在我們的身體裡,其實每天都有癌細胞形成。但是,為什麼僅有一部分人會得癌症呢?這就得益于我們身體龐大而又精密的免疫系統,而防禦癌症發生的就是免疫細胞,他們就像巡警一樣,在身體裡隨著血液迴圈四處巡邏,監視異常。其實,對抗癌症,最好的醫生就在人體內,既不是化療藥也不是手術放療,而是健康的免疫系統。

 

NK細胞是免疫系統中重要的自然殺傷細胞,不需要特異性的抗原刺激就可以殺傷靶細胞,如病毒感染細胞、腫瘤細胞。NK細胞平時就像巡警一樣,遊弋在人體血管中,行使免疫監視功能。當遇到癌變、病變或衰老的細胞時,即啟動免疫防禦功能,NK細胞在抗腫瘤免疫應答中發揮溶解細胞、分泌趨化因數和細胞因數等重要作用,同時還可阻止腫瘤轉移等。

 

人體為什麼會發生癌症?

 

醫學界發現,個體接觸危險因素並在體內出現癌變需要5~20年。在此期間,體內的NK細胞和癌細胞“相互競爭”不斷“博弈”,相互對抗。在這個過程中,自然殺傷細胞的活性、致死性和數量都會受到癌症的影響。可以說,人體的NK細胞是一種不可再生的資源,非常珍貴。中晚期癌症患者的NK細胞往往已經嚴重受損,腫瘤細胞無法被破壞,導致癌症的復發和轉移。

 

隨著NK細胞功能研究的不斷深入,為癌症治療提供了契機,即通過細胞工程恢復或重建NK細胞的抗腫瘤能力,提高NK細胞對腫瘤免疫治療的作用;或者通過體外擴增、活化、儲存健康的NK細胞,一旦發生腫瘤,可以使用殺傷力強的健康NK細胞,提高腫瘤的治癒率,降低患者的死亡率。

 

NK細胞是與T細胞、B細胞並列的第三類群淋巴細胞,人體內NK細胞數量很少,僅占外周血的5%~10%。脾臟內約占3%~4%,肝臟、肺臟、胸腺、淋巴結等也可見少量NK細胞。人體內NK細胞的數量很少,只占外周血的5%~10%,而且平時還處於非活化的狀態,需要體外擴增到一定的數量後,才能進行治療。

 

研究發現40歲以後,NK細胞的數量和功能會急劇下降。這時人體的免疫監測和清除能力會下降,體內的癌細胞很容易存活和增殖,患癌的概率會增加,各種疾病都會不請自來。及時補充高活性NK細胞,重塑免疫系統,是一種安全有效的提高機體免疫力的方法。利用NK細胞治療技術,可以不定期地對活性NK細胞進行再利用,從而增強人體免疫系統的功能,及時消除癌細胞,預防癌症的發生。

 

NK細胞療法增強癌症治療效果

 

NK細胞最初的臨床價值恰恰是在癌症治療中被發現,但在癌症治療中,它的用途是輔助治療和預防復發。眾所周知,目前治療癌症最好的方法就是手術。如果切除了惡性腫瘤,體內就不會有惡性腫瘤,癌症自然會得到治療。但是為什麼會復發或轉移呢?很多患者都有一個誤區,認為腫瘤轉移是晚期現象,腫瘤要到晚期才會轉移。但其實除了少數腫瘤,它的形成本身就是一個長期的過程,是癌細胞的增殖速度超過了機體免疫系統的殺傷能力造成的。這不是一兩天的事,從癌細胞出現到癌細胞出現至少需要5年。到診斷癌症時,癌細胞已經隱藏在人體的各個部位。即使切除腫瘤,一旦身體抵抗力下降,癌症還會復發,而且會比手術前更加猛烈。

 

NK細胞療法是將自體或異體NK細胞在體外進行活化培養,激發它高效識別與殺滅腫瘤細胞的能力,然後回輸患者體內,打破人體的免疫耐受達到抑制癌細胞增殖、增強人體免疫力的效果。NK細胞治療的作用是清除隱藏在人體各個部位的癌細胞,防止癌症復發轉移。因此,建議術後1-3個月內開始NK細胞治療,最好在1個月內開始,最長不超過3個月,治療3-5個療程。NK細胞治療後,它會自動找到這些細胞並殺死它們。此外,NK細胞治療也可以提高術後恢復的速度。結果表明,自然殺傷細胞治療惡性腫瘤的有效率約為40%-70%。因此,如果NK細胞免疫療法與其他癌症治療方法相結合,治療效果將呈幾何級數增長。

 

NK細胞圍攻癌細胞

 

NK細胞療法臨床研究

 

案例1:國外知名雜誌《Oncotargets andTherapy》的一例試驗報告顯示,NK細胞療法讓晚期肝癌患者腫瘤顯著縮小,從生存期僅3個月到超過4年!

 

案例2:國內一名60歲的卵巢癌晚期患者,在接受了體外擴增,高度活化的同種異體NK細胞的治療後,CA125水準從11,270降至580,所有腹水都消失了。此外,CT掃描的腫塊體積減小,並且沒有出現副作用。

 

案例3:2020年5月,國內的研究團隊證實,PD-1(派姆單抗,K藥)加同種異體NK細胞在先前接受過治療的晚期NSCLC患者中安全有效。並發表在國際頂級期刊《TheJournal of Clinical Investigation 》上。

 

研究最終招募了109例PD-L1高表達非小細胞肺癌患者,隨機分為A組(55例)接受NK細胞聯合PD1(派姆單抗)、B組(54例)僅接受派姆單抗。實驗表明,這項研究的結果非常振奮人心,輸注擴增的NK細胞後,患者的NK細胞數量顯著增加,抗癌效果倍增。

 

小結

 

經過幾十年的臨床研究,已經實現了同時提升NK細胞的活性與數量,完成了NK細胞回輸體內對抗癌細胞必備的兩項基本要求。目前,NK細胞培養技術都已經非常成熟,正在進行廣泛的臨床研究。我們堅信,將會有越來越多的細胞免疫技術和藥物聯合使用的試驗不斷湧現,只要不放棄任何一點希望,攻克癌症指日可待!相信在不遠的將來,NK細胞將化身為更強大、更有力的“抗癌武器”,為腫瘤治療的路上帶給廣大患者更多驚喜和福音

細胞免疫療法如今已愈發成熟。CAR-T細胞療法已有6款獲FDA批准上市,國內5款獲NMPA批准上市,首款TIL療法在今年已獲FDA批准上市,首款TCR-T療法已申報上市並進入最後衝刺階段。其中,還有一種療法不能忽略——NK細胞療法。

近兩年來,基於自然殺傷(NK)細胞的免疫療法備受矚目,已成為治療實體瘤和血液系統惡性腫瘤的一種有前途的治療方法。而iPSC來源NK細胞用於腫瘤治療的前景也在不斷被行業認可。相比於較為成熟的CAR-T細胞,iPSC衍生NK細胞不僅大大降低了不良反應風險,也可極大降低製藥成本,且更易通過基因修飾以強化NK細胞對腫瘤的殺傷效能。

不過,NK細胞療法還處於臨床試驗階段,距離成藥驗證還有很長一段路要走。儘管國內外都在積極開展研究,但目前不論是中國還是國際,NK細胞療法仍然均未正式獲批上市進入臨床應用,同時,也伴隨著波折的發展歷程。

 

NK細胞療法現狀:安全性優異,持久性和腫瘤殺傷效力有待優化

NK細胞療法相較於CAR-T療法有哪些異同?

CAR-T細胞在進入病人體內以後,可以高效識別腫瘤細胞,擴增能力強大,它能夠形成記憶性T細胞在患者體內長期存在,以達到長期持續抗腫瘤的療效。這對於CAR-T療法來說是把雙刃劍,雖然持續殺傷腫瘤的能力非常強,但也會引起其最需警惕的風險——細胞因數風暴和持續性脫靶殺傷毒性,從而引起患者用藥後的諸多副作用,比如,由於CD19在人體正常B細胞中表達,因此靶向CD19的CAR-T細胞在人體內殺傷B細胞相關腫瘤細胞的過程中,正常B細胞也會被清除。不同於CAR-T療法,NK細胞對腫瘤細胞有天然的識別,它的啟動受啟動型和抑制型NK細胞受體信號傳導的平衡調節。同時,除了能識別腫瘤細胞以外,NK細胞還能夠殺傷細菌、病毒等微生物侵染的細胞。

 

NK細胞療法技術路徑

在量效關係上,NK細胞療法與CAR-T也有所不同。相比CAR-T細胞,NK細胞進入體內以後的擴增能力要小很多,所以可以看到,CAR-T療法沒有太強的量效關係,不同病人的輸注細胞數差異很大,但都能夠保持療效。但是NK細胞就有很明顯的量效關係,由於其擴增量不多,所以一定要向人體內輸入一定的數量級才能殺傷腫瘤。

NK細胞療法比較明顯的優勢在於安全性,它在體內有細胞因數存在的情況下,最多3 周左右的時間即可被清除出體內,從藥物角度來講,肯定是希望治療後藥物可以從病人體內消失。所以NK細胞療法和CAR-T各有優缺點,NK細胞由於不能大量擴增,不會像CAR-T療法一樣易引起細胞因數風暴、神經毒性等嚴重副作用,且NK細胞還可以進行異體移植,不會引起移植物抗宿主反應(GVHD)。因此,NK細胞療法的療效,可能沒有CAR-T這麼持續,但有比CAR-T更好的安全性。如果能進一步提高腫瘤殺傷能力,就普適性細胞藥物來說,NK細胞具有很強的成藥屬性。

 

NK細胞來源廣泛,iPSC衍生NK相較於自體NK有哪些不同和優缺點?

NK細胞療法有很多年的臨床應用歷史了,它可以像間充質細胞MSC一樣拓展很多不同的適應症和患者人群。但是在療效上,很多人都存在質疑,認為其治療效果差異太大,這其中很大的一個問題在於細胞的品質參差不齊。

要怎樣去解決這個品質問題,那就是研發多能幹細胞衍生的NK細胞。它能夠保證不同批次之間的細胞質量穩定性比異體來源或病人自體來源的NK細胞要高。

使用iPSC分化生產NK 細胞具有多方面的優勢。首先, iPSC可以大規模擴增,有利於NK細胞的大量生產存儲,降低生產成本。其次,iPSC衍生的NK細胞在表面受體表達上與成體NK細胞不同,同等劑量下腫瘤殺傷性能更強。同時,相比于原代NK細胞,iPSC更容易進行基因工程化改造,在iPSC階段進行基因修飾,從而製備多元件基因修飾的iNK細胞,滿足不同腫瘤治療的需求。作為現貨型細胞藥物來說,iPSC衍生NK細胞具有很強的成藥性。

所以,iPSC能夠批量生產品質穩定的NK細胞,這是它最大的優勢。批量生產這一優勢意味著,未來NK細胞療法獲批上市後,價格會比較親民,更適合於中國老百姓。

 

iPSC衍生NK細胞

 

在國際上,Fate、Shoreline等公司走在技術的前沿,但走在前沿有一個問題,就是他們目前的技術可能不夠成熟。在臨床試驗中,技術不成熟導致基因修飾以後生產出來的iNK細胞並未達到最優的藥效,這也是我們過去這幾年研發挖掘出來的問題,所以也一直在攻關這些問題。這並不是說iPSC分化生產iNK細胞的方向有問題,而是走在最前面的企業肯定是摸著石頭過河,而我們要吸取經驗教訓,在解決這些問題的基礎上,繼續優化自己的產品。未來出路:通過基因修飾做功能增強型iNK細胞,技術的不成熟導致基因修飾的NK細胞目前還沒有達到預期的功能和效果,所以我們沒有急著去考慮CAR-NK管線,而是首先在解決如何通過基因修飾改造這些NK細胞,從而獲得功能增強型的NK細胞。目前NK細胞存在兩大問題:一是輸注體內後,由於體內沒有足夠的細胞因數幫它維持,因此存續時間不夠長;二是受腫瘤微環境的影響,NK細胞易進入耗竭狀態。所以,我們在研的功能增強型NK細胞會從兩方面切入,一方面是延長它在體內的存續時間,提高其擴增能力,二是保證其在存續的過程中能持續殺傷腫瘤細胞。如果能解決這些問題,NK細胞將能夠保證安全性的前提下,達到更高強度的腫瘤殺傷效果。NK細胞療法相較於CAR-T來說的話,腫瘤殺傷總體強度會低一些,因為NK細胞進入人體後的擴增能力不如T細胞那麼強。但是NK細胞藥物能夠靠劑量來達到同樣的目標。最重要的是,CAR-T的靶向性很強,只能識別CAR靶點,但對於NK 細胞而言,除了CAR靶點以外(CAR-NK),它本身也會識別一系列不同種類的腫瘤細胞,所以NK細胞療法的拓展性會更強一些。

NK 細胞產品很難說和CAR-T一樣實現同樣強大的療效,但是它的應用前景仍很可觀,在足夠的劑量下NK細胞可以充分殺傷病人體內對NK敏感的腫瘤細胞,實現臨床受益的目標。歸根結底,NK細胞就是一款一過性藥物,對於藥物而言能夠達到好的療效是最重要的。

iPSC衍生的NK細胞腫瘤殺傷能力很強,藥效研究中顯示出高於成體供體來源的NK細胞的腫瘤殺傷性能。但是根據文獻和我們自己的研究, iPSC衍生的T細胞,跟我們成人體內的T細胞相比,它的功能還是有差距的。簡單的說,目前從iPSC分化T細胞相關的技術和工藝還不太成熟,還是需要繼續提升的。

iPSC衍生NK細胞療法雖然前景值得期待,但仍然有難題需要攻克。比如,如何保證其品質穩定且能夠規模化生產,如何通過基因修飾增強其殺傷腫瘤的功能和效力,如何解決其在人體內因持續殺傷腫瘤細胞或腫瘤微環境引起的腫瘤細胞殺傷能力下降的問題等。這些難題需要整個行業的持續努力使iNK技術不斷完善成熟,並推出多樣化的產品及治療方案服務于患者。

細胞是人體組成的基本單位,經歷著生長、分化、衰老、凋零的生命週期。身體的疾病和衰老對應著細胞的品質變化。細胞的健康和強盛,為生命注入新的活力。疫情期間,幹細胞在治療新冠肺炎重症患者中發揮了巨大作用。“幹細胞”與“免疫細胞”也成為了細胞治療中的兩大熱點,今天,帶大家瞭解一下,幹細胞與免疫細胞的區別。

幹細胞和免疫細胞的功能不同

我們知道,細胞是構成人體的最小單位,我們的身體中有著200多種不同的細胞,它們相互影響且配合著,各執其職,形成了一個細胞王國。任何一個國家的存在既需要建設者來建造與維護,也需要防衛軍的防護來抵禦外敵。我們身體的細胞王國也是如此。在細胞王國中,幹細胞就是建設與修復者,免疫細胞則是國防部隊中的防衛軍。當我們的人體還在成長時,幹細胞承擔著細胞王國的基礎建設,它們奔赴建設第一線,通過源源不斷的分裂和分化出新的細胞,增加我們身體細胞的種類和數量,最終打造出一個健康的人體。

 

幹細胞是建設者

當有外敵入侵時,如細菌和病毒,免疫細胞就是細胞王國中國防部隊的保衛軍,快速做出反應,將其消滅。如果細胞王國中出現叛變分子,如正常細胞突變為癌細胞,免疫細胞就會啟動安保系統,將其識別並清除。

免疫細胞是防衛者

我們生活在一個充斥著細菌、病毒以及其它有毒有害物質的世界中,身體時刻遭受著看不見的微小生物的攻擊,但依然健康的活著,這都有賴於人體自身的免疫系統發揮了保護作用。免疫系統就像是人體的護衛隊,而組成這支護衛隊的則是免疫細胞,它們一方面發揮著清除細菌、病毒、外來異物的功能;另一方面消除體內衰老細胞以及發生突變的細胞,為健康奠定基礎。

而人體之所以生病,歸根究底是免疫細胞打了敗仗!

被打敗的原因,不僅是敵人的強大,更重要的因素是自身力量的減弱,在人本身一系列的“作死”行為中,免疫系統一步步瓦解了……

但當外敵入侵過多,或內部叛軍太多,免疫細胞沒辦法全部清除時,我們的身體就會生病。不幸的是,當我們不斷變老,體內幹細胞和免疫細胞的數量及活力均會不斷減弱。有了基於幹細胞和免疫細胞的再生醫學技術,為我們的健康保駕護航,免疫細胞,是人體“最好的醫生”,它強你就強

 

分類的不同

幹細胞

由於幹細胞和免疫細胞的功能有所不同,因此它們的分類也有所不同。

如果把人體比喻為一棵樹,深埋大地的種子就是全能幹細胞,可以分化出完整的人體,就如同種子可以發育成長為一顆參天大樹;大樹的主要枝幹可以比喻為多能幹細胞,主要包括亞全能幹細胞和間充質幹細胞,可以分化為神經細胞、心肌細胞、肝細胞、成骨細胞等多系統的功能細胞,就如同每個樹冠能生出的蔥郁的枝椏、樹葉和果實;末端的枝幹是專能幹細胞,如造血幹細胞,只能分化為血液系統的紅細胞、白細胞、血小板等,就如同末端枝幹能生長出樹葉和果實。

 

免疫細胞

目前利用免疫細胞較多應用到臨床的有NK細胞、CIK和最近特別火的CAR-T。NK細胞全稱是Natural Killer cell,又叫自然殺傷細胞,是固有免疫,可以隨時清除體內衰老、變異的細胞,就像是員警,隨時維持社會治安。

CAR-T全稱是Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy,指的是嵌合抗原受體T細胞免疫療法。它是腫瘤蛋白基因修飾的免疫T細胞。在腫瘤細胞被NK細胞和CIK細胞追殺的過程中,有些腫瘤細胞在戰爭中學會偽裝自己,不再被NK和CIK細胞識別。於是就有了CAR-T,可以靶向性殺死這些狡猾偽裝的腫瘤細胞。因此,CAR-T就像是帶走明確任務的特警,能夠徹底殲滅敵人。

 

提取方式的不同

幹細胞

幹細胞可以從多種人體組織中提取。

偉大的科學家發現了間充質幹細胞,也是目前臨床研究中應用廣泛的,其來源可以從臍帶、胎盤、脂肪、牙髓等多種人體組織中提取到。其中,科學家發現我們通常被丟棄的臍帶與胎盤中所提取出的間充質幹細胞是最豐富、最優質的天然來源。

免疫細胞

免疫細胞的來源主要是血液,包括成人的外周血和新生兒的臍帶血。血液中含有大量功能成熟的免疫細胞,在我們的身體內不停迴圈,時刻保護我們的健康。

治療的疾病不同

幹細胞

幹細胞是細胞王國的建設者和修復師,當我們身體的細胞有損傷,需要被替換或修復時,就需要幹細胞發揮治療作用。如皮膚的燒傷、燙傷,再或是肝硬化、糖尿病及其併發症、帕金森等疾病,本質上都是組織器官的細胞受到了損傷,這時就可以回輸幹細胞進行治療。

 

免疫細胞

免疫細胞作為防衛者,主要發揮兩方面的治療作用:

清除衰老細胞,預防疾病,以防止衰老細胞集聚對人體造成傷害,以NK細胞為主,當然定期輸注免疫細胞,可以有效的提高我們的抵抗力,起到預防疾病的作用。癌症治療,輸入體內可以殺死患者體內失控的癌細胞,如CIK細胞和CAR-T細胞。
21世紀是細胞治療的時代,未來幹細胞和免疫細胞的應用將成為臨床治療中的常見手段,適當的補充優質的細胞,為享受未來醫學的發展創造無限可能。

http://caifuhao.eastmoney.com/news/20240316093632518316260

2022年2月,國家癌症中心發佈了最新一期的全國癌症統計資料,從全國682個癌症監測點中遴選487個高品質監測點,覆蓋人口達3.8億,詳盡闡述了2016年中國癌症疾病負擔情況。2022年中美兩國癌症數據:中國新發癌症人數為美國2倍,死亡人數為5倍。

中國作為全球發展中最大國家,隨著經濟飛速發展,人們不良生活習慣和環境污染等因素使得惡性腫瘤發病率與衰亡率均逐年上升,腫瘤已成為威脅國人生命健康首要要素,使得讓腫瘤干預問題面臨嚴峻考驗。

目前傳統干預腫瘤方法包括手術、放療和化療三種,但效果均不盡人意,且對人體會產生不同程度副反應。近年來,隨著生物技術的飛速發展,免疫療法可以說開創了腫瘤治療新紀元。這種“新型”抗癌方式,也讓科學家們爭相投入探索更具潛力的免疫細胞治療中,為癌症免疫治療提供更多可選擇的策略。

自然殺傷細胞(NK細胞)就是其中的一種。它的抗癌廣譜性受到了一眾科學家的追捧,而NK細胞也同樣不負眾望,顯示出良好的腫瘤殺傷效果,基於NK細胞的多種抗癌策略也得到了進一步開發。

近日,學者在《International Journal of Molecular Sciences》發表了綜述,進一步總結了癌症免疫治療和自然殺傷細胞(NK細胞)這一領域的發展概況,幫助人們瞭解這一種細胞在癌症治療領域的潛力與應用。

認識NK細胞

NK細胞,也稱自然殺傷細胞(Natural Killer Cell),來源於骨髓淋巴樣幹細胞,其分化、發育依賴於骨髓及胸腺微環境,主要分佈於骨髓、外周血、肝、脾、肺和淋巴結。NK細胞對幾乎所有常見的癌細胞類型都有殺傷作用,包括肺癌、乳腺癌、肝癌、淋巴癌、食道癌等;對多重耐藥腫瘤細胞同樣具有殺傷作用,被醫學界公認為抗癌衛士。在20年前治療晚期白血病患者過程中,NK細胞介導的免疫療法已成為一種安全有效的療法。隨著時間的推移、醫學研究的深入、醫療技術的發展,有關NK細胞的抗癌研究呈指數增長,成為免疫療法創新的主要領域。

 

NK細胞為何成為抗癌第一防線

NK細胞對癌細胞的殺傷作用具有直接、靈敏、反應速度快等特點。可非特異性直接殺傷腫瘤細胞,這種天然殺傷活性既不需要抗原參與,也不需要抗體參與,且無MHC限制。除了具有強大的殺傷功能外,還具有很強的免疫調節功能,與機體其他多種免疫細胞相互作用,調節機體的免疫狀態和免疫功能。臨床研究發現NK細胞過繼免疫治療惡性腫瘤具有良好的應用前景,對多種實體瘤和血液系統惡性腫瘤均有一定效果。NK細胞遊弋在全身血管行使免疫監視功能,能在第一時間發現並啟動免疫防禦功能,迅速殺死病變、癌變的細胞,因此被醫學界公認為抗癌第一道防線。

 

NK細胞的抗腫瘤效應機制

除了直接誘導細胞毒性外,NK細胞還通過產生促炎性細胞因數(包括IFN和TNF)對轉化細胞作出反應。這些多效性蛋白質除了能夠增強細胞毒性CD8+T細胞反應外,對癌細胞具有強大的抗增殖、抗血管生成和促凋亡作用。NK細胞療法主要有兩種形式:一種是在體內利用患者自身的NK細胞,通過注射抗體或施用檢查點抑制劑來對抗腫瘤;另一種是過繼轉移,即在體外擴增和啟動同種異體來源的NK細胞,然後輸注回患者體內。

 

NK細胞療法的優勢

1.免疫細胞治療是繼手術、化療和放療之後的第四種治療方法。NK細胞治療配合放化療,可以有效清除手術不能完全切除的腫瘤細胞;

2.NK細胞治療聯合放化療,可以提高放化療的療效,降低副作用;

3.對於不適合做手術或者放化療的晚期癌症患者,NK細胞治療是其較好的選擇;

4.術後定期採用NK細胞治療,可以預防癌症的復發和轉移;

5.減緩癌性疼痛,改善睡眠,提高患者生命品質,延長患者的生命週期;

6.亞健康人群,採用NK細胞治療可以降低患癌風險。

與傳統治療方式相比較,NK細胞免疫療法側重利用人體自身的免疫機制,對復發、難治性腫瘤患者表現出突破性療效。

 

NK細胞治療癌症的臨床進展

近年來,已經有許多癌症的治療研究採用了NK細胞。截至2020年6月,NK細胞治療的臨床研究761項,主要分佈在東亞196項、美國213項、北美219項。涵蓋了急性髓系白血病、神經母細胞瘤、惡性膠質瘤、B細胞淋巴瘤、肝癌、、膽管癌等。同時,NK細胞療法也開始成為資本市場競爭的新焦點。例如,全球製藥巨頭企業賽諾菲斥資3.08億歐元加入了NK細胞療法賽道,收購了開發NK細胞療法的生物技術公司Kiadis。20年前,NK細胞介導的免疫療法就被認為是晚期白血病患者的一種安全有效的治療方法。近年來,以NK細胞為基礎的癌症治療領域呈指數級增長,目前已成為免疫治療創新的主要領域。

 

健康人的NK細胞殺傷力更強

正常人每天會新陳代謝數千萬個細胞,健康人的NK細胞免疫功能足夠強大,可以及時清理癌變的細胞。但對於癌症患者來說,一方面,腫瘤的生長阻礙了NK細胞在骨髓內的分化、成熟;另一方面,因為癌細胞的侵害,身體中殘存的NK細胞戰鬥力極弱,普遍存在免疫功能低下、不能有效識別、殺滅癌細胞的情況。所以,健康時的NK細胞比得病時的細胞活性更強、殺傷力更勝一籌。

個體從接觸危險因素到體內出現癌變需要5-20年的時間,在這個期間NK細胞與體內的癌細胞“此消彼長”,不斷“博弈”,發生著對抗。NK細胞隨著時間推移活性、殺傷力和數量會受到癌症的影響不斷下降,癌症中、晚期患者的NK細胞往往已經發生嚴重的受損,無法消滅腫瘤細胞,造成癌症的復發和轉移。

對作為守衛機體健康的NK免疫細胞功能的不斷深入研究,也為治療癌症提供了一個契機——通過細胞工程的方法恢復或者重建NK細胞抗腫瘤的能力,提高NK細胞對腫瘤免疫治療的效果;或通過體外擴增、啟動並儲存健康時的NK細胞,一旦腫瘤發生就可以利用健康的NK細胞來提高腫瘤的治癒率、減少患者的死亡率。未來,隨著在多個腫瘤領域的研究滲透,NK細胞有望給更多的患者帶來新的選擇。

CAR-NK 細胞,有前途的免疫細胞療法【東方財富網】

近年來,創新的免疫療法為血液系統惡性腫瘤的治療提供了新的策略。與傳統的化學療法不同,將T細胞通過基因工程改造,使它們能特異性對腫瘤細胞產生細胞毒性,與之相關的成功案例令人震驚。然而,仍有許多問題——包括療效不足、自體來源不足、副作用大、價格高——從而限制了臨床上的使用。

CAR-NK細胞是一個有希望的替代方案,它具有獨特的細胞毒性和最小的移植物抗宿主病風險。在本文中,我們回顧了CAR-NK 細胞領域的可能來源、開發技術、潛在優勢和面臨的挑戰。嵌合抗原受體工程 T 細胞 (CAR-T) 的免疫療法徹底改變了復發/難治性 B 細胞惡性腫瘤的治療範式。但儘管如此,自體T 細胞的使用仍具有一定的局限性,包括收集的效應T細胞質量的異質性、細胞處理時間較長、可用的CAR細胞數量有限、以及成本高。

考慮到在單倍體造血幹細胞移植和針對實體瘤及血液惡性腫瘤的過繼性細胞療法中的抗腫瘤作用,NK細胞可能是一種有前途的替代品。NK細胞有不同來源,可通過臍帶血、外周血和誘導多能幹細胞技術獲得。它們最大的優勢是可以同種異體應用而不會產生重大的毒副作用。然而,大多數關於CAR-NK細胞的報告都處在臨床前或早期臨床試驗階段。事實上,NK細胞可能更難以設計,需要優化擴增和轉染方案,使其標準化。此外,它們在輸注後的療效的持久性也是一個難題。

隨著利用其細胞溶解能力、抗體依賴性細胞毒性 (ADCC) 和細胞因數誘導製造CAR-NK細胞的最新進展,“現貨”同種異體CAR-NK細胞有望在癌症治療中大放異彩。

NK細胞生物學

豐富的受體和免疫自我耐受與免疫監視之間的平衡

自然殺傷 (NK) 細胞是一種特定類型的淋巴細胞,被認為是先天免疫的一部分,占淋巴細胞總數的10%至15%。它們在惡性細胞和病毒感染細胞的免疫監視中起著至關重要的作用 [1]。NK 細胞主要通過細胞毒性發揮作用:通過分泌穿孔素/顆粒酶以產生“天然”的細胞毒性誘導細胞凋亡,以及 FasL(Fas 受體的配體,或CD95,腫瘤壞死因數)或TRAIL等因數的表達(TNF相關的凋亡誘導配體),通過啟動死亡受體誘導細胞凋亡;還有由 Fc 受體 CD16 (FcRIII) 介導的抗體依賴性細胞毒性 (ADCC)。

此外,NK細胞產生許多細胞因數,最顯著的是干擾素和TNF。由於其卓越的裂解能力,以一種不依賴抗原的方式進行預啟動,所以引起不良反應的概率較低。事實上,NK細胞的活性是由啟動和抑制信號的複雜整合來調節的——是它們表面上的眾多受體與靶細胞表面上的不同配體之間相互作用的總和(圖1)。

NK細胞有兩個亞群組成,CD56 dim 和 CD56 bright NK 細胞,由其CD56的表達強度而定義。CD56 dim細胞約占血液NK細胞的90%,具有很強的細胞毒性,主要表達CD16。CD56 bright NK 細胞占迴圈血液中NK細胞的 10%,但主要存在於淋巴結和一些其他器官中,它們的CD16表達較低,細胞毒性能力低於 CD56 dim,但具有強大的增殖潛力。這些特性和功能上的差異對於增強NK細胞在細胞治療中的使用和操作非常重要。

 

同種異體NK細胞

在單倍體幹細胞移植中的抗白血病作用

無論使用何種化療或放療方案,許多血液系統惡性腫瘤僅靠化療和放療仍是無法治癒的。同種異體造血幹細胞移植(HSCT)是當今大量血液癌症的唯一治癒選擇。在同種異體HSCT中,主要目標是用同種異體供體的正常造血功能對患者的免疫系統進行代替。供體對受體的免疫系統反應稱為移植反應。這種反應,簡稱 GvL,表示移植物抗白血病/淋巴瘤,能夠消除患者體內殘留的惡性細胞,並在較長時間內控制血液惡性腫瘤。這種理論上理想的解決方案的主要挫折是嚴重的副作用:移植物抗宿主病(GVHD)。供體的免疫系統——本質上是同種異體反應性T淋巴細胞——攻擊宿主的健康組織(尤其是皮膚、消化道、肝臟和肺,但任何器官都可能受到影響)。為了限制嚴重 GVHD 的風險,大多數同種異體 HSCT 是由 HLA 相同的供體進行的,因此供體和受體之間的 HLA 需完全匹配。

在這種特殊情況下,可以考慮啟動來自供體的單倍體NK細胞。事實上,受體白血病細胞表面的某些I類HLA分子(=KIR配體)可能不被供體NK細胞上的抑制性KIR受體識別。這種現象被稱為 GVL NK效應,由 KIR/KIR配體錯配介導。

這一概念已在先前的研究中報導,通過這種錯配來發揮抗白血病作用,尤其是在 AML 環境中移植了半相合供體的患者中[7,8]。然而,同種異體 HSCT 後同種異體反應性 NK 細胞的這種抗白血病作用是有爭議的,一些研究顯示出相互矛盾的結果。毫無疑問,具有重要可塑性的 NK 細胞會適應其環境或存在移植後成熟延遲,從而降低其效力和細胞毒性 [9,10]。儘管如此,即使NK細胞的體內作用不如T細胞的作用那樣得到了充分證明,但自1990年代後期以來,半相合HSCT的發展有助於闡明這一特定淋巴細胞群,並進一步利用它具有巨大的抗腫瘤細胞毒性的潛力 [11,12]。

 

CAR-T免疫療法

迄今為止,同種異體 HSCT 是最古老和最常用的抗白血病免疫療法。然而,它確實構成了一種激進的(接受者的免疫系統被破壞並被捐贈者的免疫系統取代)、非特異性、非靶向免疫療法,這解釋了它的主要毒性——尤其是GVHD風險,在中斷細胞移植後數月或數年對患者的免疫系統仍有持續影響。嵌合抗原受體 (CAR) T 細胞的發展以前所未有的方式徹底改變了細胞抗腫瘤免疫療法 [13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19]。

CAR是一種將常規T細胞,經過基因工程改造以表達靶向抗原的特定受體。這種嵌合受體由能夠特異性識別靶細胞上抗原的免疫球蛋白 (scFy) 的細胞外單鏈可變片段、跨膜結構域和用於信號傳導的細胞內結構域組成,由細胞質 CD3 信號傳導組成使 CAR 的啟動獨立於 pMHC(第一代 CAR)的結構域,其中注入 CD28或4-1BB共刺激結構域以增強機械轉導(第二代CAR),或結合兩者(第三代 CAR)或與另一個轉基因相關的單個共刺激結構域以提高細胞因數的表達,從而促進 CAR-T 細胞效應器能力(第四代)。EMA(歐洲食品與藥品監督管理局) 已批准在R/R DLBCL[20] 中使用axicabtagene ciloleucel和 tisagenlecleucel,以及在患有B-ALL的年輕成人中使用 tisagenlecleucel。其他自體抗CD19或抗BCMA CAR-T細胞可早期用於成人ALL、濾泡性NHL和骨髓瘤。

 

通過這些創新的新療法,可以觀察到40-60%的患者的長期反應,這些患者的中位總生存期通常約為6個月,從而徹底改變了這些難治復發性血液系統惡性腫瘤的治療格局 [21 , 22 , 23]。然而,CAR-T療法在使用上仍面臨諸多障礙和實際問題[24]。

(1)CAR-T細胞是從患者自身的自體細胞發展而來的,在淋巴采血過程中收集到的T淋巴細胞的品質以及獲得的產品的異質性(如效應能力、活力、擴增能力、T細胞衰老和耗竭),本質上是由之前的治療引起的,也是患者的免疫系統狀態所致;

(2)從收集到生產過程的這些障礙使製造過程費力、漫長且非常昂貴;如今,在美國,單個B 細胞淋巴瘤患者的 CAR-T 細胞治療費用平均為 373,000 美元。Prime Therapeutics 使用真實資料進行的一項新研究發現,總成本平均超過 700,000 美元,在某些情況下,CAR-T移植後續費用可能超過 100 萬美元。在法國,在社會保險涵蓋CAR—T手術的全部費用的情況下,CAR-T 治療的價格約為 350,000 歐元,不包括住院和輔助治療的價格。CAR-T 細胞的生產和輸注之間的延遲可能達到2個月,這對於患有難治性不受控制的血液系統惡性腫瘤的患者來說太長了。

(3)此外,注射的抗CD19 CAR-T細胞有其自身的毒性造成的副作用——最常見的是炎症與細胞因數釋放綜合征 (CRS) 或神經和血液損傷(例如,血細胞減少症,有時可能持續存在)的發展有關。最後,CAR-T治療後抗原靶點的丟失是一個重要的復發原因,尤其是在CD19 B ALL中[25]。

其他基因改造——例如TCR抑制或引入自殺基因——是必要的;一些研究人員甚至嘗試使用沒有排斥或GVHD的雙陰性CAR-T 細胞 (CD4-CD8-) [26]。一些臨床研究正在進行中,以測試這些同種異體CAR-T 細胞(主要用於 B 型惡性腫瘤)與通常的氟達拉濱-環磷醯胺 (FluCy) 淋巴耗竭,其中添加了阿侖單抗以降低免疫排斥的風險。該工藝增加了CAR的毒性特徵,卻隨之增加了免疫抑制甚至長期發育不全的風險。在 UCART19 小組最近的一項試驗中,在使用或不使用阿侖單抗的FluCy調理後,將基因組編輯的、供體來源的同種異體抗CD19 CAR-T細胞給予患有難治性 B-ALL的成人和兒童。只有接受阿侖單抗的患者表現出擴張和抗白血病活性,輸注後28天的CR率為67%,但主要代價是高毒性[27]。今天,同種異體CAR-T細胞最常見的用途是作為同種異體 HSCT 的橋接——尤其是在AML和髓系腫瘤中。

CAR-NK細胞免疫療法

NK細胞的活性完全獨立於抗原和HLA;它們可以從不相關的同種異體HLA不相容的供體中獲得。供體NK細胞和受體腫瘤細胞之間的這種HLA不相容性可通過 KIR/KIR 配體錯配促進NK細胞的抗腫瘤同種異體反應(見第1節)。有趣的是,與同種異體T細胞不同,NK細胞不會引起任何GVHD。這種現象的原因尚不完全清楚,但啟動劑受體可能是關鍵。健康的非應激(例如,皮膚、消化道)宿主組織在其表面上不存在應激誘導的配體,從而使它們免受NK細胞毒性的影響。在 HLA不相容的小鼠HSCT模型中,供體NK細胞甚至通過破壞受體的抗原呈遞細胞對GVHD發揮保護作用。這種對接受者免疫系統的影響可以促進移植並使同種異體NK細胞不易受到免疫排斥的影響。

“現貨”的同種異體NK細胞在從實驗室到床旁的效率,以及成本方面呈現出巨大的優勢 [24 , 28 , 29] (表1 )。儘管CAR-NK細胞具有所有這些優勢,但仍存在一些局限。

(1)首先,它們在體內的存活時間相對較短,約為1-4周。在難治性AML患者的家族性半相合供體的短期(12-16 小時)IL-2 啟動 CD3-CD56+NK細胞的臨床試驗中,表明用氟達拉濱和環磷醯胺清除淋巴對NK細胞的擴增至關重要,並且IL-15的存在是擴增和臨床反應的預測因素 [30]。NK細胞的體內擴增也需要體內施用IL-2,具有顯著的毒性作用。在CAR-NK細胞的構建中加入細胞因數轉基因(如 IL-2 和 IL-15)具有改善擴增效率和持久性的潛力 [28]。

(2)其次,血液中數量有限的NK細胞需要離體擴增技術,以便在收穫後使用單采術獲得必要的劑量。已經研究了用於離體擴增和啟動NK細胞的不同方法。這些方法包括用細胞因數(主要是 IL15 和 IL2)培養數天(通常為14 天)。IL-2是必不可少的,目前用於促進同種異體NK細胞遞送後的NK細胞擴增,而IL-15在NK細胞發育和體內平衡中起關鍵作用。一些報導中使用飼養細胞如Jurkat T淋巴母細胞或Epstein-Barr病毒轉化的淋巴母細胞系 (EBV-LCL) 大規模擴增NK細胞。K562 是一種白血病細胞系,經過基因改造,可表達膜結合形式的IL-15和4-1BB(CD137L)。最近,K562 細胞已被設計為表達膜結合的IL-21和CD137L,展示了一些有趣的結果。

關於哪種方法最適合NK 細胞的高效擴增仍然存在爭議,有研究發現K562飼養細胞能夠誘導強勁和持續的增殖(培養3至5周後擴增100至 >10,000倍)[31]。

(3)第三,NK細胞改造有一定難度,對細胞凋亡高度敏感且基因表達水準低。目前,將基因引入NK細胞的最成功的替代方法是通過電穿孔快速暫態表達,或通過病毒載體持續但低表達。因此,轉染方案的優化仍然是開發CAR-NK療法的一個重要因素 [32]。最近,在離體擴增環境中對原代人自然殺傷細胞的慢病毒轉導進行了改進。優化基因工程NK細胞方法將促進CAR-NK細胞的廣泛應用 [33]。

(4)最後,腫瘤微環境 (TME) 降低了血液惡性腫瘤中NK細胞的代謝活性,構成了增強NK細胞抗腫瘤作用的重要障礙[34,35]。與摻入IL-15的方式相同,使用編碼趨化因數受體的轉基因可以促進CAR-NK在腫瘤部位的運輸。與抗PD1/抗PDL1等檢查點抑制劑聯合使用有助於克服TME的抑制作用,從而釋放CAR-NK細胞的全部潛力。這種效果在小鼠模型的臨床前研究中似乎是成功的,但仍需要在患者的臨床研究中得到證明 [36 ,37,38]。還需要注意的是,關於被CAR細胞阻斷的檢查點的大部分數據都來自CAR-T細胞的經驗,而對CAR-NK細胞的經驗很少。

 

CAR-NK細胞的來源

同種異體CAR-NK細胞的一個主要優勢是隨用隨取,這依賴於良好的凍存工藝,隨後才有可能從特定的細胞源產生大量的同質批次。許多NK細胞來源已被用於生產同種異體CAR-NK細胞。

 

NK-92細胞系

NK-92是一種白細胞介素2依賴性、EBV 陽性自然殺傷細胞系,來源於一名患有快速進展性非霍奇金淋巴瘤的 50 歲白人男性的外周血單核細胞,它們具有高度細胞毒性。它們的表型包括啟動受體 NKp30、NKp46和NKG2D。有趣的是,NK-92表面上唯一的抑制性受體由 ILT2、CD94-NKG2A(識別HLA-E)和表達水準較低的抑制性KIR受體KIR2DL4代表。它們的使用非常方便,因為理論上可以批量生產和“無限”生成CAR-NK細胞,在細胞數量、時間和成本方面都有巨大的收益。不過由於它們的腫瘤性質,這些源自NK-92細胞系的CAR-NK細胞需要在注射前進行照射,從而改變它們的壽命和分裂。儘管受到照射,它們似乎保留了它們的細胞毒能力,但它們的體內增殖能力發生了急劇變化,注射後7天內消失,需要多次注射。

在三名淋巴清除化療後復發和難治性AML患者中,已經報導了在人類患者中使用CAR-NK細胞的一些證據,這些患者的 CD33-CAR-NK 細胞來源於 NK-92細胞系[39]。這三名患者接受了挽救性化療,然後以增加的劑量注入抗 CD33 CAR-NK細胞(每位患者使用三個遞增劑量的輻照 CAR-NK-92細胞)。每名患者安全應用多達 5×109個 CD33-CAR-NK 細胞,沒有明顯的副作用或3-4級毒性;只報告了短暫的發燒。然而,即使治療耐受性良好並且重複輸注的安全性得到證實,所獲得的療效反應也非常短暫,一名患者只有10天,另一名患者最多4個月 [39]。

在體外,慢病毒CD33-CAR載體在NK-92細胞中的效率遠高於90%,但細胞毒性試驗表明,與親代NK-92細胞相比,對人 HL-60早幼粒細胞白血病細胞系的細胞毒性適度增強[39]。CAR-NK-92細胞也已針對多發性骨髓瘤細胞進行了探索。江等人報導了用抗 CD38 轉導的NK-92細胞在體外以及在異種移植 NOD-SCID 小鼠模型中,對骨髓瘤細胞系和原發性骨髓瘤細胞具有很強的抗腫瘤活性 [40],用表達抗 CS1/SLAMF7 CAR的NK-92 細胞觀察到類似的結果 [41]。

為了提高源自NK-92細胞系的CAR-NK細胞的效率,最初用於T 細胞的第4代CAR在一個名為 UniCAR 的平臺上生產。UniCAR 系統由兩個元素組成:

 

(i)針對肽表位 E5B9 的 CAR-NKG2——一種非天然在細胞表面表達的抗原;

(ii) 稱為目的模組 (TM) 的雙特異性組件。這種雙特異性模組在一側表達 E5B9 抗原,另一側表達對腫瘤抗原特異的抗體(圖 2)。該構建體使 CAR-NKG2 細胞(通過E5B9抗原)和靶細胞(通過特異性抗體)之間能夠接觸。除此之外,效果可以立即停止(開/關效果),因為 TM 的壽命很短。一旦停止TM的穩定(連續)輸注,TM就會被淘汰,UniCAR也會失活。事實上,該系統通過改變可以同時或以順序方式給予的TMs來實現大量腫瘤抗體的靶向選擇 [42]。

源自臍帶血的 NK 細胞

臍帶血是NK細胞的豐富而有趣的來源,因為國際血庫有數十萬個臍帶血 (UCB) 單位可供使用。NK細胞占臍帶淋巴細胞的15%至 30%。它們的表型比成人外周血細胞的表型更不成熟,具有非常特殊的特徵,包括低CD16(低ADCC能力)、CD56 bright(比細胞毒性更具有增殖能力)、NKG2A+(一種抑制性受體,識別 HLA-E)和低 KIR(功能比其對應物少)[43]。然而,這些限制可以通過使用細胞因數和轉染的離體擴增和啟動來克服,並且根據筆者的經驗,與來自血細胞的 CAR-NK 相比,來自臍帶血的 CAR-NK 細胞在流式細胞術中觀察到具有相同的啟動特徵。即使 UCB 中的 NK 細胞或多或少稀少,它們也具有非常重要的增殖能力,並且對細胞因數刺激非常敏感,可以進行離體擴增。

由 Tezvani 等人帶領的 MD Anderson 團隊。最近發表了一項非常令人鼓舞的 I/II 期臨床試驗,該試驗在 11 名患有復發性難治性 B 細胞惡性腫瘤(從非霍奇金淋巴瘤到慢性淋巴細胞白血病)的患者中注射來自新鮮 UCB 的CAR-NK-CD19 細胞(ClinicalTrials.gov ,NCT03056339)(圖3)。用研究中使用的三種劑量之一(1×105、1×106或1×107每公斤細胞數)在淋巴清除化療(氟達拉濱和環磷醯胺)後。

值得注意的是,UCB NK細胞輸注後沒有注意到不良反應或毒性,特別是CRS 或神經毒性,試驗中未達到最大耐受劑量。反應在注射後的第一個月迅速出現,在11名受試者中,有7名患者完全緩解,並在 Richter 轉化中恢復到CLL狀態。儘管如此,重要的是要展示一個事實,即一半的患者在注射NK細胞後接受了維持治療,由來那度胺、利妥昔單抗、維奈托克或HSCT組成的綜合方案。在注射後長達12個月內檢測到NK細胞。最有可能的是,在 CAR結構中添加IL-15基因有助於CAR-NK細胞的長期存活,儘管持久性機制尚未闡明。

此外,一個可能且非常重要的技術挫折是直接從新鮮UCB生產 CAR-NK細胞,以及在生產後立即注射,沒有任何凍存步驟。事實上,由於從冷凍保存的細胞中選擇NK細胞的效率低,可能不應該推薦使用來自國際銀行的冷凍保存的臍帶血來生產CAR-NK細胞。根據 MD Anderson 團隊的經驗,從新鮮臍帶血中擴增可能是一種選擇——或者更確切地說,建立選定的冷凍保存的NK細胞庫,這些細胞可以解凍和擴增以進行轉導。還應注意的是,CAR-NK細胞在冷凍保存後活性有所降低,在目前的技術條件下,CAR-NK細胞應在培養後立即給藥。即使CAR-NK細胞的具體長期療效難以評估,並且該工藝在冷凍細胞上的可行性尚待確定,但結果非常有希望[44]。

來自外周血的NK細胞

如前所述,大多數採用過繼性NK療法(不包括CAR-NK細胞)的研究都使用了來自單倍體相關或不相關供體的細胞,並已在兒童和成人AML中顯示出抗腫瘤反應 [29,46]。然而,缺點是需要從健康的成年志願者那裡收集細胞,這使得該過程比使用UCB稍微複雜一些。在細胞因數存在的情況下,一些簡單的、符合GMP的培養條件可以將它們的擴增提高25-55倍 [49]。如果來自PB的NK細胞與CB NK細胞相比具有高細胞毒性,那麼在CAR-NK療法的背景下,供體在HLA不相容性方面的選擇是否應該有所不同仍有待證明。

Leivas 等人的團隊描述了一種可以使用和衍生自PBMC的方法[53]。在活化和擴增的NK細胞 (NKAE) 和記憶T細胞 (CD45RA-T 細胞) 之間選擇效應細胞。NK或T細胞在與NKG2D-4-1BB-CD3z-CAR 載體一起培養後轉導,使用在NK和T細胞上表達的 NKG2D 啟動劑受體,以及用於轉導的4-1BB(見上文)。NKG2D 具有特定的配體,包括 MICA、MICB 和 ULBP,它們在應激細胞和許多腫瘤細胞上表達,特別是在多發性骨髓瘤中。在體外,記憶T細胞的轉導比其NK對應物更穩定。然而,CAR-NKAE細胞在體外對MM細胞表現出更強的細胞毒性,同時保護健康細胞免受損傷。此外,在他們的小鼠異種移植骨髓瘤模型中,與T細胞相比,CAR-NKAE細胞表現出高效的細胞毒性和增強的抗骨髓瘤活性。

另一種方法是使用 Cas9/RNP 和腺相關病毒基因遞送的 CRISPR 靶向 CAR 基因插入。使用這種技術,產生了具有不同跨膜和信號結構域(CD4/4-1BB+CD3 和 NKG2D/2B4+CD3)的靶向 CD33 的CAR-NK,並且似乎在原代NK細胞中顯示出增強的抗 AML活性 [54]。

源自 iPSC 的 NK 細胞

誘導多能幹細胞 (iPSC) 是經過基因重程式設計成為多能幹細胞的分化細胞。成熟分化細胞重程式設計為 iPSC 的過程包括對細胞進行基因改造,使其表達四種基因:Klf4、C- myc、Oct3/4和Sox2,從而具有與胚胎幹細胞相同的特徵。 因此,分化的成人重程式設計細胞獲得了無限增殖的潛力,並且在加入特定生長因數後可以分化成任何細胞類型,這使得它在許多醫學領域都有用武之地——特別是再生醫學、細胞療法或遺傳病的模型化。這一發現獲得了 2012 年諾貝爾醫學獎,授予神戶大學(日本)研究員山中伸也 [55]。

由於它們的永生特性,單個iPSC足以生產和生成通用的 CAR-NK“現貨”產品。由iPSC產生的NK細胞具有不成熟的表型,具有低CD16、高 NKG2A和低KIR,具有較差的細胞毒性,但具有非常重要的增殖能力。為了增強它們的細胞毒性並使其持久存在,可以添加用於表達CD16 和 IL-15 或 IL-2的基因 [56, 57]。

FT596產品是第一個“即用型”、通用和同種異體CAR-NK細胞產品,源自iPSC技術,並且已經獲准在美國用於臨床研究 [58]。它由針對NK細胞優化的抗CD19 CAR組成,具有啟動劑受體 NKG2D的跨膜結構域、2B4共刺激結構域和 CD3 信號傳導結構域。添加了兩個關鍵成分:

(i) 一種新型、高親和力、不可切割的 CD16 Fc 受體 (hnCD16),可在沒有負調控的情況下實現腫瘤靶向和增強抗體依賴性細胞毒性,並結合靶向治療性單克隆抗體腫瘤細胞;

(ii) 促進細胞因數非依賴性持久性的 IL-15/IL-15 受體融合蛋白 (IL-15RF)(圖 4)。當與利妥昔單抗(抗CD20)等單克隆抗體聯合使用時,FT596的hnCD16 Fc受體與覆蓋腫瘤細胞的單克隆抗體的Fc部分結合,啟動NK細胞,分泌細胞因數,增強ADCC。IL-15RF促進NK細胞和活化的抗腫瘤 T 細胞的細胞毒性。

ASH 2020期間的一份通訊報導了一名76歲女性在接受八線治療(包括 ASCT、自體過繼 T 細胞治療和活化的半相合NK細胞)後復發難治性 DLBCL 的病例 [59]。

該患者在淋巴清除單藥治療後接受了獨特劑量的30×106 FT596 細胞。除了中性粒細胞減少症外,沒有報告與FT596細胞相關的副作用。在1個月閾值的腫瘤反應評估顯示基於 2014 Lugano 標準的部分反應,18 F-Glu 吸收減少超過70%,腫瘤大小減少超過 50%。該患者的第二劑 FT596 正在進行中。一項 I 期研究也在進行中,估計有 285 名患者入組(clinicaltrials.gov:NCT04245722)。

結論

同種異體 CAR-NK 細胞提供了許多有趣的視角,可以解決使用自體CAR-T細胞所面臨的一些問題。迄今為止,同種異體NK細胞面臨的主要挫折是它們相對較短的作用持續時間,以及缺乏標準化工藝。與CAR-T細胞相比,CAR-NK細胞療法在很大程度上屬於起步階段;截至2022年5月1日,共有35項試驗涉及CAR-NK細胞,與臨床試驗網站上涉及CAR-T細胞療法的1181項試驗相比,證實了這種創新療法的資料較少。CAR-NK細胞療法在抗擊癌症方面具有廣闊的前景,但仍需更多研究加以論證。

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在人體微觀世界中,免疫細胞有數以億計,它們日夜巡邏、偵察、戰鬥,守護健康不受病原體侵犯。免疫細胞包括淋巴細胞、單核細胞、巨噬細胞、粒細胞等,各有獨特功能,共同構成精密網路,時刻準備對抗病原體。淋巴細胞中的T細胞直接對抗病原體,B細胞生產抗體清除病原體。單核細胞和巨噬細胞如清潔工人,吞噬清除體內垃圾和病原體。粒細胞如快速反應部隊,短時間內集結攻擊病原體。

 

免疫細胞到底有多重要

免疫細胞,作為我們身體內部的超級英雄,擁有獨特的識別能力,能夠精確區分自身細胞和外來病原體。當病原體侵入人體時,免疫細胞會迅速啟動,通過其表面的受體與病原體上的特定分子結合,從而啟動免疫應答。這一過程中,免疫細胞會釋放出各種生物活性物質,如細胞因數、趨化因數等,以協調身體的免疫反應。想像一下,當流感病毒侵入人體時,免疫細胞會立即展開行動。樹突狀細胞會作為“哨兵”發現並捕獲病毒,然後將其呈遞給T細胞。

T細胞一旦識別到病毒的存在,就會迅速增殖並分化為效應T細胞。這些效應T細胞會釋放出大量的細胞因數,如干擾素等,以抑制病毒的複製。同時,B細胞也會開始生產特異性抗體,這些抗體能夠與病毒結合,使其失去活性。最終,在免疫細胞的協同作戰下,流感病毒被徹底清除。

免疫細胞的重要性不僅在於其對抗病原體的能力,更在於其維護身體內部穩定的作用。它們能夠清除體內的壞死細胞、毒素和垃圾,保持內環境的平衡。同時,免疫細胞還能夠調節免疫反應的強度和時間,避免過度反應導致的組織損傷。

 

免疫細胞的戰鬥現場揭秘

免疫細胞在抗擊病原體和癌症中扮演關鍵角色。

巨噬細胞首當其衝,吞噬並清除病原體,啟動其他免疫細胞。中性粒細胞迅速回應,猛烈攻擊病原體。T細胞和B細胞隨後發揮核心作用,T細胞直接攻擊病原體並增強其他細胞功能,B細胞生產特異性抗體清除病原體。即使在癌症面前,免疫細胞同樣展現出了驚人的戰鬥力。特別是細胞毒性T淋巴細胞(CTL)和自然殺傷細胞(NK細胞),它們能夠直接識別和消滅癌症細胞。CTL通過與癌症細胞表面的抗原結合並釋放穿孔素等物質,導致癌症細胞死亡。而NK細胞則能夠通過釋放細胞因數來誘導癌症細胞凋亡。

比如,一項由王磊研究員團隊所進行的研究表明,CTL在識別癌症細胞表面的特定抗原後,通過釋放顆粒酶B和穿孔素等效應分子,直接誘導癌症細胞凋亡。此外,研究還發現NK細胞能夠通過釋放IFN-等細胞因數,增強CTL的抗腫瘤活性,進一步證實了免疫細胞在癌症免疫治療中的重要作用。[1]

此外,免疫細胞之間的協同作用也是抗擊癌症的關鍵。例如,巨噬細胞能夠吞噬並清除壞死的癌症細胞,為其他免疫細胞創造更有利的戰鬥環境。同時,樹突狀細胞還能夠啟動T細胞並引導其攻擊癌症細胞。

免疫細胞還是位擅走平衡木的舞者

免疫細胞的調控與平衡是一門精妙的藝術,它們需要在保護身體免受病原體侵害的同時,避免對自身組織造成損傷。這種特質在應對自身免疫性疾病上體現的很突出。免疫細胞的調控主要依賴於一系列複雜的信號轉導途徑。當免疫細胞受到刺激時,會觸發一系列的信號轉導反應,最終導致免疫細胞的活化或抑制。這些信號轉導途徑受到多種因素的調控,包括細胞因數、激素、神經遞質等。自身免疫性疾病是一類由於免疫系統錯誤地攻擊自身組織而導致的疾病。例如,類風濕性關節炎就是一種典型的自身免疫性疾病。在這種情況下,免疫細胞會錯誤地攻擊關節組織,導致關節炎症和疼痛。為了治療這種疾病,科學家們正在研究如何通過調節免疫細胞的信號轉導途徑來恢復免疫平衡。

另一方面,免疫缺陷病則是由於免疫細胞功能低下或數量不足導致的。這類疾病患者往往容易感染各種病原體,甚至一些常見的病毒也可能對他們造成致命威脅。因此,保持免疫細胞的平衡和穩定至關重要。

王強教授的研究團隊在一項關於免疫缺陷病的研究中就指出,通過基因工程手段增強免疫細胞的功能或提高免疫細胞的數量,是治療免疫缺陷病的有效策略。同時,他們還發現了一些與免疫細胞功能相關的關鍵基因,為未來的免疫治療提供了新的靶點[2]。

 

免疫細胞的未來方向

隨著科學技術的不斷進步,我們對免疫細胞的研究也越來越深入。未來,我們有望通過基因編輯、細胞治療等技術手段來增強免疫細胞的功能或修復受損的免疫細胞。在最近的一項研究中,有醫學團隊利用CRISPR-Cas9基因編輯技術成功地對T細胞進行了改造,使其能夠分泌特定的抗腫瘤因數。這一創新性的方法不僅增強了T細胞對癌細胞的殺傷力,還為癌症的免疫治療開闢了新的路徑[3]。

免疫細胞研究的深入有望帶來精准、高效疫苗,更準確地模擬病原體抗原,激發強烈免疫反應。同時,調節免疫細胞信號轉導途徑或為自身免疫性疾病和免疫缺陷病治療提供新藥物。

科技進步讓免疫細胞成為探索健康的“超級武器”,對抗耐藥細菌和調控過敏反應,展現驚人多樣性與複雜性,如同訓練有素的超級英雄捍衛健康。未來,基因編輯、細胞治療等前沿技術將推動免疫細胞治療為更多疾病提供新思路。精准調控免疫細胞消滅癌症、自身免疫性疾病等,人類將邁向全新健康時代。

同時,我們也要意識到,免疫細胞的強大力量並非萬能。保持健康的生活方式、均衡的飲食、適量的運動以及良好的心態同樣至關重要。只有當我們內外兼修,才能真正實現健康與長壽。

 

參考文獻:

[1] 王磊,等.細胞毒性T淋巴細胞和自然殺傷細胞在癌症免疫治療中的研究進展.《中國免疫學雜誌》, 2021, 37(5): 629-634.

[2] 王強,等.免疫缺陷病的基因治療策略及關鍵基因研究進展.《中華醫學遺傳學雜誌》, 2021, 38(5): 605-610.

[3] 劉勇,等.利用CRISPR-Cas9技術改造T細胞分泌抗腫瘤因數的研究.《中國科學: 生命科學》, 2023, 53(2): 142-151.

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在全球範圍內,癌症都是死亡的主要原因之一,每年約有1000萬人因癌症而死亡。雖然免疫療法方面的研究已經取得了巨大進展,但仍然有很大一部分癌症患者對這些治療存在原發性或繼發性耐藥。將自然殺傷細胞(NK細胞)與T細胞不同,它們可以逃避免疫排斥並且不會誘發細胞因數風暴,因此NK細胞成為了癌症免疫治療劑的優質候選者。不過,要將NK細胞應用于高效的腫瘤治療,還有許多問題需要解決。

來自法國Innate Pharma公司的研究人員及其合作者在《The Journal of experimental medicine》發表了題為“Bringing natural killer cells to the clinic”的文章,重點介紹了增強NK細胞抗腫瘤作用的方法,並為完善癌症免疫療法提出了策略。

NK細胞是先天性淋巴細胞,成熟後就會在外周血中迴圈,扮演著體內巡邏兵的角色,另外,它也可能變成組織駐留的NK細胞。NK細胞也是細胞毒性效應細胞,它可以識別和裂解應激細胞,例如腫瘤細胞。NK細胞在行使功能時,會受到一系列抑制性和啟動性受體的嚴格調節,使它們能夠在殺死腫瘤細胞的同時不傷害正常細胞。腫瘤細胞可能會出現HLA I類分子表達的減少,NK細胞可以據此將它們識別為優先靶標。NK細胞表達HLA I類特異性抑制性受體,例如殺傷細胞Ig樣受體(KIR)和NKG2A,可阻斷其針對HLA I+類細胞的效應功能。

此外,NK細胞效應功能的觸發還需要啟動NK細胞受體,來識別腫瘤細胞膜上表達的配體。大多數成熟的NK細胞還表達CD16a(FcRIIIA),這是一種IgG Fc區的低親和力受體,可能有助於抗腫瘤抗原IgG1 mAb的治療。

 

NK細胞有哪些作為抗癌能手的特性呢?

它們能夠殺死缺乏HLA I類分子而被T細胞忽略的腫瘤細胞;

它們不需要提前進行抗原特異性致敏就能發揮效應功能;

它們不會導致移植物抗宿主病(GvHD);

在識別靶標時,NK細胞可分泌促炎細胞因數,例如具有直接抗腫瘤作用的IFN-和TNF-,還可分泌趨化因數(CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、XCL1和IL-8)以及生長因數(FLT3配體和GM-CSF),它們有助於適應性免疫反應的發生、定向和維持。

在癌症患者中利用NK細胞具有雙重優勢:誘導腫瘤細胞殺傷、參與針對腫瘤細胞的多細胞免疫反應。NK細胞的抗腫瘤功能已經在體外使用人細胞,並在小鼠體內對所有組織型的腫瘤細胞進行了證明。從這些研究中可觀察到,患者的臨床預後與腫瘤床的NK細胞浸潤或外周NK細胞的細胞毒性之間存在相關性。

在過去二十年中,人們開發了各種方法來利用NK細胞控制腫瘤的生長。臨床研究表明,輸注NK細胞的免疫療法是安全的,在造血惡性腫瘤的臨床前或臨床研究中取得了令人鼓舞的結果。

 

增強NK細胞抗腫瘤反應的方法

雖然NK細胞已經很強大了,但是為了更高效更安全地抗擊癌症,科學家們想出了種種策略來給它“上裝備”:

 

CAR-NK細胞療法

NK細胞輸注是第一個針對癌症患者開發的NK細胞治療方法。第一個臨床試驗是基於細胞因數啟動的自體NK細胞,但其臨床療效並不令人滿意。隨後,其他造血系統疾病和實體瘤與化療相結合的臨床試驗表明,同種異體NK細胞輸注是安全的,並且在某些情況下也是有效的。

NK細胞的單打獨鬥也許有些不盡如人意,可以找個幫手嗎?嵌合抗原受體(CAR)-T細胞治療急性淋巴細胞白血病和非霍奇金淋巴瘤的成功可謂打開了新世界的大門。

經過各個研究團隊的努力,CAR-NK細胞擁有了豐富的來源,例如永生化細胞系(NK-92)、外周血單核細胞、臍帶血、造血幹細胞和祖細胞以及誘導多能幹細胞(iPSC)。

近年,HLA錯配的抗CD19 CAR-NK細胞在非霍奇金淋巴瘤和慢性淋巴細胞白血病的1/2期試驗中顯示出顯著的臨床療效。iPSC衍生的抗CD19 CAR-NK細胞在復發/難治性B細胞淋巴瘤的1/2期臨床試驗中也表現出令人鼓舞的結果。

 

2.CIML NK細胞療法

將細胞因數啟動與IL-12、IL-15和IL-18組合,用於誘導NK細胞的體外擴增,可使其獲得強大的細胞毒性特性,這些NK細胞稱為細胞因數誘導的記憶樣(CIML)NK細胞。在臨床前模型中輸注後,與傳統NK細胞相比,CIML NK細胞表現出優越的反應和更高的持久性。有研究發現,接受單倍體細胞移植和來自同一供體的CIML NK細胞的急性髓細胞白血病(AML)患者有顯著的反應。

 

3.免疫檢查點抑制劑

NKG2A是NK細胞和T細胞共有的抑制性細胞表面受體。其配體HLA-E是一種非經典的MHC I類分子,在許多實體瘤和血液系統惡性腫瘤中高表達。Monalizumab是一種專門針對NKG2A的免疫檢查點抑制劑,與單獨使用durvalumab相比,在不可切除和化療耐藥的非小細胞肺癌(NSCLC)患者中,其與durvalmab聯合使用顯示出無進展生存期(PFS)延長。

 

4.刺激和接合NK細胞

近20年前,NK細胞刺激性細胞因數IL-2被批准用於治療幾種惡性腫瘤。然而,由於其半衰期短、毒性嚴重,所以療效有限。不過,研究人員開發出的修飾策略正在解決這些問題,例如聚乙二醇偶聯、與腫瘤靶向抗體的融合,以及受體結合親和力的改變。IL-15能夠啟動NK和CD8+T細胞,同時保留調節性T細胞的活性,因此被引入了癌症治療。與IL-2相比,它顯示出更高的安全性,但體內療效有限。最近出現了一種創新策略,即一種與腫瘤相關蛋白酶底物連接的IL2受體鏈掩蓋的IL-2前藥,它可以有效靶向腫瘤浸潤淋巴細胞,最大限度地降低全身毒性。NK細胞接合劑是免疫細胞治療中新型治療分子的代表,它們可以通過靶向多種細胞因數受體或NK細胞受體,來增強NK細胞的活化。

 

療法的未來在於聯合治療方法,例如將NK細胞輸注與免疫檢查點抑制劑或NK細胞銜接劑相結合。而且還需要考慮到腫瘤微環境中存在的限制NK細胞抗腫瘤功能的因素。可參考今年發表的NK細胞綜述的解讀:《Nature》子刊:NK細胞療法需求在增加,非常適合同種異體臨床。最後,我們還需要對實體瘤中的NK細胞療法進行評估,因為需要更清楚地瞭解導致招募和啟動的機制,才能為患者帶來最大的臨床益處。

 

參考文獻

1、Chiossone,L.,&Vivier,E.(2022).Bringingnaturalkillercellstothe clinic.TheJournalofexperimentalmedicine,219(10),e20220830. https://doi.org/10.1084/jem.20220830

 

http://caifuhao.eastmoney.com/news/20240316102539877920570

肝細胞癌(HCC)目前是全球第六大常見癌症,也是2020年全球癌症相關死亡的第三大原因,HCC的治療策略是根據腫瘤分期來選擇的。索拉非尼或侖伐替尼一直是 HCC的常見治療方法,但對生存結果的影響有限,接受索拉非尼和安慰劑治療的HCC患者的中位OS 分別為10.7個月和7.9個月。因此,局部晚期HCC仍然非常需要新的、積極的治療方法。

NK細胞是肝臟先天免疫系統的重要組成部分,占肝內淋巴細胞的30%~50%。研究報導,HCC患者中NK細胞的數量和功能顯著降低,腫瘤浸潤NK細胞的減少與HCC晚期的生存不良相關。這表明肝內NK細胞在HCC免疫監視中發揮著重要作用。

在韓國和日本,肝動脈灌注化療(HAIC)已應用於局部晚期HCC的治療。理論上,HAIC 具有多種優勢,包括比全身治療更高的療效和更低的全身毒性,因為通過肝動脈輸注藥物的方式可以將化療藥物直接輸送到腫瘤細胞。5-氟尿嘧啶(5-FU)和順鉑是肝動脈輸注最常見的方案。值得注意的是,一些化療藥物(包括5-FU和順鉑)作為NK 細胞活性的有效誘導劑具有免疫調節作用。

基於這一假設,《Front Immunol》上發佈了一項1期研究,題為:“A Phase I Study of Locoregional High-Dose Autologous Natural Killer Cell Therapy With Hepatic Arterial Infusion Chemotherapy in Patients With Locally Advanced Hepatocellular Carcinoma”,該研究共納入11名標準治療難治的局部晚期 HCC(肝細胞癌)患者,通過肝動脈輸注單獨施用5-FU和順鉑,以在NK細胞輸注之前誘導腫瘤生長抑制。該研究的目的是評估局部高劑量自體 NK 細胞(VAX-NK/HCC)與 5-FU 和順鉑的 HAIC 聯合用於不適合治療或對標準治療無效的患者的安全性和有效性。

 

5天連續輸注NK細胞晚期肝癌患者完全緩解

參與受試的所有患者,在5-氟尿嘧啶(750mg/m2)和順鉑(25mg/m2)的HAIC(肝動脈輸注化療)治療4個週期後,通過肝動脈給藥,持續5天以劑量遞增的方式(劑量2.5×108,5×108,10×108NK細胞/注射)接受NK細胞治療。資料顯示,所有接收NK細胞治療的患者的治療反應均可評估。客觀緩解率(ORR)為63.6%,其中完全緩解(CR)4例(36.4%),PR( 部分緩解)3例(27.3%)。此外,兩名患者(18.2%)觀察到(疾病穩定)SD,兩名患者(18.2%)觀察到(疾病進展)PD,疾病控制率(DCR)為81.8%。中位隨訪時間為 55.9 個月。所有患者的中位無進展生存期(PFS)為 10.3 個月,12 個月和 24 個月時的無進展生存期(PFS)分別為 36.4% 和 9.1%,總生存期(OS)分別為10.3個月和41.6個月。

 

6個療程NK細胞聯合治療,肺癌患者大部分多發轉移病灶消失

2023年8月,發表了一篇題為:“Investigation of the efficacy and feasibility of combined therapy of PD‐L1‐enhanced exogenous peripatetic adoptive natural killer (NK) cells in combination with antiangiogenic targeted therapy in the treatment of extensive‐stage small cell lung cancer”的研究,證實了NK細胞聯合治療帶來的滿意效果。

 

一名67歲男性患者患有廣泛期小細胞肺癌,原發灶位於右上肺,伴有胸膜和腹腔多發轉移,縱隔淋巴結腫大。局部放療後,採用聯合治療方法針對患者的多發性全身轉移灶。針對腫瘤轉移的情況,研究者制定 (PD-L1)與外源自然殺傷 (NK) 細胞的聯合治療方案,以及抗血管生成治療。連續兩天將同種異體臍帶血 NK 細胞回輸患者體內。第一天,治療後服用1200毫克阿特珠單抗。隨後,患者每天口服10毫克安羅替尼,持續 14 天。隨後休息7天,每個週期持續21天。對右肺原發病灶及縱隔轉移淋巴結進行局部放療後,局部病灶完全緩解,有效避免了上腔靜脈綜合征的風險。具體來說,位於右上葉的結節以及位於氣管、血管、主動脈旁動脈和下腔靜脈附近的右鎖骨上和縱隔區域的多個淋巴結中觀察到收縮。經過六個週期的聯合治療後,大部分轉移病灶消失,其餘轉移病灶體積明顯縮小。這些結果表明治療是有效的,導致大部分轉移灶消失,剩餘轉移灶明顯縮小。影像學評估表明治療方案是成功的,腫瘤處於部分緩解階段。

結語

很多的癌症患者在遇到轉移、復發等難題時,可選擇的治療方案非常局限,而NK細胞療法的研究帶來了轉機。大量的研究已證實NK細胞的效果和安全性。NK細胞能夠高效殺傷腫瘤細胞,有效控制轉移,提高生存品質,為癌症患者提供了新的希望。

參考資料:

 

[1]Bae WK, Lee BC, Kim HJ, Lee JJ, Chung IJ, Cho SB, Koh YS. A Phase I Study of Locoregional High-Dose Autologous Natural Killer Cell Therapy With Hepatic Arterial Infusion Chemotherapy in Patients With Locally Advanced Hepatocellular Carcinoma. Front Immunol. 2022 Jun 2;13:879452. doi: 10.3389/fimmu.2022.879452. PMID: 35720374; PMCID: PMC9202498.

 

[2]Wang Z, Zhang R, Cao Y, Chen Y, Huang S, Luo Y. Investigation of the efficacy and feasibility of combined therapy of PD-L1-enhanced exogenous peripatetic adoptive natural killer (NK) cells in combination with antiangiogenic targeted therapy in the treatment of extensive-stage small cell lung cancer. Thorac Cancer. 2023 Oct;14(28):2877-2885. doi: 10.1111/1759-7714.15040. Epub 2023 Aug 19.PMID: 37596831; PMCID: PMC10542463.

http://caifuhao.eastmoney.com/news/20240316132557756314340

將自然殺傷細胞(NK細胞)用於癌症免疫治療劑很有吸引力,因為與T細胞不同,它們可以逃避免疫排斥並且不會誘發細胞因數風暴。但在有效的治療中捕捉它們的活性還正在探索中。

今年,《Nature Biotechnology》上發表了一篇題為“Industry appetite for natural killer cells intensifies”的新聞報導,來自愛爾蘭的作者Cormac Sheridan對NK細胞在行業內的發展進行了梳理。大型企業積極開展合作,將NK驅動的專案和工具納入其產品組合。人們對NK細胞的興趣也在不斷升級。12月,賽諾菲加深了對基於抗體的NK細胞接合器的研發,擴大了與法國馬賽InnatePharma公司的持續合作夥伴關係。幾個月前,賽諾菲還轉向Scribe Therapeutics的CRISPR平臺,開發現成的腫瘤NK細胞療法,並預付了2500萬美元,這筆交易可能價值10億美元。其他與艾伯維(AbbVie)、百時美施貴寶(Bristol Myers Squibb)、吉利德科學(Gilead Sciences)、默克(Merck)、英國劍橋阿斯利康(AstraZeneca)、東京武田(Takeda)的交易和合作夥伴關係也增添了這一勢頭。

然而,大多數專案還處於早期階段,開發人員在很大程度上仍在尋找功效的跡象,並完善大規模生產細胞的方案。NK細胞對於免疫監控很重要。作為先天免疫系統的一部分,它們可以殺死病毒感染的細胞並消除癌症的早期跡象。作為免疫療法,NK細胞(無論是天然的還是工程化的)比T細胞更安全、更友好。

 

臨床開發中的NK細胞療法

“NK細胞的主要優點是,與CAR-T細胞不同,它們永遠不會殺死任何人。”加州大學三藩市分校和派克癌症免疫治療研究所的Lewis Lanier說道。他是過去40年NK細胞生物學研究的先驅。

細胞因數釋放綜合征如果發生在NK細胞治療期間,往往會溫和得多,這種現象背後的原因尚不完全清楚。“它們與骨髓細胞的相互作用不同,而骨髓細胞似乎是細胞因數釋放綜合征的主要驅動因素。”MD安德森癌症中心的Katy Rezvani說。她是第一個證明嵌合抗原受體(CAR)-NK療法臨床實用性的人。更重要的是,NK細胞療法非常適合同種異體方法,因為它們不會引起移植物抗宿主病。

它們的細胞殺傷功能不涉及驅動細胞毒性T細胞活性的基於人類白細胞抗原的自我/非自我識別機制,因此來自無關供體的NK細胞不會攻擊宿主組織。NK細胞的活性是通過一系列與健康和應激細胞上表達的受體和配體的抑制和啟動相互作用來控制的。除了基於細胞的療法之外,投資者還投入了大量資金來資助大量針對特定抗原的抗體樣NK細胞接合器和雙特異性T細胞接合器。

InnatePharma與賽諾菲在NK細胞接合器平臺上的合作最近得到加強,這家大型製藥公司獲得了針對免疫檢查點B7H3和啟動NK細胞受體CD16a和NKp46的臨床前多特異性NK細胞接合器的許可。賽諾菲也將採用Scribe的CasX編輯工具來增強其現有的K-NK細胞平臺,該平臺是賽諾菲在2020年收購Kiadis時獲得的。“提高體內持久性和改善對實體瘤的浸潤是兩個重點領域”,賽諾菲腫瘤學研究全球主管Valeria Fantin說道。儘管具有潛在優勢,NK細胞療法仍落後於T細胞療法。原因在於NK細胞本身:事實證明,以工業規模對其進行擴展、培養和基因改造具有挑戰性。“即使到了今天,為了獲得臨床試驗所需的資料,大多數人最終還是像我們一樣使用飼養細胞。”Rezvani說。它們顯示出可促進NK細胞增殖的啟動配體,但受到輻射所以不會複製。賽諾菲的K-NK平臺是一個例外:它不使用完整的細胞,而是使用帶有啟動受體的納米顆粒來提供刺激。解凍後不影響NK細胞活性的冷凍保存對於真正的現成療法至關重要,但也需要時間才能實現。開發人員面臨的另一個製造問題是需要提供外源細胞因數,例如白細胞介素(IL)-15,以擴增細胞並確保它們持續存在。

“T細胞會產生自己的生長因數,並且它們可以克隆擴增,NK細胞則不能。”Lanier說。一些開發人員通過改造NK細胞來規避這個問題,但Lanier說,過度啟動可能會導致脫敏。“如果我們只是將NK細胞浸泡在IL-15中,NK細胞就會被燒毀。”

開發人員還添加了CAR等功能,這些功能賦予細胞原本缺乏的抗原特異性。Lanier說:“這就是權衡,我們可以通過基因改造使它們越來越像T細胞。但到了某個時候,毒性也會成為負擔。”

雙特異性接合器還旨在以腫瘤靶向方式啟動患者的內源性NK細胞,但它們面臨著不同的障礙:患者必須有足夠的健康NK細胞才能發揮作用。這或許可以解釋為什麼Affimed的NK細胞接合分子AFM13作為單一療法效果有限,而與未經修飾的NK細胞療法聯合使用時表現出更有希望的活性。AFM13是一種四價雙特異性NK細胞接合器,靶向抗體恒定片段(Fc)結構域受體CD16a(也稱為FcRIIIa)和CD30(一種在某些淋巴瘤中過度表達的受體)。該分子旨在指導NK細胞訓練針對表達CD30的癌細胞的抗體依賴性細胞毒性反應。將NK細胞接合器與NK細胞療法組合的另一種方法是將兩者結合在CAR-NK細胞中。Rezvani的團隊率先為這種方法建立了臨床概念驗證,採用的是帶有IL-15、由CD19導向的CAR-NK療法。

在11名復發或難治性CD19-陽性患者中,有8名(73%)出現緩解。陽性非霍奇金淋巴瘤(NHL)或慢性淋巴細胞白血病。8名應答者中有7名在中位隨訪13.8個月後完全緩解。

該專案目前稱為TAK-007,由武田(Takeda)負責,武田正在B細胞NHL患者中進行多中心試驗。NK導向療法能否比T細胞療法更成功地治療實體瘤仍然是一個懸而未決的議題。對於基於細胞或基於抗體的療法來說,將足夠的活性NK細胞引入腫瘤微環境,然後在它們進入後克服免疫抑制環境,這一挑戰都是需要面對的。一旦進入體內,差異就顯而易見:T細胞在接觸腫瘤抗原時會被啟動並增殖,而NK細胞不會以同樣的方式擴增。另一方面,CAR-NK細胞保留了非特異性殺傷能力以及更具針對性的功能。Artiva首席執行官Fred Aslan表示,該公司對這種額外的抗原不可知機制“感興趣”,因為它可能有助於克服由於HER2等抗原丟失而導致的腫瘤免疫逃逸。在目前的發展階段,基於NK細胞的療法對其潛在的臨床效用產生的問題多於答案,但許多不確定性將在未來幾年內得到澄清。

 

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近年來,創新的免疫療法為血液系統惡性腫瘤的治療提供了新的策略。與傳統的化學療法不同,將T細胞通過基因工程改造,使它們能特異性對腫瘤細胞產生細胞毒性,與之相關的成功案例令人震驚。然而,仍有許多問題——包括療效不足、自體來源不足、副作用大、價格高——從而限制了臨床上的使用。

CAR-NK細胞是一個有希望的替代方案,它具有獨特的細胞毒性和最小的移植物抗宿主病風險。在本文中,我們回顧了CAR-NK 細胞領域的可能來源、開發技術、潛在優勢和面臨的挑戰。

嵌合抗原受體工程 T 細胞 (CAR-T) 的免疫療法徹底改變了復發/難治性 B 細胞惡性腫瘤的治療範式。但儘管如此,自體T 細胞的使用仍具有一定的局限性,包括收集的效應T細胞質量的異質性、細胞處理時間較長、可用的CAR細胞數量有限、以及成本高。

考慮到在單倍體造血幹細胞移植和針對實體瘤及血液惡性腫瘤的過繼性細胞療法中的抗腫瘤作用,NK細胞可能是一種有前途的替代品。NK細胞有不同來源,可通過臍帶血、外周血和誘導多能幹細胞技術獲得。它們最大的優勢是可以同種異體應用而不會產生重大的毒副作用。然而,大多數關於CAR-NK細胞的報告都處在臨床前或早期臨床試驗階段。事實上,NK細胞可能更難以設計,需要優化擴增和轉染方案,使其標準化。此外,它們在輸注後的療效的持久性也是一個難題。

隨著利用其細胞溶解能力、抗體依賴性細胞毒性 (ADCC) 和細胞因數誘導製造CAR-NK細胞的最新進展,“現貨”同種異體CAR-NK細胞有望在癌症治療中大放異彩。

NK細胞生物學

豐富的受體和免疫自我耐受與免疫監視之間的平衡

自然殺傷 (NK) 細胞是一種特定類型的淋巴細胞,被認為是先天免疫的一部分,占淋巴細胞總數的10%至15%。它們在惡性細胞和病毒感染細胞的免疫監視中起著至關重要的作用 [1]。NK 細胞主要通過細胞毒性發揮作用:通過分泌穿孔素/顆粒酶以產生“天然”的細胞毒性誘導細胞凋亡,以及 FasL(Fas 受體的配體,或CD95,腫瘤壞死因數)或TRAIL等因數的表達(TNF相關的凋亡誘導配體),通過啟動死亡受體誘導細胞凋亡;還有由 Fc 受體 CD16 (FcRIII) 介導的抗體依賴性細胞毒性 (ADCC)。

此外,NK細胞產生許多細胞因數,最顯著的是干擾素和TNF。由於其卓越的裂解能力,以一種不依賴抗原的方式進行預啟動,所以引起不良反應的概率較低。事實上,NK細胞的活性是由啟動和抑制信號的複雜整合來調節的——是它們表面上的眾多受體與靶細胞表面上的不同配體之間相互作用的總和。

NK細胞有兩個亞群組成,CD56 dim 和 CD56 bright NK 細胞,由其CD56的表達強度而定義。CD56 dim細胞約占血液NK細胞的90%,具有很強的細胞毒性,主要表達CD16。CD56 bright NK 細胞占迴圈血液中NK細胞的 10%,但主要存在於淋巴結和一些其他器官中,它們的CD16表達較低,細胞毒性能力低於 CD56 dim,但具有強大的增殖潛力。這些特性和功能上的差異對於增強NK細胞在細胞治療中的使用和操作非常重要。

 

同種異體NK細胞

在單倍體幹細胞移植中的抗白血病作用

無論使用何種化療或放療方案,許多血液系統惡性腫瘤僅靠化療和放療仍是無法治癒的。同種異體造血幹細胞移植(HSCT)是當今大量血液癌症的唯一治癒選擇。在同種異體HSCT中,主要目標是用同種異體供體的正常造血功能對患者的免疫系統進行代替。供體對受體的免疫系統反應稱為移植反應。這種反應,簡稱 GvL,表示移植物抗白血病/淋巴瘤,能夠消除患者體內殘留的惡性細胞,並在較長時間內控制血液惡性腫瘤。這種理論上理想的解決方案的主要挫折是嚴重的副作用:移植物抗宿主病(GVHD)。供體的免疫系統——本質上是同種異體反應性T淋巴細胞——攻擊宿主的健康組織(尤其是皮膚、消化道、肝臟和肺,但任何器官都可能受到影響)。為了限制嚴重 GVHD 的風險,大多數同種異體 HSCT 是由 HLA 相同的供體進行的,因此供體和受體之間的 HLA 需完全匹配。

在這種特殊情況下,可以考慮啟動來自供體的單倍體NK細胞。事實上,受體白血病細胞表面的某些I類HLA分子(=KIR配體)可能不被供體NK細胞上的抑制性KIR受體識別。這種現象被稱為 GVL NK效應,由 KIR/KIR配體錯配介導。

這一概念已在先前的研究中報導,通過這種錯配來發揮抗白血病作用,尤其是在 AML 環境中移植了半相合供體的患者中[7,8]。然而,同種異體 HSCT 後同種異體反應性 NK 細胞的這種抗白血病作用是有爭議的,一些研究顯示出相互矛盾的結果。毫無疑問,具有重要可塑性的 NK 細胞會適應其環境或存在移植後成熟延遲,從而降低其效力和細胞毒性 [9,10]。儘管如此,即使NK細胞的體內作用不如T細胞的作用那樣得到了充分證明,但自1990年代後期以來,半相合HSCT的發展有助於闡明這一特定淋巴細胞群,並進一步利用它具有巨大的抗腫瘤細胞毒性的潛力 [11,12]。

 

CAR-T免疫療法

迄今為止,同種異體 HSCT 是最古老和最常用的抗白血病免疫療法。然而,它確實構成了一種激進的(接受者的免疫系統被破壞並被捐贈者的免疫系統取代)、非特異性、非靶向免疫療法,這解釋了它的主要毒性——尤其是GVHD風險,在中斷細胞移植後數月或數年對患者的免疫系統仍有持續影響。嵌合抗原受體 (CAR) T 細胞的發展以前所未有的方式徹底改變了細胞抗腫瘤免疫療法 [13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19]。

CAR是一種將常規T細胞,經過基因工程改造以表達靶向抗原的特定受體。這種嵌合受體由能夠特異性識別靶細胞上抗原的免疫球蛋白 (scFy) 的細胞外單鏈可變片段、跨膜結構域和用於信號傳導的細胞內結構域組成,由細胞質 CD3 信號傳導組成使 CAR 的啟動獨立於 pMHC(第一代 CAR)的結構域,其中注入 CD28或4-1BB共刺激結構域以增強機械轉導(第二代CAR),或結合兩者(第三代 CAR)或與另一個轉基因相關的單個共刺激結構域以提高細胞因數的表達,從而促進 CAR-T 細胞效應器能力(第四代)。EMA(歐洲食品與藥品監督管理局) 已批准在R/R DLBCL[20] 中使用axicabtagene ciloleucel和 tisagenlecleucel,以及在患有B-ALL的年輕成人中使用 tisagenlecleucel。其他自體抗CD19或抗BCMA CAR-T細胞可早期用於成人ALL、濾泡性NHL和骨髓瘤。

 

通過這些創新的新療法,可以觀察到40-60%的患者的長期反應,這些患者的中位總生存期通常約為6個月,從而徹底改變了這些難治復發性血液系統惡性腫瘤的治療格局 [21 , 22 , 23]。然而,CAR-T療法在使用上仍面臨諸多障礙和實際問題[24]。

(1)CAR-T細胞是從患者自身的自體細胞發展而來的,在淋巴采血過程中收集到的T淋巴細胞的品質以及獲得的產品的異質性(如效應能力、活力、擴增能力、T細胞衰老和耗竭),本質上是由之前的治療引起的,也是患者的免疫系統狀態所致;

(2)從收集到生產過程的這些障礙使製造過程費力、漫長且非常昂貴;如今,在美國,單個B 細胞淋巴瘤患者的 CAR-T 細胞治療費用平均為 373,000 美元。Prime Therapeutics 使用真實資料進行的一項新研究發現,總成本平均超過 700,000 美元,在某些情況下,CAR-T移植後續費用可能超過 100 萬美元。在法國,在社會保險涵蓋CAR—T手術的全部費用的情況下,CAR-T 治療的價格約為 350,000 歐元,不包括住院和輔助治療的價格。CAR-T 細胞的生產和輸注之間的延遲可能達到2個月,這對於患有難治性不受控制的血液系統惡性腫瘤的患者來說太長了。

(3)此外,注射的抗CD19 CAR-T細胞有其自身的毒性造成的副作用——最常見的是炎症與細胞因數釋放綜合征 (CRS) 或神經和血液損傷(例如,血細胞減少症,有時可能持續存在)的發展有關。最後,CAR-T治療後抗原靶點的丟失是一個重要的復發原因,尤其是在CD19 B ALL中[25]。

其他基因改造——例如TCR抑制或引入自殺基因——是必要的;一些研究人員甚至嘗試使用沒有排斥或GVHD的雙陰性CAR-T 細胞 (CD4-CD8-) [26]。一些臨床研究正在進行中,以測試這些同種異體CAR-T 細胞(主要用於 B 型惡性腫瘤)與通常的氟達拉濱-環磷醯胺 (FluCy) 淋巴耗竭,其中添加了阿侖單抗以降低免疫排斥的風險。該工藝增加了CAR的毒性特徵,卻隨之增加了免疫抑制甚至長期發育不全的風險。在 UCART19 小組最近的一項試驗中,在使用或不使用阿侖單抗的FluCy調理後,將基因組編輯的、供體來源的同種異體抗CD19 CAR-T細胞給予患有難治性 B-ALL的成人和兒童。只有接受阿侖單抗的患者表現出擴張和抗白血病活性,輸注後28天的CR率為67%,但主要代價是高毒性[27]。今天,同種異體CAR-T細胞最常見的用途是作為同種異體 HSCT 的橋接——尤其是在AML和髓系腫瘤中。

 

CAR-NK細胞免疫療法

NK細胞的活性完全獨立於抗原和HLA;它們可以從不相關的同種異體HLA不相容的供體中獲得。供體NK細胞和受體腫瘤細胞之間的這種HLA不相容性可通過 KIR/KIR 配體錯配促進NK細胞的抗腫瘤同種異體反應(見第1節)。有趣的是,與同種異體T細胞不同,NK細胞不會引起任何GVHD。這種現象的原因尚不完全清楚,但啟動劑受體可能是關鍵。健康的非應激(例如,皮膚、消化道)宿主組織在其表面上不存在應激誘導的配體,從而使它們免受NK細胞毒性的影響。在 HLA不相容的小鼠HSCT模型中,供體NK細胞甚至通過破壞受體的抗原呈遞細胞對GVHD發揮保護作用。這種對接受者免疫系統的影響可以促進移植並使同種異體NK細胞不易受到免疫排斥的影響。

“現貨”的同種異體NK細胞在從實驗室到床旁的效率,以及成本方面呈現出巨大的優勢 [24 , 28 , 29] (表1 )。儘管CAR-NK細胞具有所有這些優勢,但仍存在一些局限。

(1)首先,它們在體內的存活時間相對較短,約為1-4周。在難治性AML患者的家族性半相合供體的短期(12-16 小時)IL-2 啟動 CD3-CD56+NK細胞的臨床試驗中,表明用氟達拉濱和環磷醯胺清除淋巴對NK細胞的擴增至關重要,並且IL-15的存在是擴增和臨床反應的預測因素 [30]。NK細胞的體內擴增也需要體內施用IL-2,具有顯著的毒性作用。在CAR-NK細胞的構建中加入細胞因數轉基因(如 IL-2 和 IL-15)具有改善擴增效率和持久性的潛力 [28]。

(2)其次,血液中數量有限的NK細胞需要離體擴增技術,以便在收穫後使用單采術獲得必要的劑量。已經研究了用於離體擴增和啟動NK細胞的不同方法。這些方法包括用細胞因數(主要是 IL15 和 IL2)培養數天(通常為14 天)。IL-2是必不可少的,目前用於促進同種異體NK細胞遞送後的NK細胞擴增,而IL-15在NK細胞發育和體內平衡中起關鍵作用。一些報導中使用飼養細胞如Jurkat T淋巴母細胞或Epstein-Barr病毒轉化的淋巴母細胞系 (EBV-LCL) 大規模擴增NK細胞。K562 是一種白血病細胞系,經過基因改造,可表達膜結合形式的IL-15和4-1BB(CD137L)。最近,K562 細胞已被設計為表達膜結合的IL-21和CD137L,展示了一些有趣的結果。

關於哪種方法最適合NK 細胞的高效擴增仍然存在爭議,有研究發現K562飼養細胞能夠誘導強勁和持續的增殖(培養3至5周後擴增100至 >10,000倍)[31]。

(3)第三,NK細胞改造有一定難度,對細胞凋亡高度敏感且基因表達水準低。目前,將基因引入NK細胞的最成功的替代方法是通過電穿孔快速暫態表達,或通過病毒載體持續但低表達。因此,轉染方案的優化仍然是開發CAR-NK療法的一個重要因素 [32]。最近,在離體擴增環境中對原代人自然殺傷細胞的慢病毒轉導進行了改進。優化基因工程NK細胞方法將促進CAR-NK細胞的廣泛應用 [33]。

(4)最後,腫瘤微環境 (TME) 降低了血液惡性腫瘤中NK細胞的代謝活性,構成了增強NK細胞抗腫瘤作用的重要障礙[34,35]。與摻入IL-15的方式相同,使用編碼趨化因數受體的轉基因可以促進CAR-NK在腫瘤部位的運輸。與抗PD1/抗PDL1等檢查點抑制劑聯合使用有助於克服TME的抑制作用,從而釋放CAR-NK細胞的全部潛力。這種效果在小鼠模型的臨床前研究中似乎是成功的,但仍需要在患者的臨床研究中得到證明 [36 ,37,38]。還需要注意的是,關於被CAR細胞阻斷的檢查點的大部分數據都來自CAR-T細胞的經驗,而對CAR-NK細胞的經驗很少。

 

自體 CAR-T 細胞和同種異體 CAR-NK 細胞的優缺點比較

CAR-NK細胞的來源

同種異體CAR-NK細胞的一個主要優勢是隨用隨取,這依賴於良好的凍存工藝,隨後才有可能從特定的細胞源產生大量的同質批次。許多NK細胞來源已被用於生產同種異體CAR-NK細胞。

 

NK-92細胞系

NK-92是一種白細胞介素2依賴性、EBV 陽性自然殺傷細胞系,來源於一名患有快速進展性非霍奇金淋巴瘤的 50 歲白人男性的外周血單核細胞,它們具有高度細胞毒性。它們的表型包括啟動受體 NKp30、NKp46和NKG2D。有趣的是,NK-92表面上唯一的抑制性受體由 ILT2、CD94-NKG2A(識別HLA-E)和表達水準較低的抑制性KIR受體KIR2DL4代表。它們的使用非常方便,因為理論上可以批量生產和“無限”生成CAR-NK細胞,在細胞數量、時間和成本方面都有巨大的收益。不過由於它們的腫瘤性質,這些源自NK-92細胞系的CAR-NK細胞需要在注射前進行照射,從而改變它們的壽命和分裂。儘管受到照射,它們似乎保留了它們的細胞毒能力,但它們的體內增殖能力發生了急劇變化,注射後7天內消失,需要多次注射。

在三名淋巴清除化療後復發和難治性AML患者中,已經報導了在人類患者中使用CAR-NK細胞的一些證據,這些患者的 CD33-CAR-NK 細胞來源於 NK-92細胞系[39]。這三名患者接受了挽救性化療,然後以增加的劑量注入抗 CD33 CAR-NK細胞(每位患者使用三個遞增劑量的輻照 CAR-NK-92細胞)。每名患者安全應用多達 5×109個 CD33-CAR-NK 細胞,沒有明顯的副作用或3-4級毒性;只報告了短暫的發燒。然而,即使治療耐受性良好並且重複輸注的安全性得到證實,所獲得的療效反應也非常短暫,一名患者只有10天,另一名患者最多4個月 [39]。

在體外,慢病毒CD33-CAR載體在NK-92細胞中的效率遠高於90%,但細胞毒性試驗表明,與親代NK-92細胞相比,對人 HL-60早幼粒細胞白血病細胞系的細胞毒性適度增強[39]。CAR-NK-92細胞也已針對多發性骨髓瘤細胞進行了探索。江等人報導了用抗 CD38 轉導的NK-92細胞在體外以及在異種移植 NOD-SCID 小鼠模型中,對骨髓瘤細胞系和原發性骨髓瘤細胞具有很強的抗腫瘤活性 [40],用表達抗 CS1/SLAMF7 CAR的NK-92 細胞觀察到類似的結果 [41]。

為了提高源自NK-92細胞系的CAR-NK細胞的效率,最初用於T 細胞的第4代CAR在一個名為 UniCAR 的平臺上生產。UniCAR 系統由兩個元素組成:

(i)針對肽表位 E5B9 的 CAR-NKG2——一種非天然在細胞表面表達的抗原;

(ii) 稱為目的模組 (TM) 的雙特異性組件。這種雙特異性模組在一側表達 E5B9 抗原,另一側表達對腫瘤抗原特異的抗體(圖 2)。該構建體使 CAR-NKG2 細胞(通過E5B9抗原)和靶細胞(通過特異性抗體)之間能夠接觸。除此之外,效果可以立即停止(開/關效果),因為 TM 的壽命很短。一旦停止TM的穩定(連續)輸注,TM就會被淘汰,UniCAR也會失活。事實上,該系統通過改變可以同時或以順序方式給予的TMs來實現大量腫瘤抗體的靶向選擇 [42]。

源自臍帶血的 NK 細胞

臍帶血是NK細胞的豐富而有趣的來源,因為國際血庫有數十萬個臍帶血 (UCB) 單位可供使用。NK細胞占臍帶淋巴細胞的15%至 30%。它們的表型比成人外周血細胞的表型更不成熟,具有非常特殊的特徵,包括低CD16(低ADCC能力)、CD56 bright(比細胞毒性更具有增殖能力)、NKG2A+(一種抑制性受體,識別 HLA-E)和低 KIR(功能比其對應物少)[43]。然而,這些限制可以通過使用細胞因數和轉染的離體擴增和啟動來克服,並且根據筆者的經驗,與來自血細胞的 CAR-NK 相比,來自臍帶血的 CAR-NK 細胞在流式細胞術中觀察到具有相同的啟動特徵。即使 UCB 中的 NK 細胞或多或少稀少,它們也具有非常重要的增殖能力,並且對細胞因數刺激非常敏感,可以進行離體擴增。

由 Tezvani 等人帶領的 MD Anderson 團隊。最近發表了一項非常令人鼓舞的 I/II 期臨床試驗,該試驗在 11 名患有復發性難治性 B 細胞惡性腫瘤(從非霍奇金淋巴瘤到慢性淋巴細胞白血病)的患者中注射來自新鮮 UCB 的CAR-NK-CD19 細胞(ClinicalTrials.gov ,NCT03056339)(圖3)。用研究中使用的三種劑量之一(1×105、1×106或1×107每公斤細胞數)在淋巴清除化療(氟達拉濱和環磷醯胺)後。

值得注意的是,UCB NK細胞輸注後沒有注意到不良反應或毒性,特別是CRS 或神經毒性,試驗中未達到最大耐受劑量。反應在注射後的第一個月迅速出現,在11名受試者中,有7名患者完全緩解,並在 Richter 轉化中恢復到CLL狀態。儘管如此,重要的是要展示一個事實,即一半的患者在注射NK細胞後接受了維持治療,由來那度胺、利妥昔單抗、維奈托克或HSCT組成的綜合方案。在注射後長達12個月內檢測到NK細胞。最有可能的是,在 CAR結構中添加IL-15基因有助於CAR-NK細胞的長期存活,儘管持久性機制尚未闡明。

此外,一個可能且非常重要的技術挫折是直接從新鮮UCB生產 CAR-NK細胞,以及在生產後立即注射,沒有任何凍存步驟。事實上,由於從冷凍保存的細胞中選擇NK細胞的效率低,可能不應該推薦使用來自國際銀行的冷凍保存的臍帶血來生產CAR-NK細胞。根據 MD Anderson 團隊的經驗,從新鮮臍帶血中擴增可能是一種選擇——或者更確切地說,建立選定的冷凍保存的NK細胞庫,這些細胞可以解凍和擴增以進行轉導。還應注意的是,CAR-NK細胞在冷凍保存後活性有所降低,在目前的技術條件下,CAR-NK細胞應在培養後立即給藥。即使CAR-NK細胞的具體長期療效難以評估,並且該工藝在冷凍細胞上的可行性尚待確定,但結果非常有希望[44]。

 

來自外周血的NK細胞

如前所述,大多數採用過繼性NK療法(不包括CAR-NK細胞)的研究都使用了來自單倍體相關或不相關供體的細胞,並已在兒童和成人AML中顯示出抗腫瘤反應 [29,46]。然而,缺點是需要從健康的成年志願者那裡收集細胞,這使得該過程比使用UCB稍微複雜一些。在細胞因數存在的情況下,一些簡單的、符合GMP的培養條件可以將它們的擴增提高25-55倍 [49]。如果來自PB的NK細胞與CB NK細胞相比具有高細胞毒性,那麼在CAR-NK療法的背景下,供體在HLA不相容性方面的選擇是否應該有所不同仍有待證明。

Leivas 等人的團隊描述了一種可以使用和衍生自PBMC的方法[53]。在活化和擴增的NK細胞 (NKAE) 和記憶T細胞 (CD45RA-T 細胞) 之間選擇效應細胞。NK或T細胞在與NKG2D-4-1BB-CD3z-CAR 載體一起培養後轉導,使用在NK和T細胞上表達的 NKG2D 啟動劑受體,以及用於轉導的4-1BB(見上文)。NKG2D 具有特定的配體,包括 MICA、MICB 和 ULBP,它們在應激細胞和許多腫瘤細胞上表達,特別是在多發性骨髓瘤中。在體外,記憶T細胞的轉導比其NK對應物更穩定。然而,CAR-NKAE細胞在體外對MM細胞表現出更強的細胞毒性,同時保護健康細胞免受損傷。此外,在他們的小鼠異種移植骨髓瘤模型中,與T細胞相比,CAR-NKAE細胞表現出高效的細胞毒性和增強的抗骨髓瘤活性。

另一種方法是使用 Cas9/RNP 和腺相關病毒基因遞送的 CRISPR 靶向 CAR 基因插入。使用這種技術,產生了具有不同跨膜和信號結構域(CD4/4-1BB+CD3 和 NKG2D/2B4+CD3)的靶向 CD33 的CAR-NK,並且似乎在原代NK細胞中顯示出增強的抗 AML活性 [54]。

源自 iPSC 的 NK 細胞

 

誘導多能幹細胞 (iPSC) 是經過基因重程式設計成為多能幹細胞的分化細胞。成熟分化細胞重程式設計為 iPSC 的過程包括對細胞進行基因改造,使其表達四種基因:Klf4、C- myc、Oct3/4和Sox2,從而具有與胚胎幹細胞相同的特徵。 因此,分化的成人重程式設計細胞獲得了無限增殖的潛力,並且在加入特定生長因數後可以分化成任何細胞類型,這使得它在許多醫學領域都有用武之地——特別是再生醫學、細胞療法或遺傳病的模型化。這一發現獲得了 2012 年諾貝爾醫學獎,授予神戶大學(日本)研究員山中伸也 [55]。

由於它們的永生特性,單個iPSC足以生產和生成通用的 CAR-NK“現貨”產品。由iPSC產生的NK細胞具有不成熟的表型,具有低CD16、高 NKG2A和低KIR,具有較差的細胞毒性,但具有非常重要的增殖能力。為了增強它們的細胞毒性並使其持久存在,可以添加用於表達CD16 和 IL-15 或 IL-2的基因 [56, 57]。

FT596產品是第一個“即用型”、通用和同種異體CAR-NK細胞產品,源自iPSC技術,並且已經獲准在美國用於臨床研究 [58]。它由針對NK細胞優化的抗CD19 CAR組成,具有啟動劑受體 NKG2D的跨膜結構域、2B4共刺激結構域和 CD3 信號傳導結構域。添加了兩個關鍵成分:

(i) 一種新型、高親和力、不可切割的 CD16 Fc 受體 (hnCD16),可在沒有負調控的情況下實現腫瘤靶向和增強抗體依賴性細胞毒性,並結合靶向治療性單克隆抗體腫瘤細胞;

(ii) 促進細胞因數非依賴性持久性的 IL-15/IL-15 受體融合蛋白 (IL-15RF)(圖 4)。當與利妥昔單抗(抗CD20)等單克隆抗體聯合使用時,FT596的hnCD16 Fc受體與覆蓋腫瘤細胞的單克隆抗體的Fc部分結合,啟動NK細胞,分泌細胞因數,增強ADCC。IL-15RF促進NK細胞和活化的抗腫瘤 T 細胞的細胞毒性。

ASH 2020期間的一份通訊報導了一名76歲女性在接受八線治療(包括 ASCT、自體過繼 T 細胞治療和活化的半相合NK細胞)後復發難治性 DLBCL 的病例 [59]。

該患者在淋巴清除單藥治療後接受了獨特劑量的30×106 FT596 細胞。除了中性粒細胞減少症外,沒有報告與FT596細胞相關的副作用。在1個月閾值的腫瘤反應評估顯示基於 2014 Lugano 標準的部分反應,18 F-Glu 吸收減少超過70%,腫瘤大小減少超過 50%。該患者的第二劑 FT596 正在進行中。一項 I 期研究也在進行中,估計有 285 名患者入組(clinicaltrials.gov:NCT04245722)。

結論

同種異體 CAR-NK 細胞提供了許多有趣的視角,可以解決使用自體CAR-T細胞所面臨的一些問題。迄今為止,同種異體NK細胞面臨的主要挫折是它們相對較短的作用持續時間,以及缺乏標準化工藝。與CAR-T細胞相比,CAR-NK細胞療法在很大程度上屬於起步階段;截至2022年5月1日,共有35項試驗涉及CAR-NK細胞,與臨床試驗網站上涉及CAR-T細胞療法的1181項試驗相比,證實了這種創新療法的資料較少。CAR-NK細胞療法在抗擊癌症方面具有廣闊的前景,但仍需更多研究加以論證。

http://caifuhao.eastmoney.com/news/20240318095713251424650

近年來,創新的免疫療法為血液系統惡性腫瘤的治療提供了新的策略。與傳統的化學療法不同,將T細胞通過基因工程改造,使它們能特異性對腫瘤細胞產生細胞毒性,與之相關的成功案例令人震驚。然而,仍有許多問題——包括療效不足、自體來源不足、副作用大、價格高——從而限制了臨床上的使用。

CAR-NK細胞是一個有希望的替代方案,它具有獨特的細胞毒性和最小的移植物抗宿主病風險。在本文中,我們回顧了CAR-NK 細胞領域的可能來源、開發技術、潛在優勢和面臨的挑戰。

嵌合抗原受體工程 T 細胞 (CAR-T) 的免疫療法徹底改變了復發/難治性 B 細胞惡性腫瘤的治療範式。但儘管如此,自體T 細胞的使用仍具有一定的局限性,包括收集的效應T細胞質量的異質性、細胞處理時間較長、可用的CAR細胞數量有限、以及成本高。

考慮到在單倍體造血幹細胞移植和針對實體瘤及血液惡性腫瘤的過繼性細胞療法中的抗腫瘤作用,NK細胞可能是一種有前途的替代品。NK細胞有不同來源,可通過臍帶血、外周血和誘導多能幹細胞技術獲得。它們最大的優勢是可以同種異體應用而不會產生重大的毒副作用。然而,大多數關於CAR-NK細胞的報告都處在臨床前或早期臨床試驗階段。事實上,NK細胞可能更難以設計,需要優化擴增和轉染方案,使其標準化。此外,它們在輸注後的療效的持久性也是一個難題。

隨著利用其細胞溶解能力、抗體依賴性細胞毒性 (ADCC) 和細胞因數誘導製造CAR-NK細胞的最新進展,“現貨”同種異體CAR-NK細胞有望在癌症治療中大放異彩。

NK細胞生物學

豐富的受體和免疫自我耐受與免疫監視之間的平衡

自然殺傷 (NK) 細胞是一種特定類型的淋巴細胞,被認為是先天免疫的一部分,占淋巴細胞總數的10%至15%。它們在惡性細胞和病毒感染細胞的免疫監視中起著至關重要的作用 [1]。NK 細胞主要通過細胞毒性發揮作用:通過分泌穿孔素/顆粒酶以產生“天然”的細胞毒性誘導細胞凋亡,以及 FasL(Fas 受體的配體,或CD95,腫瘤壞死因數)或TRAIL等因數的表達(TNF相關的凋亡誘導配體),通過啟動死亡受體誘導細胞凋亡;還有由 Fc 受體 CD16 (FcRIII) 介導的抗體依賴性細胞毒性 (ADCC)。

此外,NK細胞產生許多細胞因數,最顯著的是干擾素和TNF。由於其卓越的裂解能力,以一種不依賴抗原的方式進行預啟動,所以引起不良反應的概率較低。事實上,NK細胞的活性是由啟動和抑制信號的複雜整合來調節的——是它們表面上的眾多受體與靶細胞表面上的不同配體之間相互作用的總和。

NK細胞有兩個亞群組成,CD56 dim 和 CD56 bright NK 細胞,由其CD56的表達強度而定義。CD56 dim細胞約占血液NK細胞的90%,具有很強的細胞毒性,主要表達CD16。CD56 bright NK 細胞占迴圈血液中NK細胞的 10%,但主要存在於淋巴結和一些其他器官中,它們的CD16表達較低,細胞毒性能力低於 CD56 dim,但具有強大的增殖潛力。這些特性和功能上的差異對於增強NK細胞在細胞治療中的使用和操作非常重要。

同種異體NK細胞

在單倍體幹細胞移植中的抗白血病作用

無論使用何種化療或放療方案,許多血液系統惡性腫瘤僅靠化療和放療仍是無法治癒的。同種異體造血幹細胞移植(HSCT)是當今大量血液癌症的唯一治癒選擇。在同種異體HSCT中,主要目標是用同種異體供體的正常造血功能對患者的免疫系統進行代替。供體對受體的免疫系統反應稱為移植反應。這種反應,簡稱 GvL,表示移植物抗白血病/淋巴瘤,能夠消除患者體內殘留的惡性細胞,並在較長時間內控制血液惡性腫瘤。這種理論上理想的解決方案的主要挫折是嚴重的副作用:移植物抗宿主病(GVHD)。供體的免疫系統——本質上是同種異體反應性T淋巴細胞——攻擊宿主的健康組織(尤其是皮膚、消化道、肝臟和肺,但任何器官都可能受到影響)。為了限制嚴重 GVHD 的風險,大多數同種異體 HSCT 是由 HLA 相同的供體進行的,因此供體和受體之間的 HLA 需完全匹配。

在這種特殊情況下,可以考慮啟動來自供體的單倍體NK細胞。事實上,受體白血病細胞表面的某些I類HLA分子(=KIR配體)可能不被供體NK細胞上的抑制性KIR受體識別。這種現象被稱為 GVL NK效應,由 KIR/KIR配體錯配介導。

這一概念已在先前的研究中報導,通過這種錯配來發揮抗白血病作用,尤其是在 AML 環境中移植了半相合供體的患者中[7,8]。然而,同種異體 HSCT 後同種異體反應性 NK 細胞的這種抗白血病作用是有爭議的,一些研究顯示出相互矛盾的結果。毫無疑問,具有重要可塑性的 NK 細胞會適應其環境或存在移植後成熟延遲,從而降低其效力和細胞毒性 [9,10]。儘管如此,即使NK細胞的體內作用不如T細胞的作用那樣得到了充分證明,但自1990年代後期以來,半相合HSCT的發展有助於闡明這一特定淋巴細胞群,並進一步利用它具有巨大的抗腫瘤細胞毒性的潛力 [11,12]。

 

CAR-T免疫療法

迄今為止,同種異體 HSCT 是最古老和最常用的抗白血病免疫療法。然而,它確實構成了一種激進的(接受者的免疫系統被破壞並被捐贈者的免疫系統取代)、非特異性、非靶向免疫療法,這解釋了它的主要毒性——尤其是GVHD風險,在中斷細胞移植後數月或數年對患者的免疫系統仍有持續影響。嵌合抗原受體 (CAR) T 細胞的發展以前所未有的方式徹底改變了細胞抗腫瘤免疫療法 [13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19]。

 

CAR是一種將常規T細胞,經過基因工程改造以表達靶向抗原的特定受體。這種嵌合受體由能夠特異性識別靶細胞上抗原的免疫球蛋白 (scFy) 的細胞外單鏈可變片段、跨膜結構域和用於信號傳導的細胞內結構域組成,由細胞質 CD3 信號傳導組成使 CAR 的啟動獨立於 pMHC(第一代 CAR)的結構域,其中注入 CD28或4-1BB共刺激結構域以增強機械轉導(第二代CAR),或結合兩者(第三代 CAR)或與另一個轉基因相關的單個共刺激結構域以提高細胞因數的表達,從而促進 CAR-T 細胞效應器能力(第四代)。EMA(歐洲食品與藥品監督管理局) 已批准在R/R DLBCL[20] 中使用axicabtagene ciloleucel和 tisagenlecleucel,以及在患有B-ALL的年輕成人中使用 tisagenlecleucel。其他自體抗CD19或抗BCMA CAR-T細胞可早期用於成人ALL、濾泡性NHL和骨髓瘤。

通過這些創新的新療法,可以觀察到40-60%的患者的長期反應,這些患者的中位總生存期通常約為6個月,從而徹底改變了這些難治復發性血液系統惡性腫瘤的治療格局 [21 , 22 , 23]。然而,CAR-T療法在使用上仍面臨諸多障礙和實際問題[24]。

(1)CAR-T細胞是從患者自身的自體細胞發展而來的,在淋巴采血過程中收集到的T淋巴細胞的品質以及獲得的產品的異質性(如效應能力、活力、擴增能力、T細胞衰老和耗竭),本質上是由之前的治療引起的,也是患者的免疫系統狀態所致;

(2)從收集到生產過程的這些障礙使製造過程費力、漫長且非常昂貴;如今,在美國,單個B 細胞淋巴瘤患者的 CAR-T 細胞治療費用平均為 373,000 美元。Prime Therapeutics 使用真實資料進行的一項新研究發現,總成本平均超過 700,000 美元,在某些情況下,CAR-T移植後續費用可能超過 100 萬美元。在法國,在社會保險涵蓋CAR—T手術的全部費用的情況下,CAR-T 治療的價格約為 350,000 歐元,不包括住院和輔助治療的價格。CAR-T 細胞的生產和輸注之間的延遲可能達到2個月,這對於患有難治性不受控制的血液系統惡性腫瘤的患者來說太長了。

(3)此外,注射的抗CD19 CAR-T細胞有其自身的毒性造成的副作用——最常見的是炎症與細胞因數釋放綜合征 (CRS) 或神經和血液損傷(例如,血細胞減少症,有時可能持續存在)的發展有關。最後,CAR-T治療後抗原靶點的丟失是一個重要的復發原因,尤其是在CD19 B ALL中[25]。

其他基因改造——例如TCR抑制或引入自殺基因——是必要的;一些研究人員甚至嘗試使用沒有排斥或GVHD的雙陰性CAR-T 細胞 (CD4-CD8-) [26]。一些臨床研究正在進行中,以測試這些同種異體CAR-T 細胞(主要用於 B 型惡性腫瘤)與通常的氟達拉濱-環磷醯胺 (FluCy) 淋巴耗竭,其中添加了阿侖單抗以降低免疫排斥的風險。該工藝增加了CAR的毒性特徵,卻隨之增加了免疫抑制甚至長期發育不全的風險。在 UCART19 小組最近的一項試驗中,在使用或不使用阿侖單抗的FluCy調理後,將基因組編輯的、供體來源的同種異體抗CD19 CAR-T細胞給予患有難治性 B-ALL的成人和兒童。只有接受阿侖單抗的患者表現出擴張和抗白血病活性,輸注後28天的CR率為67%,但主要代價是高毒性[27]。今天,同種異體CAR-T細胞最常見的用途是作為同種異體 HSCT 的橋接——尤其是在AML和髓系腫瘤中。

 

CAR-NK細胞免疫療法

NK細胞的活性完全獨立於抗原和HLA;它們可以從不相關的同種異體HLA不相容的供體中獲得。供體NK細胞和受體腫瘤細胞之間的這種HLA不相容性可通過 KIR/KIR 配體錯配促進NK細胞的抗腫瘤同種異體反應(見第1節)。有趣的是,與同種異體T細胞不同,NK細胞不會引起任何GVHD。這種現象的原因尚不完全清楚,但啟動劑受體可能是關鍵。健康的非應激(例如,皮膚、消化道)宿主組織在其表面上不存在應激誘導的配體,從而使它們免受NK細胞毒性的影響。在 HLA不相容的小鼠HSCT模型中,供體NK細胞甚至通過破壞受體的抗原呈遞細胞對GVHD發揮保護作用。這種對接受者免疫系統的影響可以促進移植並使同種異體NK細胞不易受到免疫排斥的影響。

“現貨”的同種異體NK細胞在從實驗室到床旁的效率,以及成本方面呈現出巨大的優勢 [24 , 28 , 29] (表1 )。儘管CAR-NK細胞具有所有這些優勢,但仍存在一些局限。

(1)首先,它們在體內的存活時間相對較短,約為1-4周。在難治性AML患者的家族性半相合供體的短期(12-16 小時)IL-2 啟動 CD3-CD56+NK細胞的臨床試驗中,表明用氟達拉濱和環磷醯胺清除淋巴對NK細胞的擴增至關重要,並且IL-15的存在是擴增和臨床反應的預測因素 [30]。NK細胞的體內擴增也需要體內施用IL-2,具有顯著的毒性作用。在CAR-NK細胞的構建中加入細胞因數轉基因(如 IL-2 和 IL-15)具有改善擴增效率和持久性的潛力 [28]。

(2)其次,血液中數量有限的NK細胞需要離體擴增技術,以便在收穫後使用單采術獲得必要的劑量。已經研究了用於離體擴增和啟動NK細胞的不同方法。這些方法包括用細胞因數(主要是 IL15 和 IL2)培養數天(通常為14 天)。IL-2是必不可少的,目前用於促進同種異體NK細胞遞送後的NK細胞擴增,而IL-15在NK細胞發育和體內平衡中起關鍵作用。一些報導中使用飼養細胞如Jurkat T淋巴母細胞或Epstein-Barr病毒轉化的淋巴母細胞系 (EBV-LCL) 大規模擴增NK細胞。K562 是一種白血病細胞系,經過基因改造,可表達膜結合形式的IL-15和4-1BB(CD137L)。最近,K562 細胞已被設計為表達膜結合的IL-21和CD137L,展示了一些有趣的結果。

關於哪種方法最適合NK 細胞的高效擴增仍然存在爭議,有研究發現K562飼養細胞能夠誘導強勁和持續的增殖(培養3至5周後擴增100至 >10,000倍)[31]。

(3)第三,NK細胞改造有一定難度,對細胞凋亡高度敏感且基因表達水準低。目前,將基因引入NK細胞的最成功的替代方法是通過電穿孔快速暫態表達,或通過病毒載體持續但低表達。因此,轉染方案的優化仍然是開發CAR-NK療法的一個重要因素 [32]。最近,在離體擴增環境中對原代人自然殺傷細胞的慢病毒轉導進行了改進。優化基因工程NK細胞方法將促進CAR-NK細胞的廣泛應用 [33]。

(4)最後,腫瘤微環境 (TME) 降低了血液惡性腫瘤中NK細胞的代謝活性,構成了增強NK細胞抗腫瘤作用的重要障礙[34,35]。與摻入IL-15的方式相同,使用編碼趨化因數受體的轉基因可以促進CAR-NK在腫瘤部位的運輸。與抗PD1/抗PDL1等檢查點抑制劑聯合使用有助於克服TME的抑制作用,從而釋放CAR-NK細胞的全部潛力。這種效果在小鼠模型的臨床前研究中似乎是成功的,但仍需要在患者的臨床研究中得到證明 [36 ,37,38]。還需要注意的是,關於被CAR細胞阻斷的檢查點的大部分數據都來自CAR-T細胞的經驗,而對CAR-NK細胞的經驗很少。

 

自體 CAR-T 細胞和同種異體 CAR-NK 細胞的優缺點比較

CAR-NK細胞的來源

同種異體CAR-NK細胞的一個主要優勢是隨用隨取,這依賴於良好的凍存工藝,隨後才有可能從特定的細胞源產生大量的同質批次。許多NK細胞來源已被用於生產同種異體CAR-NK細胞。

 

NK-92細胞系

NK-92是一種白細胞介素2依賴性、EBV 陽性自然殺傷細胞系,來源於一名患有快速進展性非霍奇金淋巴瘤的 50 歲白人男性的外周血單核細胞,它們具有高度細胞毒性。它們的表型包括啟動受體 NKp30、NKp46和NKG2D。有趣的是,NK-92表面上唯一的抑制性受體由 ILT2、CD94-NKG2A(識別HLA-E)和表達水準較低的抑制性KIR受體KIR2DL4代表。它們的使用非常方便,因為理論上可以批量生產和“無限”生成CAR-NK細胞,在細胞數量、時間和成本方面都有巨大的收益。不過由於它們的腫瘤性質,這些源自NK-92細胞系的CAR-NK細胞需要在注射前進行照射,從而改變它們的壽命和分裂。儘管受到照射,它們似乎保留了它們的細胞毒能力,但它們的體內增殖能力發生了急劇變化,注射後7天內消失,需要多次注射。

在三名淋巴清除化療後復發和難治性AML患者中,已經報導了在人類患者中使用CAR-NK細胞的一些證據,這些患者的 CD33-CAR-NK 細胞來源於 NK-92細胞系[39]。這三名患者接受了挽救性化療,然後以增加的劑量注入抗 CD33 CAR-NK細胞(每位患者使用三個遞增劑量的輻照 CAR-NK-92細胞)。每名患者安全應用多達 5×109個 CD33-CAR-NK 細胞,沒有明顯的副作用或3-4級毒性;只報告了短暫的發燒。然而,即使治療耐受性良好並且重複輸注的安全性得到證實,所獲得的療效反應也非常短暫,一名患者只有10天,另一名患者最多4個月 [39]。

在體外,慢病毒CD33-CAR載體在NK-92細胞中的效率遠高於90%,但細胞毒性試驗表明,與親代NK-92細胞相比,對人 HL-60早幼粒細胞白血病細胞系的細胞毒性適度增強[39]。CAR-NK-92細胞也已針對多發性骨髓瘤細胞進行了探索。江等人報導了用抗 CD38 轉導的NK-92細胞在體外以及在異種移植 NOD-SCID 小鼠模型中,對骨髓瘤細胞系和原發性骨髓瘤細胞具有很強的抗腫瘤活性 [40],用表達抗 CS1/SLAMF7 CAR的NK-92 細胞觀察到類似的結果 [41]。

為了提高源自NK-92細胞系的CAR-NK細胞的效率,最初用於T 細胞的第4代CAR在一個名為 UniCAR 的平臺上生產。UniCAR 系統由兩個元素組成:

(i)針對肽表位 E5B9 的 CAR-NKG2——一種非天然在細胞表面表達的抗原;

(ii) 稱為目的模組 (TM) 的雙特異性組件。這種雙特異性模組在一側表達 E5B9 抗原,另一側表達對腫瘤抗原特異的抗體(圖 2)。該構建體使 CAR-NKG2 細胞(通過E5B9抗原)和靶細胞(通過特異性抗體)之間能夠接觸。除此之外,效果可以立即停止(開/關效果),因為 TM 的壽命很短。一旦停止TM的穩定(連續)輸注,TM就會被淘汰,UniCAR也會失活。事實上,該系統通過改變可以同時或以順序方式給予的TMs來實現大量腫瘤抗體的靶向選擇 [42]。

源自臍帶血的 NK 細胞

臍帶血是NK細胞的豐富而有趣的來源,因為國際血庫有數十萬個臍帶血 (UCB) 單位可供使用。NK細胞占臍帶淋巴細胞的15%至 30%。它們的表型比成人外周血細胞的表型更不成熟,具有非常特殊的特徵,包括低CD16(低ADCC能力)、CD56 bright(比細胞毒性更具有增殖能力)、NKG2A+(一種抑制性受體,識別 HLA-E)和低 KIR(功能比其對應物少)[43]。然而,這些限制可以通過使用細胞因數和轉染的離體擴增和啟動來克服,並且根據筆者的經驗,與來自血細胞的 CAR-NK 相比,來自臍帶血的 CAR-NK 細胞在流式細胞術中觀察到具有相同的啟動特徵。即使 UCB 中的 NK 細胞或多或少稀少,它們也具有非常重要的增殖能力,並且對細胞因數刺激非常敏感,可以進行離體擴增。

由 Tezvani 等人帶領的 MD Anderson 團隊。最近發表了一項非常令人鼓舞的 I/II 期臨床試驗,該試驗在 11 名患有復發性難治性 B 細胞惡性腫瘤(從非霍奇金淋巴瘤到慢性淋巴細胞白血病)的患者中注射來自新鮮 UCB 的CAR-NK-CD19 細胞(ClinicalTrials.gov ,NCT03056339)(圖3)。用研究中使用的三種劑量之一(1×105、1×106或1×107每公斤細胞數)在淋巴清除化療(氟達拉濱和環磷醯胺)後。

值得注意的是,UCB NK細胞輸注後沒有注意到不良反應或毒性,特別是CRS 或神經毒性,試驗中未達到最大耐受劑量。反應在注射後的第一個月迅速出現,在11名受試者中,有7名患者完全緩解,並在 Richter 轉化中恢復到CLL狀態。儘管如此,重要的是要展示一個事實,即一半的患者在注射NK細胞後接受了維持治療,由來那度胺、利妥昔單抗、維奈托克或HSCT組成的綜合方案。在注射後長達12個月內檢測到NK細胞。最有可能的是,在 CAR結構中添加IL-15基因有助於CAR-NK細胞的長期存活,儘管持久性機制尚未闡明。

此外,一個可能且非常重要的技術挫折是直接從新鮮UCB生產 CAR-NK細胞,以及在生產後立即注射,沒有任何凍存步驟。事實上,由於從冷凍保存的細胞中選擇NK細胞的效率低,可能不應該推薦使用來自國際銀行的冷凍保存的臍帶血來生產CAR-NK細胞。根據 MD Anderson 團隊的經驗,從新鮮臍帶血中擴增可能是一種選擇——或者更確切地說,建立選定的冷凍保存的NK細胞庫,這些細胞可以解凍和擴增以進行轉導。還應注意的是,CAR-NK細胞在冷凍保存後活性有所降低,在目前的技術條件下,CAR-NK細胞應在培養後立即給藥。即使CAR-NK細胞的具體長期療效難以評估,並且該工藝在冷凍細胞上的可行性尚待確定,但結果非常有希望[44]。

 

圖3. 來自臍帶血的 CAR-NK 細胞:CAR-NK 細胞的結構[45],來自 MD 安德森中心。CAR-NK 細胞是從具有共刺激 CD28 結構域的經典 CD19 CAR 獲得的,其中添加了自殺基因和 IL-15 基因。

 

來自外周血的NK細胞

如前所述,大多數採用過繼性NK療法(不包括CAR-NK細胞)的研究都使用了來自單倍體相關或不相關供體的細胞,並已在兒童和成人AML中顯示出抗腫瘤反應 [29,46]。然而,缺點是需要從健康的成年志願者那裡收集細胞,這使得該過程比使用UCB稍微複雜一些。在細胞因數存在的情況下,一些簡單的、符合GMP的培養條件可以將它們的擴增提高25-55倍 [49]。如果來自PB的NK細胞與CB NK細胞相比具有高細胞毒性,那麼在CAR-NK療法的背景下,供體在HLA不相容性方面的選擇是否應該有所不同仍有待證明。

Leivas 等人的團隊描述了一種可以使用和衍生自PBMC的方法[53]。在活化和擴增的NK細胞 (NKAE) 和記憶T細胞 (CD45RA-T 細胞) 之間選擇效應細胞。NK或T細胞在與NKG2D-4-1BB-CD3z-CAR 載體一起培養後轉導,使用在NK和T細胞上表達的 NKG2D 啟動劑受體,以及用於轉導的4-1BB(見上文)。NKG2D 具有特定的配體,包括 MICA、MICB 和 ULBP,它們在應激細胞和許多腫瘤細胞上表達,特別是在多發性骨髓瘤中。在體外,記憶T細胞的轉導比其NK對應物更穩定。然而,CAR-NKAE細胞在體外對MM細胞表現出更強的細胞毒性,同時保護健康細胞免受損傷。此外,在他們的小鼠異種移植骨髓瘤模型中,與T細胞相比,CAR-NKAE細胞表現出高效的細胞毒性和增強的抗骨髓瘤活性。

 

另一種方法是使用 Cas9/RNP 和腺相關病毒基因遞送的 CRISPR 靶向 CAR 基因插入。使用這種技術,產生了具有不同跨膜和信號結構域(CD4/4-1BB+CD3 和 NKG2D/2B4+CD3)的靶向 CD33 的CAR-NK,並且似乎在原代NK細胞中顯示出增強的抗 AML活性 [54]。

 

源自 iPSC 的 NK 細胞

誘導多能幹細胞 (iPSC) 是經過基因重程式設計成為多能幹細胞的分化細胞。成熟分化細胞重程式設計為 iPSC 的過程包括對細胞進行基因改造,使其表達四種基因:Klf4、C- myc、Oct3/4和Sox2,從而具有與胚胎幹細胞相同的特徵。 因此,分化的成人重程式設計細胞獲得了無限增殖的潛力,並且在加入特定生長因數後可以分化成任何細胞類型,這使得它在許多醫學領域都有用武之地——特別是再生醫學、細胞療法或遺傳病的模型化。這一發現獲得了 2012 年諾貝爾醫學獎,授予神戶大學(日本)研究員山中伸也 [55]。由於它們的永生特性,單個iPSC足以生產和生成通用的 CAR-NK“現貨”產品。由iPSC產生的NK細胞具有不成熟的表型,具有低CD16、高 NKG2A和低KIR,具有較差的細胞毒性,但具有非常重要的增殖能力。為了增強它們的細胞毒性並使其持久存在,可以添加用於表達CD16 和 IL-15 或 IL-2的基因 [56, 57]。

FT596產品是第一個“即用型”、通用和同種異體CAR-NK細胞產品,源自iPSC技術,並且已經獲准在美國用於臨床研究 [58]。它由針對NK細胞優化的抗CD19 CAR組成,具有啟動劑受體 NKG2D的跨膜結構域、2B4共刺激結構域和 CD3 信號傳導結構域。添加了兩個關鍵成分:

(i) 一種新型、高親和力、不可切割的 CD16 Fc 受體 (hnCD16),可在沒有負調控的情況下實現腫瘤靶向和增強抗體依賴性細胞毒性,並結合靶向治療性單克隆抗體腫瘤細胞;

(ii) 促進細胞因數非依賴性持久性的 IL-15/IL-15 受體融合蛋白 (IL-15RF)(圖 4)。當與利妥昔單抗(抗CD20)等單克隆抗體聯合使用時,FT596的hnCD16 Fc受體與覆蓋腫瘤細胞的單克隆抗體的Fc部分結合,啟動NK細胞,分泌細胞因數,增強ADCC。IL-15RF促進NK細胞和活化的抗腫瘤 T 細胞的細胞毒性。

ASH 2020期間的一份通訊報導了一名76歲女性在接受八線治療(包括 ASCT、自體過繼 T 細胞治療和活化的半相合NK細胞)後復發難治性 DLBCL 的病例 [59]。

該患者在淋巴清除單藥治療後接受了獨特劑量的30×106 FT596 細胞。除了中性粒細胞減少症外,沒有報告與FT596細胞相關的副作用。在1個月閾值的腫瘤反應評估顯示基於 2014 Lugano 標準的部分反應,18 F-Glu 吸收減少超過70%,腫瘤大小減少超過 50%。該患者的第二劑 FT596 正在進行中。一項 I 期研究也在進行中,估計有 285 名患者入組(clinicaltrials.gov:NCT04245722)。

 

結論

同種異體 CAR-NK 細胞提供了許多有趣的視角,可以解決使用自體CAR-T細胞所面臨的一些問題。迄今為止,同種異體NK細胞面臨的主要挫折是它們相對較短的作用持續時間,以及缺乏標準化工藝。與CAR-T細胞相比,CAR-NK細胞療法在很大程度上屬於起步階段;截至2022年5月1日,共有35項試驗涉及CAR-NK細胞,與臨床試驗網站上涉及CAR-T細胞療法的1181項試驗相比,證實了這種創新療法的資料較少。CAR-NK細胞療法在抗擊癌症方面具有廣闊的前景,但仍需更多研究加以論證。

 

 

NK細胞療法需求在增加(《Nature》子刊)

http://caifuhao.eastmoney.com/news/20240316132557756314340

將自然殺傷細胞(NK細胞)用於癌症免疫治療劑很有吸引力,因為與T細胞不同,它們可以逃避免疫排斥並且不會誘發細胞因數風暴。但在有效的治療中捕捉它們的活性還正在探索中。

今年,《Nature Biotechnology》上發表了一篇題為“Industry appetite for natural killer cells intensifies”的新聞報導,來自愛爾蘭的作者Cormac Sheridan對NK細胞在行業內的發展進行了梳理。

大型企業積極開展合作,將NK驅動的專案和工具納入其產品組合。人們對NK細胞的興趣也在不斷升級。12月,賽諾菲加深了對基於抗體的NK細胞接合器的研發,擴大了與法國馬賽InnatePharma公司的持續合作夥伴關係。

幾個月前,賽諾菲還轉向Scribe Therapeutics的CRISPR平臺,開發現成的腫瘤NK細胞療法,並預付了2500萬美元,這筆交易可能價值10億美元。

其他與艾伯維(AbbVie)、百時美施貴寶(Bristol Myers Squibb)、吉利德科學(Gilead Sciences)、默克(Merck)、英國劍橋阿斯利康(AstraZeneca)、東京武田(Takeda)的交易和合作夥伴關係也增添了這一勢頭。

然而,大多數專案還處於早期階段,開發人員在很大程度上仍在尋找功效的跡象,並完善大規模生產細胞的方案。

NK細胞對於免疫監控很重要。作為先天免疫系統的一部分,它們可以殺死病毒感染的細胞並消除癌症的早期跡象。作為免疫療法,NK細胞(無論是天然的還是工程化的)比T細胞更安全、更友好。

 

臨床開發中的NK細胞療法

“NK細胞的主要優點是,與CAR-T細胞不同,它們永遠不會殺死任何人。”加州大學三藩市分校和派克癌症免疫治療研究所的Lewis Lanier說道。他是過去40年NK細胞生物學研究的先驅。

細胞因數釋放綜合征如果發生在NK細胞治療期間,往往會溫和得多,這種現象背後的原因尚不完全清楚。“它們與骨髓細胞的相互作用不同,而骨髓細胞似乎是細胞因數釋放綜合征的主要驅動因素。”MD安德森癌症中心的Katy Rezvani說。她是第一個證明嵌合抗原受體(CAR)-NK療法臨床實用性的人。更重要的是,NK細胞療法非常適合同種異體方法,因為它們不會引起移植物抗宿主病。它們的細胞殺傷功能不涉及驅動細胞毒性T細胞活性的基於人類白細胞抗原的自我/非自我識別機制,因此來自無關供體的NK細胞不會攻擊宿主組織。NK細胞的活性是通過一系列與健康和應激細胞上表達的受體和配體的抑制和啟動相互作用來控制的。除了基於細胞的療法之外,投資者還投入了大量資金來資助大量針對特定抗原的抗體樣NK細胞接合器和雙特異性T細胞接合器。

 

臨床開發中選擇的NK細胞定向抗體

 

InnatePharma與賽諾菲在NK細胞接合器平臺上的合作最近得到加強,這家大型製藥公司獲得了針對免疫檢查點B7H3和啟動NK細胞受體CD16a和NKp46的臨床前多特異性NK細胞接合器的許可。賽諾菲也將採用Scribe的CasX編輯工具來增強其現有的K-NK細胞平臺,該平臺是賽諾菲在2020年收購Kiadis時獲得的。“提高體內持久性和改善對實體瘤的浸潤是兩個重點領域”,賽諾菲腫瘤學研究全球主管Valeria Fantin說道。

儘管具有潛在優勢,NK細胞療法仍落後於T細胞療法。原因在於NK細胞本身:事實證明,以工業規模對其進行擴展、培養和基因改造具有挑戰性。“即使到了今天,為了獲得臨床試驗所需的資料,大多數人最終還是像我們一樣使用飼養細胞。”Rezvani說。它們顯示出可促進NK細胞增殖的啟動配體,但受到輻射所以不會複製。

賽諾菲的K-NK平臺是一個例外:它不使用完整的細胞,而是使用帶有啟動受體的納米顆粒來提供刺激。解凍後不影響NK細胞活性的冷凍保存對於真正的現成療法至關重要,但也需要時間才能實現。開發人員面臨的另一個製造問題是需要提供外源細胞因數,例如白細胞介素(IL)-15,以擴增細胞並確保它們持續存在。

“T細胞會產生自己的生長因數,並且它們可以克隆擴增,NK細胞則不能。”Lanier說。一些開發人員通過改造NK細胞來規避這個問題,但Lanier說,過度啟動可能會導致脫敏。“如果我們只是將NK細胞浸泡在IL-15中,NK細胞就會被燒毀。”

開發人員還添加了CAR等功能,這些功能賦予細胞原本缺乏的抗原特異性。Lanier說:“這就是權衡,我們可以通過基因改造使它們越來越像T細胞。但到了某個時候,毒性也會成為負擔。”雙特異性接合器還旨在以腫瘤靶向方式啟動患者的內源性NK細胞,但它們面臨著不同的障礙:患者必須有足夠的健康NK細胞才能發揮作用。

 

這或許可以解釋為什麼Affimed的NK細胞接合分子AFM13作為單一療法效果有限,而與未經修飾的NK細胞療法聯合使用時表現出更有希望的活性。

AFM13是一種四價雙特異性NK細胞接合器,靶向抗體恒定片段(Fc)結構域受體CD16a(也稱為FcRIIIa)和CD30(一種在某些淋巴瘤中過度表達的受體)。該分子旨在指導NK細胞訓練針對表達CD30的癌細胞的抗體依賴性細胞毒性反應。將NK細胞接合器與NK細胞療法組合的另一種方法是將兩者結合在CAR-NK細胞中。Rezvani的團隊率先為這種方法建立了臨床概念驗證,採用的是帶有IL-15、由CD19導向的CAR-NK療法。

在11名復發或難治性CD19-陽性患者中,有8名(73%)出現緩解。陽性非霍奇金淋巴瘤(NHL)或慢性淋巴細胞白血病。8名應答者中有7名在中位隨訪13.8個月後完全緩解。

該專案目前稱為TAK-007,由武田(Takeda)負責,武田正在B細胞NHL患者中進行多中心試驗。NK導向療法能否比T細胞療法更成功地治療實體瘤仍然是一個懸而未決的議題。對於基於細胞或基於抗體的療法來說,將足夠的活性NK細胞引入腫瘤微環境,然後在它們進入後克服免疫抑制環境,這一挑戰都是需要面對的。一旦進入體內,差異就顯而易見:T細胞在接觸腫瘤抗原時會被啟動並增殖,而NK細胞不會以同樣的方式擴增。另一方面,CAR-NK細胞保留了非特異性殺傷能力以及更具針對性的功能。

Artiva首席執行官Fred Aslan表示,該公司對這種額外的抗原不可知機制“感興趣”,因為它可能有助於克服由於HER2等抗原丟失而導致的腫瘤免疫逃逸。在目前的發展階段,基於NK細胞的療法對其潛在的臨床效用產生的問題多於答案,但許多不確定性將在未來幾年內得到澄清。

 

NK細胞回輸有效控制多發和轉移,63.6%患者出現緩解

http://caifuhao.eastmoney.com/news/20240316102539877920570

肝細胞癌(HCC)目前是全球第六大常見癌症,也是2020年全球癌症相關死亡的第三大原因,HCC的治療策略是根據腫瘤分期來選擇的。索拉非尼或侖伐替尼一直是 HCC的常見治療方法,但對生存結果的影響有限,接受索拉非尼和安慰劑治療的HCC患者的中位OS 分別為10.7個月和7.9個月。因此,局部晚期HCC仍然非常需要新的、積極的治療方法。

NK細胞是肝臟先天免疫系統的重要組成部分,占肝內淋巴細胞的30%~50%。研究報導,HCC患者中NK細胞的數量和功能顯著降低,腫瘤浸潤NK細胞的減少與HCC晚期的生存不良相關。這表明肝內NK細胞在HCC免疫監視中發揮著重要作用。

在韓國和日本,肝動脈灌注化療(HAIC)已應用於局部晚期HCC的治療。理論上,HAIC 具有多種優勢,包括比全身治療更高的療效和更低的全身毒性,因為通過肝動脈輸注藥物的方式可以將化療藥物直接輸送到腫瘤細胞。5-氟尿嘧啶(5-FU)和順鉑是肝動脈輸注最常見的方案。值得注意的是,一些化療藥物(包括5-FU和順鉑)作為NK 細胞活性的有效誘導劑具有免疫調節作用。

基於這一假設,《Front Immunol》上發佈了一項1期研究,題為:“A Phase I Study of Locoregional High-Dose Autologous Natural Killer Cell Therapy With Hepatic Arterial Infusion Chemotherapy in Patients With Locally Advanced Hepatocellular Carcinoma”,該研究共納入11名標準治療難治的局部晚期 HCC(肝細胞癌)患者,通過肝動脈輸注單獨施用5-FU和順鉑,以在NK細胞輸注之前誘導腫瘤生長抑制。該研究的目的是評估局部高劑量自體 NK 細胞(VAX-NK/HCC)與 5-FU 和順鉑的 HAIC 聯合用於不適合治療或對標準治療無效的患者的安全性和有效性。

5天連續輸注NK細胞晚期肝癌患者完全緩解

參與受試的所有患者,在5-氟尿嘧啶(750mg/m2)和順鉑(25mg/m2)的HAIC(肝動脈輸注化療)治療4個週期後,通過肝動脈給藥,持續5天以劑量遞增的方式(劑量2.5×108,5×108,10×108NK細胞/注射)接受NK細胞治療。

Kaplan-Meier對生存結果的估計。(A)無進展生存期。(B)總生存期。

資料顯示,所有接收NK細胞治療的患者的治療反應均可評估。客觀緩解率(ORR)為63.6%,其中完全緩解(CR)4例(36.4%),PR( 部分緩解)3例(27.3%)。此外,兩名患者(18.2%)觀察到(疾病穩定)SD,兩名患者(18.2%)觀察到(疾病進展)PD,疾病控制率(DCR)為81.8%。

中位隨訪時間為 55.9 個月。所有患者的中位無進展生存期(PFS)為 10.3 個月,12 個月和 24 個月時的無進展生存期(PFS)分別為 36.4% 和 9.1%,總生存期(OS)分別為10.3個月和41.6個月。

 

6個療程NK細胞聯合治療,肺癌患者大部分多發轉移病灶消失

2023年8月,發表了一篇題為:“Investigation of the efficacy and feasibility of combined therapy of PD‐L1‐enhanced exogenous peripatetic adoptive natural killer (NK) cells in combination with antiangiogenic targeted therapy in the treatment of extensive‐stage small cell lung cancer”的研究,證實了NK細胞聯合治療帶來的滿意效果。

一名67歲男性患者患有廣泛期小細胞肺癌,原發灶位於右上肺,伴有胸膜和腹腔多發轉移,縱隔淋巴結腫大。局部放療後,採用聯合治療方法針對患者的多發性全身轉移灶。

針對腫瘤轉移的情況,研究者制定 (PD-L1)與外源自然殺傷 (NK) 細胞的聯合治療方案,以及抗血管生成治療。連續兩天將同種異體臍帶血 NK 細胞回輸患者體內。第一天,治療後服用1200毫克阿特珠單抗。隨後,患者每天口服10毫克安羅替尼,持續 14 天。隨後休息7天,每個週期持續21天。對右肺原發病灶及縱隔轉移淋巴結進行局部放療後,局部病灶完全緩解,有效避免了上腔靜脈綜合征的風險。

具體來說,位於右上葉的結節以及位於氣管、血管、主動脈旁動脈和下腔靜脈附近的右鎖骨上和縱隔區域的多個淋巴結中觀察到收縮。經過六個週期的聯合治療後,大部分轉移病灶消失,其餘轉移病灶體積明顯縮小。這些結果表明治療是有效的,導致大部分轉移灶消失,剩餘轉移灶明顯縮小。影像學評估表明治療方案是成功的,腫瘤處於部分緩解階段。

 

結語

很多的癌症患者在遇到轉移、復發等難題時,可選擇的治療方案非常局限,而NK細胞療法的研究帶來了轉機。大量的研究已證實NK細胞的效果和安全性。NK細胞能夠高效殺傷腫瘤細胞,有效控制轉移,提高生存品質,為癌症患者提供了新的希望。

 

參考資料:

 

[1]Bae WK, Lee BC, Kim HJ, Lee JJ, Chung IJ, Cho SB, Koh YS. A Phase I Study of Locoregional High-Dose Autologous Natural Killer Cell Therapy With Hepatic Arterial Infusion Chemotherapy in Patients With Locally Advanced Hepatocellular Carcinoma. Front Immunol. 2022 Jun 2;13:879452. doi: 10.3389/fimmu.2022.879452. PMID: 35720374; PMCID: PMC9202498.

 

[2]Wang Z, Zhang R, Cao Y, Chen Y, Huang S, Luo Y. Investigation of the efficacy and feasibility of combined therapy of PD-L1-enhanced exogenous peripatetic adoptive natural killer (NK) cells in combination with antiangiogenic targeted therapy in the treatment of extensive-stage small cell lung cancer. Thorac Cancer. 2023 Oct;14(28):2877-2885. doi: 10.1111/1759-7714.15040. Epub 2023 Aug 19.PMID: 37596831; PMCID: PMC10542463.

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