治療前顯著降低。

2.2. 同種異體NK細胞治療療效評價

按照實體瘤療效評價(response evaluation criteria in solid tumors, RECIST)1.1標準^[7], 21例同種異體NK細胞治療的HCC患者1年隨訪中,1例(4%)完全緩解,3例(12%)部分緩解,12例(52%)病情穩定。所有患者的總疾病控制率為76.2%(表2),其中BCLC(Barcelona clinic liver cancer) A期患者中疾病控制率為100%, SD 10例;BCLC B期患者中疾病控制率為60%,部分緩解(partial response, PR) 1例,SD 2例;BCLC C期患者中疾病控制率為50%,完全緩解(complete response, CR) 1例,PR 2例。截至2019年5月,接受同種異體NK細胞治療的21例患者中有5例死亡。死亡患者中BCLC C期患者3例,存活時間分別為3個月、4個月和4個月;BCLC B期患者2例,存活時間分別為4個月後、10個月。

2

NK細胞治療療效評價

Summary of efficacy measures

BCLC staging	Total	Complete response (CR)	Partialresponse (PR)	Stable disease (SD)	Disease-control rate/%
A	10	0	0	10 (100%)	100
B	5	0	1 (20%)	2 (40%)	60
C	6	1 (17%)	2 (33%)	0	50

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2.3. 同種異體NK細胞治療後外周免疫變化

同種異體NK細胞過繼回輸後24 h,患者CD4+ T細胞的頻率和CD4/CD8比值較基線顯著升高(圖1),而NK細胞和CD8+ T細胞的頻率較基線顯著下降,B細胞頻率較治療前差異無統計學意義。考慮到所培養的NK細胞和患者PBMC存在互相殺傷的可能,分別以患者PBMC和供者培養後的NK細胞為靶細胞進行單向混合淋巴細胞培養,發現無論是否加入IL-2,供者培養後的NK細胞對患者PBMC均無殺傷作用,但具有正常殺傷腫瘤細胞系的能力。

1

NK細胞治療24 h後患者外周血淋巴細胞亞群變化

Changes in the proportion of lymphocyte subsets 24 h after treatment

*P<0.05, ☆P<0.001.

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3. 討論

早期的基礎研究顯示,在造血幹細胞移植和骨髓移植過程中CD56(bright) NK細胞的百分比與GVHD的發生密切相關,當移植物中CD56(bright) NK細胞超過3%時,GVHD發生的概率接近於零^[8,9,10]。本實驗培養NK細胞的中位元頻率為80%,遠遠超過造血幹細胞移植和骨髓移植中CD56(bright) NK細胞的頻率,但在本試驗研究的1年隨訪過程中,研究沒有觀察到急性和慢性GVHD的發生,提示同種異體NK細胞在原發肝癌的臨床應用中有很好的安全性。本研究結果顯示,疾病控制率與同種異體NK細胞治療的療程有關,治療的療程數越多,疾病控制率越高,提示異體NK細胞在患者體內存在半衰期,多次治療可能會提高治療療效,但由於本臨床試驗樣本量較小,難以控制和調整混雜因素,這一結果還需要通過大樣本臨床試驗進一步驗證。

本研究檢測了同種異體NK細胞過繼輸注後HCC患者外周血淋巴亞群的變化,發現雖然短期內輸入了了大量的外源性NK細胞,但患者外周血中NK細胞的數量和頻率仍然低於治療前水準。同種異體NK細胞輸注後患者外周血CD8 T細胞和NK細胞數量在24 h內降至最低,B細胞在48 h內降至最低,1周後逐漸恢復至正常水準,這一結果與Qin等^[11]的報導相反。本研究將培養的NK細胞與未處理的HCC患者PBMC體外共培養24 h,未觀察到培養的NK細胞對患者PBMC的殺傷作用,也未觀察到患者PBMC對培養NK細胞的殺傷作用,這一結果可能與Miller等^[12]報導的單倍體NK細胞過繼回輸後異體NK細胞在患者體內嵌合現象有關。本研究推測,大劑量同種異體CD56(bright) NK細胞過繼輸注後,可能通過分泌細胞因數啟動患者的自然免疫和特異性免疫,誘導患者特異性CD8+T細胞和NK細胞向腫瘤部位遷移,改變腫瘤局部微環境並殺傷腫瘤細胞。

本研究6例晚期肝癌患者1例治療後完全緩解,回顧分析發現該患者在接收同種異體NK細胞治療同時也接受索拉非尼治療,提示同種異體NK細胞聯合索拉非尼可能會延長患者的生存時間。索拉非尼是晚期HCC的靶向治療藥物,據Llovet等^[13]在N Engl J Med報導,索拉非尼可使晚期HCC患者的中位生存期延長近3個月,但在299例單用索拉非尼治療的患者中,沒有一例患者達到CR。回顧2012—2018年在解放軍總醫院第五醫學中心感染性疾病診療與研究中心接受索拉非尼治療的患者,也沒有發現CR病例。此外,索拉非尼的副作用和耐藥性仍然存在,這極大地限制了索拉非尼的臨床應用。既往研究表明^[14,15],索拉非尼可觸發腫瘤相關巨噬細胞(tumor-associated macrophage, TAM)的促炎活性,繼而誘導抗腫瘤NK細胞反應,提示NK細胞治療聯合索拉非尼可使患者獲得更好的臨床療效。在研究3例同種異體NK細胞聯合索拉非尼患者的總生存時間分別為16個月、19個月、32個月,均存活到2019年5月,遠遠超過報導的10.3個月,提示同種異體NK細胞聯合索拉菲尼在晚期肝癌的治療中可能具有巨大的潛力。

綜上所述,同種異體NK細胞治療HCC有很好的安全性和有效性,對延長患者生存時間、提高生活品質可能具有良好的治療前景。但仍需要進一步通過大樣本、多中心、隨機對照研究評估同種異體NK細胞聯合索拉菲尼治療晚期肝癌的療效。

(本文編輯:王蕾)

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Biography

王福生,中國科學院院士,教授,主任醫師,博士生導師。國家傑出青年基金獲得者,國家自然科學基金創新研究群體牽頭人,國家感染性疾病臨床醫學研究中心牽頭人,解放軍總醫院第五醫學中心感染病診療與研究中心主任。擅長病毒性肝炎、愛滋病和疑難危重肝病的臨床診治工作,並結合臨床難題開展研究,系統地揭示了乙型肝炎臨床免疫學特徵及肝臟損傷機制,提出了優化慢性乙肝抗病毒治療與免疫應答恢復的“爬坡假說”,闡明了愛滋病免疫重建失敗的關鍵機制,開拓了疑難肝病和愛滋病細胞治療與研究的新方向。曾先後主持多項國家重大科研項目,以通信作者在N Engl J Med、Gastroenterology、Hepatology、Blood等期刊發表論文160餘篇,獲得國家科技進步獎二等獎3項、省部級獎一等獎3項。

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Funding Statement

國家自然科學基金(81721002,81571567)

Supported by the National Natural Science Foundation of China(81721002,81571567)

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