前言          

目前，腫瘤免疫治療方興未艾，群雄並起，其中最有效的治療策略之一就是過繼細胞轉移療法（ACT）。嵌合抗原受體（CAR）和工程化T細胞受體（TCR）是近年來主要的過繼性T細胞免疫療法。自然殺傷T（NKT）細胞是脂質反應性T細胞的一個子集，可增強抗腫瘤免疫。基於NKT細胞的免疫治療在臨床前展現出富有前景的治療效果，然而在臨床治療卻沒有取得明顯的效果。目前，一些新的治療策略正在開發應用於NKT細胞療法，有望在未來的臨床治療中取得突破。

NKT細胞

NKT細胞是脂質和糖脂反應性T淋巴細胞的一個子集，共表達與NK細胞相關的標記物（NKp46，NK1.1）。NKT細胞在腫瘤免疫監測和抗腫瘤免疫中起著重要作用。與MHC I或II識別肽抗原的傳統T細胞不同，NKT細胞識別通過MHC I樣分子CD1d呈遞的內源性和外源性糖脂。基於TCR重排和糖脂反應性，NKT細胞可分為兩個主要亞群：I型和II型NKT細胞。I型NKT（又稱iNKT）細胞表達恒定的重排TCRα鏈與限制性的TCRβ鏈。在小鼠中，Vα14Jα18（TRAV11-TRAJ18）與Vβ7（TRB29）、Vβ8.2（TRB13-2）或Vβ2（TRBV1）配對；在人類，Vα24Jα18（TRAV10-TRAJ18）與Vβ11（TRBV25-1）配對。識別糖脂抗原後，iNKT細胞迅速分泌免疫調節細胞因數，包括IFN-γ、TNF和IL-4，以影響下游免疫活性。人類iNKT細胞可以是CD4，CD8雙陰性（CD4-CD8-), 而小鼠的NKT細胞是CD4+或CD4-CD8-。此外，iNKT細胞可分化為NKT1、NKT2和NKT17亞群，與Th1、Th2和Th17 T細胞亞群相似。

II型NKT細胞具有更多樣的Vα重排序列（包括TRAV7、TRAV9和TRAV12），有助於識別自身脂質，如硫酸腦苷脂或溶血磷脂醯膽鹼。多項研究表明，通過給予硫酸腦苷脂啟動II型NKT細胞可增加腫瘤生長並增強轉移，表明其具有促腫瘤作用，而iNKT細胞則表現出強大的抗腫瘤活性。

iNKT細胞介導的抗腫瘤作用

活化的iNKT細胞可通過四種機制提供抗腫瘤免疫：直接腫瘤溶解、招募和啟動細胞毒性固有和適應性免疫細胞、抑制腫瘤微環境（TME）中的抑制細胞以及促進腫瘤靶向免疫記憶。

直接或間接靶向

iNKT細胞可以直接或間接靶向腫瘤細胞。iNKT細胞有能力通過穿孔素、顆粒酶B和TNF相關凋亡誘導配體（TRAIL）途徑介導針對CD1d陽性腫瘤細胞的直接細胞溶解活性。體外和體內研究表明，iNKT細胞介導的細胞毒性與腫瘤細胞表面CD1d表達增加有關，導致腫瘤細胞溶解增強和轉移率降低，而CD1d的下調與iNKT細胞識別降低、腫瘤逃逸和惡性程度增加有關。

在腫瘤細胞上缺乏CD1d表達的情況下，iNKT細胞可能被CD1d+APC啟動，包括樹突狀細胞（DC）、B細胞、髓源性抑制細胞（MDSC）和腫瘤相關巨噬細胞（TAM）。iNKT細胞的反應在很大程度上取決於呈遞糖脂的APC。啟動後，iNKT細胞可分泌大量促炎細胞因數，包括IL-2、IL-4、IL-17、IFN-γ和TNF，這些細胞因數影響廣泛的免疫細胞，包括DC、巨噬細胞、中性粒細胞、NK細胞以及T和B細胞。此外，活化的iNKT細胞可以通過CD40/CD40L和CD1d/TCR相互作用積極招募和誘導DC成熟。

免疫抑制的調節

TAM是在TME中高頻出現的免疫抑制性免疫細胞。TAM有助於腫瘤進展和NK、iNKT和T細胞反應的抑制。在神經母細胞瘤中，iNKT細胞可以通過CD1d依賴機制共定位和裂解TAM。此外，iNKT細胞可以將M2極化TAM重新程式設計為炎性M1巨噬細胞，減少TAM介導的免疫抑制。MDSC誘導NK和T細胞無能，促進免疫抑制和腫瘤生長。此外，它們可以重塑TME，增加轉移率。在甲型流感感染模型中，iNKT細胞可以以CD1d和CD40依賴性方式抑制精氨酸酶-1和NOS2介導的MDSCs抑制活性。此外，NKT細胞可以刺激負載α-GalCer的MDSC轉化為成熟的APC，能夠誘導NK和T細胞免疫反應。此外，II型NKT細胞在TME中出現頻率較高，具有免疫抑制作用，增加腫瘤進展和轉移。iNKT細胞的啟動減少了II型NKT細胞的數量。

腫瘤免疫記憶的形成

免疫記憶的產生對於持久的抗腫瘤免疫反應和預防腫瘤復發至關重要。腫瘤抗原或交叉反應的外源抗原的啟動可誘導幼稚T細胞進行擴增和分化，以獲得適當的效應器功能來靶向癌細胞。CD8α+樹突狀細胞在MHC I交叉呈遞中表現出色，已證明iNKT細胞可直接促使CD8α+樹突狀細胞進行交叉啟動，即使在沒有CD4+T細胞的情況下也是如此。在多種腫瘤模型中，NKT細胞活化被證明能增強CD8+T細胞介導的抗腫瘤免疫。雖然大多數iNKT細胞缺乏CD62L，但最近的一項研究表明，在糖脂刺激後，CD62L+iNKT細胞增加，並且比CD62Lneg iNKT細胞持續時間更長。CD62Lneg iNKT細胞獲得衰竭表型（PD-1，TIM-3，細胞因數產生減少）並迅速發生凋亡，而CD62L+iNKT細胞繼續增殖並產生大量細胞因數。

基於NKT的細胞免疫療法

由於iNKT細胞在免疫監測和抗腫瘤免疫中的重要作用，基於iNKT細胞的免疫治療已成為一個重要的研究領域，目前已經使用多種策略來靶向癌症。

給予游離α-GalCer

在臨床前試驗中，可以預防性地、同時或在腫瘤接種後給予游離α-GalCer。注射游離α-GalCer後，iNKT細胞迅速增殖並產生TNF、IL-2、IL-4和IL-13，隨後出現IFN-γ反應，多次注射偏向Th2反應。雖然在多個小鼠模型中，腫瘤接種後給予游離α-GalCer具有一定的抗腫瘤作用，但抗腫瘤反應有限。因此，游離α-GalCer通常與細胞因數或其他免疫療法聯合使用，以提高治療效果。在I期臨床試驗中，α-GalCer的給藥耐受性良好，沒有劑量限制毒性；然而，它未能產生臨床反應，24名患者中只有7名SD。低療效可能歸因於基線時低iNKT細胞數量，因為只有高iNKT細胞數量的患者表現出NK細胞毒性和穩定疾病。

過繼轉移呈遞α-GalCer的DCs

負載α-GalCer的DC已被用於克服游離α-GalCer的低免疫原性和無能誘導。由於CD40和IL-12的共刺激信號傳導，將α-GalCer載入到DC上會導致iNKT細胞更強的啟動和更少的無能誘導。在多種腫瘤模型中，與游離糖脂給藥相比，α-GalCer負載的DC可減少腫瘤生長和轉移，從而延長生存期。負載α-GalCer的DC增加了iNKT的增殖、活化和IFN-γ的產生。此外，iNKT細胞的活化增強導致NK和CD8+T細胞的活化和IFN-γ產生增加。在骨髓瘤和頭頸癌的臨床試驗中，成熟的負載α-GalCer的APC耐受性良好，無嚴重不良事件。治療增加了IFN-γ的產生和iNKT細胞的擴增，導致許多患者病情穩定，中位生存時間延長。在非小細胞肺癌的I期和I/II期臨床試驗中，負載α-GalCer的APCs治療耐受性良好，僅導致I級和II級不良事件。對治療反應良好的患者表現出IFN-γ產生增加和iNKT細胞擴增。中位生存時間為31.9個月，而所有患者的中位生存時間為18.6個月。

過繼轉移活化的iNKT細胞

癌症患者通常iNKT細胞數量較少和/或功能降低，限制了α-GalCer治療的療效。為了克服這一限制，已從患者來源的PBMC中分離出iNKT細胞，並在體外擴增後過繼轉移回患者體內。在臨床前模型中，過繼轉移活化的iNKT細胞可增加黑色素瘤轉移模型中iNKT細胞的細胞毒性、腫瘤消退和總生存率。相反，在轉移性4T1乳腺癌模型中，NKT細胞單獨過繼或與游離α-GalCer療法或負載α-GalCer的DC聯合使用並不能改善預後。使用iNKT細胞過繼轉移治療非小肺癌和晚期黑色素瘤的臨床試驗未報告嚴重不良事件。患者的迴圈iNKT細胞數量和IFN-γ生成增加，但很少有患者腫瘤進展減少，表明該治療無效。將擴增的iNKT細胞過繼轉移與負載α-GalCer的DC相結合，可提高過繼NKT細胞轉移的效率。與單獨的iNKT過繼轉移相比，聯合治療可使一些患者獲得部分應答。

作為癌症疫苗佐劑

iNKT細胞在識別通過CD1d呈遞的保守脂質抗原方面的作用，以及它們通過細胞因數信號協調抗腫瘤免疫反應的能力，使其成為癌症疫苗開發的誘人靶點。iNKT細胞的配體，如α-GalCer，可與腫瘤抗原共同使用，作為佐劑發揮作用，增加對腫瘤的適應性免疫反應。在臨床前動物模型中，與腫瘤抗原聯用的α-GalCer可提高小鼠的總體存活率。用α-GalCer和OVA進行鼻內接種可誘導體液和細胞免疫反應，導致細胞因數分泌、CTL反應和IgG產生增加。目前，還沒有在癌症疫苗中使用iNKT細胞配體的註冊臨床試驗。

CD1d抗體融合蛋白

CD1d陽性腫瘤或更易受iNKT細胞介導的裂解，而CD1d下調是避免檢測的常見逃避策略。因此，為了增加iNKT細胞對腫瘤的靶向性，研究了將iNKT細胞直接導向腫瘤的CD1d抗體融合蛋白。目前，針對HER2、CEA和CD19的CD1d抗體融合蛋白已經開發出來。在表達HER2的B16黑色素瘤模型中，以HER2為靶點的CD1d抗體融合蛋白治療增加了iNKT細胞炎性細胞因數的產生和腫瘤細胞的靶向溶解，減少了轉移形成。此外，iNKT細胞增強了DC、NK細胞和CD8 T細胞的啟動，增加了腫瘤的整體免疫招募和靶向性。重要的是，CD1d抗體融合蛋白具有靶向特異性，顯示出良好的安全性。

CAR-NKT細胞

CAR-T細胞療法在靶向B細胞惡性腫瘤方面取得了顯著的臨床成功。iNKT細胞已被設計出表達針對糖脂和蛋白質抗原的CARs。此外，除CAR外，CAR-NKT細胞還共同表達恒定的TCR，維持其對糖脂抗原的反應性。相反，CAR-T細胞中的內源性TCR是多克隆的，大多數CAR-T細胞只能通過其CAR進行反應。

靶向CSPG4、GD2和CD19的CAR-NKT細胞已經開發出來，靶向GD2和CD19的CAR-NKT細胞正在進行臨床試驗。一項I期臨床試驗（NCT03294954）已經開始，檢測難治性神經母細胞瘤中的抗GD2 CAR-NKT細胞的療效和安全性。初步結果表明，10名入選患者的治療是安全的，其中1名完全緩解，1名部分緩解，3名患者病情穩定。

目前，CD19 CAR-NKT細胞正在進行一項I期臨床試驗（NCT03774654），檢測復發和難治性B細胞惡性腫瘤中的安全性和有效性。在I期試驗的兩名患者中，一名患者表現出完全回應，另一名患者表現出部分回應，兩名患者都沒有任何CRS或GvHD的跡象。重要的是，本研究中使用的CAR-NKT細胞是同種異體的，證明了“通用”療法的潛力。

基於NKT細胞的聯合療法

改進現有療法的一種方法是將其與產生協同反應的其他療法相結合。聯合療法也可能提高iNKT細胞免疫療法的臨床療效。在臨床前實驗中，iNKT細胞免疫療法已經與化療、溶瘤病毒和其他免疫療法進行了聯合試驗。

聯合化療

迄今為止，來那度胺是臨床試驗中唯一與iNKT細胞免疫療法聯合使用的化療藥物。在一項I期臨床試驗中，無症狀骨髓瘤患者接受載α-GalCer的DC聯合來那度胺治療。治療耐受性良好，僅有一名患者出現3級不良事件。治療導致iNKT細胞、NK細胞、單核細胞和嗜酸性粒細胞的啟動增加，顯示出強烈的先天免疫啟動。此外，NKG2D在NK細胞上的表達顯著增加，表明NK細胞的細胞毒性潛力增加。總的來說，治療導致除一名患者外所有患者的腫瘤相關免疫球蛋白降低，表明治療降低了腫瘤負擔。聯合治療的成功強調了進一步臨床試驗的必要性。

與溶瘤病毒聯合

迄今為止，還沒有臨床試驗將溶瘤病毒與iNKT細胞免疫療法相結合。然而，臨床試驗表明溶瘤病毒可以改善其他免疫療法的效果。溶瘤病毒療法與iNKT細胞活化療法相結合的臨床前的成功結果表明，有必要在臨床試驗中進一步檢查這種聯合療法。

聯合免疫治療

聯合治療的一個有趣的選擇是聯合iNKT細胞治療和免疫檢查點抑制劑。α-GalCer啟動iNKT細胞後，IFN-γ大量釋放，隨後PD-1表達增加，導致無能和抗腫瘤功能抑制。因此，聯合iNKT細胞免疫治療和阻斷PD-1/PD-L1軸的檢查點抑制劑可能提高治療效果。事實上，在臨床前模型中，α-GalCer聯合抗PD-1或抗PD-L1可防止iNKT細胞無能增加iNKT細胞的抗腫瘤活性。此外，iNKT細胞免疫治療可以克服PD-1耐藥腫瘤中的CD8+T細胞無能。臨床試驗正在測試PD-1/PDL-1阻斷劑和iNKT細胞免疫治療的組合（NCT03897543）。

NKT細胞療法面臨的挑戰和應對

iNKT細胞免疫治療面臨的最大挑戰是癌症患者中iNKT細胞的低浸潤和功能降低。再加上腫瘤細胞CD1d的下調，治療效果可能會受到限制。此外，iNKT細胞在用游離α-GalCer治療後誘導無能表型，降低了多劑量治療的療效。另一個挑戰是從免疫抑制的癌症患者中獲得大量自體DC和iNKT細胞，從而限制可擴增和過繼轉移的細胞數量。此外，培養和分化細胞進行過繼轉移需要數周時間，導致一些患者無法接受治療或死於疾病[。為了應對這些挑戰，許多研究對iNKT細胞免疫療法進行了改進。

改進糖脂輸送

由於游離α-GalCer的低效性和難以獲得大量自體DC，一些研究檢測了α-GalCer通過載體（如納米顆粒、人工抗原遞呈細胞、外泌體和脂質體）傳遞的可能性。與游離的α-GalCer相比，載體結合的α-GalCer的遞送增加了iNKT細胞的擴增和細胞因數的釋放，從而降低了腫瘤負荷。這主要是由於DC細胞的攝取和表達增加，以及下游NK和CD8+T細胞反應增加。

選擇糖脂替代物

幾乎所有iNKT細胞免疫治療的臨床試驗都使用α-GalCer（KRN7000）刺激iNKT細胞；然而，越來越多的修飾糖脂可能提供更高的治療效益。例如，α-C-GalCer將α-GalCer中發現的O-糖苷鍵替換為C-糖苷鍵，從而增加IFN-γ和IL-12的產生。7DW8-5是一種候選糖脂，它的醯基鏈較短，末端為氟化苯環。與α-GalCer相比，7DW8-5對iNKT細胞的CD1d和TCR具有更強的親和力，在多種疫苗模型中，7DW8-5刺激iNKT細胞可增加Th1和CD8+T細胞反應。類似地，一種被稱為ABX196的修飾糖脂作為疫苗佐劑已經產生了有希望的結果。在黑色素瘤、結腸癌和膀胱癌模型中，ABX196單獨或與抗PD-1聯合使用可增加腫瘤消退和總生存率。ABX196聯合PD-1抑制劑目前正在進行一期臨床試驗（NCT03897543）。

誘導多能幹細胞衍生的iNKT細胞

癌症患者通常會減少iNKT細胞的數量和功能，從而限制了iNKT細胞免疫療法的療效。此外，很難從免疫抑制的癌症患者獲得足夠的PBMC來體外擴增和輸送iNKT細胞。一種應對策略是使用來自患者組織的誘導多能幹細胞（IPSC）。iPSC誘導的iNKT細胞能夠分泌大量IFN-γ。此外，體內試驗表明，iPSC衍生的iNKT細胞在轉移到小鼠體內時保持了其抗腫瘤功能。

靶向Ⅱ型NKT細胞

iNKT細胞和II型NKT細胞在腫瘤免疫調節中發揮相反的作用，並相互交叉調節。因此，靶向II型NKT細胞可能是緩解腫瘤介導的iNKT細胞免疫抑制並增強抗腫瘤免疫的治療方法。最近發現的II型NKT細胞硫酸腦苷脂抗原的一種亞型C24:2被證明能顯著減少肺轉移的發生。

小結

iNKT細胞在免疫監測和抗腫瘤免疫中起著重要作用。基於NKT細胞的免疫療法具有眾多優勢，相比於CAR-T細胞治療，NKT細胞治療作用時間更久，更能夠抑制癌症的復發和轉移，將可能成為實體瘤等癌症的重要治療方式。

雖然，目前臨床研究仍然沒有取得突破，但一些新的治療策略，包括載體化的α-GalCer、替代性糖脂和聯合療法，正在顯示出改善的臨床前結果。隨著免疫細胞治療實體瘤技術的不斷突破，NKT細胞免疫治療行業將會得到快速發展，相信未來基於NKT細胞的免疫療法將會大放異彩。

參考文獻：

1.The Current Landscape of NKT CellImmunotherapy and the Hills Ahead. Cancers (Basel). 2021 Oct; 13(20): 5174

近日，國際期刊《Current Stem Cell Research & Therapy（幹細胞研究與治療》刊登了全球首例人類間充質幹細胞成功治療哮喘的臨床病例報告，為哮喘的臨床干預提供了新的治療手段。哮喘，又名支氣管哮喘，是呼吸系統慢性炎症性疾病之一，以氣道炎症和氣道重塑為主要特徵。對於患者而言，在日常生活中，由於受到該病影響，往往容易出現胸悶、氣短、喘咳以及呼吸受限等症狀，嚴重者可能出現氣胸、呼吸衰竭或迴圈衰竭。普通哮喘的病因尚不清楚，可能是許多基因之間的複雜相互作用、環境條件以及營養狀況導致的。而重症哮喘有著獨特的發病機制，主要表現為以中性粒細胞為主的炎症反應、氣道上皮損傷、氣道重塑以及糖皮質激素抵抗。儘管目前糖皮質激素聯合短效β受體激動劑已被推薦為治療哮喘的一線方案，但仍有部分哮喘患者在規範使用3種及以上的藥物後仍無法獲得緩解，成為所謂的嚴重治療抵抗型哮喘 ( STＲA) ，最終發展為重症哮喘/難治性哮喘。重症哮喘患者約占哮喘總體患病人群的 5%～ 10%，但其醫療資源的消耗卻是普通患者的15倍，病死率則超過普通患者的20倍。因此，尋找新的治療措施迫在眉睫。

間充質幹細胞(MSCs)是一種在多種組織中出現的具有多向分化潛能的成體幹細胞。近年來，研究紛紛揭示MSCs與免疫系統的相互作用及其背後的機制，明確MSCs具有明顯的抗炎、調節免疫、促進組織修復的作用，是哮喘潛在的治療措施。2022年，Joshua Sharan等人發表了全球首例人類間充質幹細胞成功治療哮喘的臨床病例報告：一名長期哮喘患者在接受臍帶來源的間充質幹細胞治療後獲得了顯著且安全的持續改善。該報告刊登在國際期刊《Current Stem Cell Research & Therapy（幹細胞研究與治療》上。

幹細胞治療哮喘作用機制

間充質幹細胞是幹細胞家族中的重要成員，可作為理想的種子細胞用於衰老和病變引起的組織器官損傷修復。間充質幹細胞可通過細胞間的直接接觸、產生細胞因數等多種途徑抑制T細胞的增殖、NK細胞的殺傷作用、樹突狀細胞的成熟和內吞功能，並上調Treg的表達，具有非特異性的免疫抑制作用。因此，對於哮喘這一因慢性炎症所致的氣道病變，應用MSCs不僅有助於修復損傷的氣道上皮，還可通過抑制氣道炎症反應而發揮治療作用。早在二十一世紀初，就有學者嘗試進行間充質幹細胞治療哮喘動物研究，研究成果均表明間充質幹細胞可減輕氣道炎症的進展。

其作用機制包括以下幾點。

首先，間充質幹細胞可以抑制Th1向Th2細胞分化，減輕哮喘患者Th1/Th2細胞比例失調，同時減少2型細胞因數以及IgE的表達，並且可以使促炎環境向抗炎環境轉換，尤其是間充質幹細胞-T細胞之間的相互作用在抑制T細胞活動中起到重要的作用。其次，間充質幹細胞通過分泌TGF-β1等免疫負調節因數實現免疫調節作用，同時，TGF-β1又可使MSCs向哮喘模型的氣道遷移。再次，MSCs還可以促進Treg細胞的擴增以及增強Treg細胞的作用。最後，MSCs的抗炎和抗纖維化作用可能減輕慢性哮喘的氣道重塑。（注，氣道重塑可使支氣管哮喘患者的氣道炎症的可逆性降低，對哮喘治療藥物的反應性降低，使哮喘患者在脫離與變應原接觸後，肺功能指標持續降低，甚至對糖皮質激素耐藥，最終導致病情的進一步惡化，從而增加哮喘的死亡率。）

幹細胞治療哮喘臨床研究

由於在臨床前研究中，間充質幹細胞（MSCs） 已證明能夠改善哮喘的症狀和免疫途徑。2022年，Joshua Sharan等人進行了同種異體成人臍帶衍生間充質幹細胞靜脈輸注治療哮喘的1期臨床試驗。參加試驗的第一位患者是一名有長期哮喘病史的68歲男性，因持續性哮喘症狀而要求間充質幹細胞治療。研究人員將培養的同種異體來源的臍帶間充質幹細胞在40分鐘內以1億個細胞的劑量靜脈輸注到他體內。治療後隨訪在兩個月和六個月後進行。在治療後的兩個月內，他使用救援吸入器減少到每月1次，減少了90%以上。此外，他的霧化器使用量減少了 70%。 在6個月的隨訪中，間充質幹細胞治療顯著且安全地持續改善了他的哮喘臨床症狀。在整個治療及隨訪期間患者沒有與治療相關的不良事件或併發症。

總結：

主流醫學上，哮喘是不能治癒的，只能減少哮喘對日常生活的影響，不讓哮喘出現急性嚴重狀況。但我們從最新的研究可以得出下面的結論：幹細胞技術或許能夠實現治癒哮喘的目標。相信隨著近些年再生醫學技術的不斷革新，幹細胞技術將為更多哮喘患者帶去新的希望。

在過去的十年裡，癌症免疫治療獲得了相當大的發展勢頭，特別是在免疫檢查點抑制[1]和過繼細胞治療(ACT)的形式，這包括在體外擴增時注入自體或同種異體淋巴細胞，以及(在某些情況下)基因工程。然而，儘管表達自體嵌合抗原受體(CAR)的T細胞已迅速成為治療各種血液系統惡性腫瘤的中流砥柱，但這種ACT變體尚未被批准用於實體腫瘤的治療，也沒有其他形式的ACT獲得監管部門批准用於癌症患者的常規臨床應用。此外，儘管接受表達CAR的T細胞的血液腫瘤患者中有80%以上經歷(通常是深刻的)客觀反應，但其中相當大一部分患者最終會復發，通常(但不總是)是由於抗原CAR靶點的喪失。因此，ACT領域有很大的改進空間。

圖片來源：https://doi.org/10.1186/s12943-022-01672-z

近日，來自瑞典斯德哥爾摩卡羅林斯卡研究所腫瘤學-病理學系的研究者們在Molecular Cancer雜誌上發表了題為“NK cells and solid tumors: therapeutic potential and persisting obstacles”的綜述性文章，該研究回顧了在實體腫瘤中抑制NK細胞的代謝和細胞屏障，同時討論了避開這些障礙以達到更好的治療活性的潛在策略。

自然殺傷細胞(NK細胞)是一種天生的淋巴細胞，具有很強的細胞毒活性，近年來作為潛在的抗癌治療藥物引起了人們的關注。雖然NK細胞介導了白血病患者的鼓勵性反應，臨床前和臨床資料表明，NK細胞輸注治療實體腫瘤的療效受到多種因素的阻礙，包括腫瘤的侵襲不足和腫瘤微環境(TME)的持續/啟動。TME的一些代謝特徵，包括低氧以及腺苷、活性氧和前列腺素水準的升高，都會對NK細胞活性產生負面影響。此外，腫瘤相關的成纖維細胞、腫瘤相關的巨噬細胞、髓系來源的抑制細胞和調節性T細胞主動抑制NK細胞依賴的抗癌免疫。

實體瘤中免疫和基質屏障對最佳NK細胞活性的影響

圖片來源：https://doi.org/10.1186/s12943-022-01672-z

研究者推測，旨在實現強大的腫瘤侵襲和保護NK細胞免受TME代謝和免疫條件影響的組合策略是釋放過繼轉移的NK細胞對人類實體瘤治療潛力的關鍵。

參考文獻Le Tong et al. NK cells and solid tumors: therapeutic potential and persisting obstacles. Mol Cancer. 2022 Nov 1;21(1):206. doi: 10.1186/s12943-022-01672-z.

前言

抗體依賴性細胞介導的細胞毒性（ADCC）是一種有效的細胞毒性機制，主要通過自然殺傷（NK）細胞介導。當特異性抗體結合到靶向細胞膜上以後，免疫細胞通過該反應誘導細胞死亡。這是抗體限制和控制感染的幾種主要機制之一。抗體和免疫細胞的相互作用通過一個受體家族發生：Fc受體（FcR）。在人類中，IgG的FcR家族（FcγR）由6個受體組成：FcγRI／CD64、FcγRIIa／CD32a、FcγRIIb／CD32b、FcγRIIc／CD32c、FcγRIIIa／CD16a和FcγRIIIb／CD16b，其中CD16a主要負責觸發NK細胞介導的ADCC。因此，對CD16a作用機制的瞭解，有助於我們通過改善單克隆抗體最大限度地發揮NK細胞的潛力，從而擴大癌症免疫治療的範圍。

ADCC的作用機制

NK細胞是一種天然的淋巴細胞，能夠非常有效地破壞應激細胞，如病毒感染或腫瘤轉化細胞。通常情況下，ADCC效應主要通過結合FCR的抗體啟動NK細胞，NK細胞膜上最具特徵的FcR就是FcγRIII（CD16），其中NK細胞主要表達CD16a，而CD16b僅限於中性粒細胞。人類NK細胞分為兩個主要亞群：CD56bright和CD56dim。CD56brightNK細胞是強有力的細胞因數產生者，但缺乏CD16a；而CD56dim具有高度的細胞毒性，表達CD16a。

當通過CD16a識別IgG調理的靶點時，NK細胞就會釋放不同的細胞毒性分子，從而引發靶細胞的死亡。這種機制依賴於免疫突觸的形成和含有穿孔素和顆粒酶的溶解顆粒的脫顆粒。除了脫顆粒外，NK細胞還可以通過將靶死亡受體（如DR4、DR5或Fas）與其死亡受體配體（如FasL和TRAIL）結合來清除靶細胞。

CD16a的生物學

CD16a是一種跨膜受體，具有短的C－ter胞質尾，並具有兩個細胞外Ig樣結構域。它的細胞內部分不具有任何信號成分，因此，為了傳遞信號，它需要兩條帶有免疫受體酪氨酸基啟動基序（ITAM）的信號鏈。

CD16a與IgG的CH2以1：1的方式相互作用，其中CH2上的N297位的 N－聚糖鏈在這種相互作用中也起著關鍵作用。因此，不僅氨基酸序列，其聚糖組成都可以極大地影響CD16a對Fc的親和力，從而影響ADCC的效力。

CD16a在其細胞質尾部不具有任何ITAM結構域，因此需要兩條含有ITAM結構域的細胞內鏈串聯的幫助，CD3ζ和Fc?RIγ。CD16a結合後，屬於Src家族的激酶Lck被啟動，並磷酸化CD3ζ和／或Fc?RIγ的ITAM結構域。磷酸化的ITAM允許來自Syk家族的激酶招募和磷酸化，例如Syk和ZAP－70，它們反過來負責後續的信號傳導。在它們的底物中，PI3K是高度相關的，因為它將PIP2轉化為PIP3，PIP3經PLC－γ處理後釋放IP3和DAG。DAG啟動PKC家族，這有助於觸發脫顆粒。IP3誘導鈣從內質網釋放，這種鈣內流是ADCC觸發的主要信號之一，也導致核內NFAT易位，誘導其靶基因的轉錄。CD16a參與啟動的其他途徑也有助於ADCC，例如ERK2 MAPK途徑。

CD16a依賴性NK細胞殺傷後，CD16a迅速下調。CD16a脫落的機制之一是由去整合素和金屬蛋白酶17（ADAM17）介導的，後者在NK細胞上表達。ADAM17對CD16a的切割發生在順式結構中，這意味著表達ADAM17的NK細胞不能在另一個NK細胞上誘導CD16a脫落。啟動後CD16a下調的另一個機制是內化，這不僅發生在CD16a上，也發生在其他細胞內信號成分上，如CD3ζ、ZAP－70和Syk。

提高ADCC作用的策略

細胞因數

提高ADCC活性的一個簡單方法是用促炎細胞因數刺激NK細胞。NK細胞移植已在多個臨床試驗中成功進行，例如通過輸注細胞因數誘導記憶樣（CIML）NK細胞，最常用的細胞因數組合包括IL－12、IL－15和IL－18。CIML NK細胞比傳統NK細胞表達更多的IFN－γ，對白血病細胞和原發性急性髓系白血病（AML）母細胞顯示出優越的細胞毒性。

IL－12會增加NK細胞產生IFN－γ和TNF－α，在一項I／II期臨床試驗中，西妥昔單抗與IL－12聯合應用於無法切除或復發的頭頸部鱗狀細胞癌患者。與無進展生存期（PFS）小於100天的患者相比， PFS大於100天的患者NK細胞在體外具有更高的ADCC活性。

IL－15是NK和CD8＋T細胞生存和功能所必需的細胞因數。N－803是一種突變的N72D IL－15超激動劑，在臨床前模型和臨床試驗中顯示出增強的NK細胞體外和體內活性。此外，它還增加了NK和CD8＋T細胞的數量。

抑制ADAM17

ADAM17是啟動後CD16a下調的主要驅動因素。改善NK細胞ADCC的一種策略是通過靶向ADAM17來防止CD16a脫落。研究發現，對NK細胞中使用CRISPR／Cas9技術敲除ADAM17，顯示出更好的IFN－γ生成和體內外ADCC活性。然而，也有研究顯示，阻斷ADAM17降低了NK細胞的存活率以及CD16a介導的連環殺傷，細胞無法與靶細胞分離，阻礙其運動到另一個靶細胞。

總之，ADAM17抑制的益處尚不清楚，結果也有爭議。這一策略是否能夠成功，有待于一項正在進行的臨床試驗（NCT04023071）結果，該試驗將評估攜帶不可切割CD16a的iPSC衍生NK細胞在AML和B細胞淋巴瘤中的應用。

工程化抗體

抗體的Fc部分進行工程化改造，可以增加Fc對CD16a的親和力，並隨後改善ADCC。一些突變非常流行，例如，所謂的GASDALIE，由Fc中的4個替換組成：G236A／S239D／A330L／I332E。該突變顯示對CD16a的親和力顯著增加，而CD32b親和力幾乎沒有增加。

另一個突變稱為突變體18（F243L／R292P／Y300L／V305I／P396L），ADCC顯著增加。這些突變現已作為抗HER2抗體margetuximab進入臨床，並在I期治療各種HER2陽性癌時顯示出良好的效果。

此外，抗體Fc N－聚糖的糖工程化有望增加對CD16a的親和力。研究最多的糖修飾是去糖基化，例如去岩藻糖修飾。這種修飾導致與CD16a的結合增加，ADCC改善。這項技術已被用於抗CD20抗體obinutuzumab。

NK細胞接合器

除了工程化抗體之外，還可以研究抗體的形式。基於雙特異性T細胞接合器（BiTE）策略的成功，為NK細胞開發了一種類似的形式，即所謂的雙特異性殺傷細胞接合器（BiKE）。BiKE由兩個scFv通過連接序列組成，一個單鏈抗體靶向CD16a，另一個靶向腫瘤抗原。

此外，還有三特異性殺傷細胞接合器（TRiKE），有2種腫瘤抗原與CD16a一起被靶向，或者添加IL－15代替第三種單鏈抗體。這種結構的使用允許NK細胞重新定位到腫瘤細胞，並導致針對靶細胞的強大ADCC作用。

AFM13是一種針對CD16a和CD30的雙特異性抗體，目前處於臨床Ⅱ期，用於治療外周T細胞淋巴瘤、轉化型蕈樣變性和霍奇金淋巴瘤。在一項治療復發或難治性霍奇金淋巴瘤的Ib臨床研究中，AFM13與pembrolizumab的聯合治療產生了88％的客觀反應率，總反應率為83％。GTB－3550是一種CD16／CD33／IL－15的TRiKE形式，目前正在進行多種類型白血病的I／II期試驗研究（NCT03214666）。

調節代謝途徑

代謝失調是腫瘤微環境中免疫抑制的關鍵驅動因素，許多研究已經表明，免疫細胞代謝對其功能至關重要。最近，一些代謝藥物在增強NK細胞活性方面顯示出有希望的結果。二甲雙胍，被證明可以增加免疫細胞配體的表達，尤其是ICAM－1的表達。ICAM－1是一種整合素，可以調節淋巴細胞細胞內信號，包括NK細胞。二甲雙胍與UCB聯合使用擴增NK細胞在體外和體內顯示出更高的腫瘤細胞清除率。

此外，另一種策略是直接調節NK細胞代謝。cMyc是調節小鼠NK細胞糖酵解和氧磷代謝機制的關鍵因數，缺乏cMyc會導致NK細胞反應受損。糖原合成酶激酶－3（GSK3）可介導小鼠NK細胞中cMyc的降解。與此一致，在AML患者的NK細胞中檢測到GSK3過度表達，並與針對AML細胞的細胞毒性受損有關，GSK3抑制劑可恢復這些NK細胞的活性。目前，一些臨床試驗正在評估GSK3抑制劑LY2090314對實體癌和血液癌的療效（NCT01632306、NCT01287520和NCT01214603）。

有待解決的問題

靶向CD16a可能有助於解決當前癌症免疫治療治療抗體的一些現有局限性，從而最大限度地提高ADCC促進更有利臨床結果的潛力。然而，依然有一些未解決的問題亟待回答：

靶向CD16a優於其他NK細胞啟動受體的優勢是什麼？

啟動NK細胞觸發ADCC的最有效方法是什麼？啟動NK細胞能在多大程度上觸發適應性免疫以增強總體抗腫瘤活性？

NK細胞接合器能促進NK細胞在腫瘤部位的歸巢和持續存在嗎？

腫瘤內CD16a＋NK細胞和巨噬細胞的表達水準如何？由於CD16a在NK細胞和巨噬細胞上都有表達，因此我們有必要瞭解當特異性靶向CD16a時，不同免疫細胞類型相對於不同腫瘤實體的貢獻。

CD16a脫落對ADCC活性及其臨床療效的影響是什麼？用不可脫落的CD16改造細胞產品有好處還是壞處？

一線治療後NK細胞受體或靶向腫瘤抗原的下調是否會影響NK細胞接合器療法的療效？

NK細胞啟動劑的臨床療效如何受到患者年齡、治療開始時的健康狀況和預處理方案等參數的影響？

小結

自然殺傷細胞是一組獨特的抗腫瘤效應細胞，具有不受MHC限制的細胞毒性、產生細胞因數和免疫記憶等功能，使其成為先天性和適應性免疫反應系統中的關鍵角色。通過CD16a的ADCC作用是NK細胞發揮效應器功能的主要機制之一。因此，對CD16a的生物學的深入瞭解有助於我們找到增強ADCC作用的策略，從而提高NK細胞的抗腫瘤活性。

參考文獻：

1．From CD16a Biology toAntibody－Dependent Cell－Mediated Cytotoxicity Improvement． Front Immunol．2022；13： 913215．

2． Reimaginingantibody－dependent cellular cytotoxicity in cancer： the potential of naturalkiller cell engagers． Trends Immunol．2022 Nov；43（11）：932－946

NK 細胞具有獨特的抗腫瘤效應，不受MHC限制的細胞毒性、產生細胞因數和免疫記憶等功能，使其成為先天性和適應性免疫反應系統中的關鍵角色。CAR-NK 細胞療法是一個很有前途的臨床研究領域，對某些癌症患者具有良好的安全性和初步療效。

自然殺傷細胞 （Natural killer cell，NK細胞 ) ，是除 T細胞、B細胞之外的第三大類淋巴細胞，不僅與抗腫瘤、抗病毒感染和免疫調節有關，甚至參與超敏反應和自身免疫性疾病的發生。NK細胞來源於骨髓造血幹細胞，屬於先天免疫系統的核心細胞，約占血液中所有免疫細胞數量的15%；主要分佈于 外周血、肝臟和脾臟 。在人體內NK細胞主要特徵為 CD3−CD56+ 淋巴細胞群。 國際頂級期刊 Nature Reviews Drug Discovery (IF=60.716) 雜誌上的一篇綜述，講述如何利用NK細胞開發腫瘤免疫細胞療法。

NK細胞生物學

NK細胞發現於20世紀70年代，主要與殺死感染的微生物和惡性轉化的同種異體和自體細胞有關。NK細胞來源於CD34+共淋巴祖細胞。據估計，NK細胞的半衰期大約為7~10天，占人類外周血淋巴細胞總數的10-15%，也存在於脾臟、肝臟、肺、骨髓和淋巴結中，它們通過與DC細胞的相互作用發揮關鍵的免疫調節功能。NK細胞是第一組固有淋巴樣細胞的典型成員， 具有分泌 IFN-γ 的能力 。 終末分化的 NK 細胞缺乏B淋巴細胞 （CD19+） 和 T 淋巴細胞 （CD3+） 的表型標記， CD56是NK細胞特徵的標誌 。人外周血NK細胞可分為CD56 bright 和CD56 dim 兩大類。

NK細胞屬於1型先天淋巴細胞，特徵之一是產生1型細胞因數 （如TNF和IFN-γ） 。NK細胞活性受其表面多種啟動性受體和抑制性受體 （KIR） 的調控。 啟動受體 包括：NCR、CD16、NKG2D、DNAM1和信號淋巴細胞啟動分子 （SLAM） 家族受體。 抑制性受體 包括：免疫球蛋白樣受體KIR、NKG2A和白細胞免疫球蛋白樣受體亞家族B成員。大多數正常細胞表達MHC-I，通過激發抑制信號來抑制NK細胞的活性。 而腫瘤細胞，則通過降低MHC-I的表達來試圖逃避CD8+CTL細胞的識別。如果MHC-I配體的丟失和/或啟動性受體的配體表達升高，則會改變NK細胞內的信號通路平衡，從而啟動NK細胞，攻擊與接觸的靶細胞。

圖1：KIR為人類NK細胞提供多樣性、耐受性和學習

如何增強NK細胞功能

▉ 刺激NK細胞的細胞因數

啟動性或抑制性細胞因數的拮抗劑，或許是一種策略。比如，IL-2可促進T細胞和NK細胞的啟動和增殖。在體外，IL-2可啟動NK細胞，然而在體內卻受到Treg的抑制。很多公司正在開發選擇性啟動T細胞和NK細胞的IL-2類似物。比如賽諾菲公司的SAR444245，Alkermes公司開發的nemvaleukin alfa（ALKS 4230），Anaveon公司開發的IL-2R激動劑ANV419等等。

IL-15有望替代IL-2，可刺激NK細胞和CD8+T細胞，但不會啟動Treg細胞。目前，多款IL-15重組蛋白正在臨床試驗中接受測試。其中，ImmunityBio公司的IL-15超級激動劑Anktiva（N-803）已經在治療膀胱癌、惰性非霍奇金淋巴瘤等疾病的臨床試驗中獲得積極結果。

▉ 激發ADCC反應的抗體

NK細胞可通過CD16受體介導的ADCC，殺死IgG1或IgG3抗體靶向的細胞。NK細胞表面CD16的不同形態，會影響CD16與抗體Fc端的親和力。

具體來說，CD16蛋白第158位的氨基酸為苯丙氨酸（158F）時，與Fc的親和力低，而這一位置上的氨基酸為纈氨酸（158V）時，與Fc的親和力高。新一代單克隆抗體療法很多對Fc端進行了修飾，改善了它們與CD16的結合，促進了ADCC的產生。同時，很多抗體在合成時使用了預防抗體Fc端岩藻糖基化的哺乳動物培養系統，增強了它們與CD16的結合。

▉  雙特異性抗體

雙特異性抗體，可同時與啟動NK細胞的受體和腫瘤抗原相結合，促進更有效和持久的NK介導細胞毒性。 與單抗不同，這些融合蛋白可以被設計成與多種不同的腫瘤抗原和NK受體相結合，並且可以利用抗體可變區片段 （Fv） 與CD16結合，保證它們可以與158V C16和158F C16有效結合。類似的蛋白設計已經在雙特異性T細胞銜接器 （BiTE） 中得到應用。目前，Affimed公司開發的AFM13是臨床進展最快的CD16雙特異性抗體之一。這是一款靶向CD30的雙特異性抗體。在治療霍奇金和非霍奇金淋巴瘤患者的1期臨床試驗中，它與臍帶血來源的NK細胞聯用，在治療的12名患者中，達到100%的客觀緩解率。

▉ 三特異性抗體

三特異性NK細胞銜接器不但可與腫瘤抗原和CD16受體結合，還可包含IL-15，從而與IL-15受體 （位於NK細胞表面） 相結合，增強NK細胞的活性 。三特異性抗體，由於具有同時與不同NK細胞受體結合的潛力，因此正在成為NK細胞免疫療法的一個令人興奮的前沿。不過，哪些啟動性受體組合能夠最大程度增強NK細胞的抗癌活性仍然需要更多研究。

過繼性NK細胞療法

NK細胞成為了研究人員開發新型免疫療法的理想選擇之一。目前，正在開發的NK細胞治療產品主要有兩類：一類是自體或是異體NK細胞治療產品，另一類是CAR-NK產品。

NK細胞的種子細胞來源廣泛，包括外周血、臍帶血、多能幹細胞（ESC和 iPSC）和NK細胞系（如NK92細胞系等） 。iPSC的製備需要種子細胞少，可大量培養，成本較低，可實現自體供給，免疫原性較低。NK92細胞系可無限增殖，對凍融敏感性較低。

在增強NK細胞功能方面， 在體外培養過程中使用細胞因數進行刺激 ，常用的細胞因數是IL-2。近年來，IL-12，IL-15， IL-18，IL-21等刺激因數也被用於體外刺激NK細胞，並且能夠誘導成長期生存，具有記憶能力的NK細胞。

Affimed公司開發的靶向CD16/CD30雙特異性抗體AFM13也可以用於在體外預先與NK細胞結合，促進NK細胞對CD30+淋巴瘤的反應。

CAR-NK可賦予NK細胞靶向特定腫瘤的能力 。CAR-NK細胞與CAR-T細胞相比可以提供多種優勢，包括細胞因數釋放綜合征風險 （CRS） 更小，神經毒性更小。即使CAR-NK細胞失去了CAR，仍然可通過內在表達的啟動性受體識別和殺傷腫瘤細胞。除了CAR-NK，研發人員正在探索增強NK細胞功能的其他基因工程策略，包括通過 表達趨化因數受體 ，促進腫瘤浸潤。基於ADCC的療法可以在NK細胞上表達高親和力的138V CD16受體，與激發ADCC的抗體聯用構成組合療法。

最後， 使用CRISPR-Cas9基因編輯系統 可以 從NK細胞中敲除副調控因數。這些手段為構建更好的NK細胞療法提供了多種可能性。

小結

NK 細胞具有獨特的抗腫瘤效應，不受MHC限制的細胞毒性、產生細胞因數和免疫記憶等功能，使其成為先天性和適應性免疫反應系統中的關鍵角色。免疫細胞如何發揮作用仍有許多問題尚未解決。而對於實體瘤而言，目前也還並不清楚 NK 細胞是否會比T 細胞更容易地進入實體瘤。NK 細胞可以產生相關細胞因數來吸吸引其他免疫細胞，這可能會進一步增強抗腫瘤反應。CAR-NK 細胞療法是一個很有前途的臨床研究領域，對某些癌症患者具有良好的安全性和初步療效。相信，CAR-NK細胞療法可能會導致腫瘤免疫治療的革命性進展。

參考資料：

[1].Niklas K. Björkström et al. Emerging insights into natural killer cells in human peripheral tissues. Nature Reviews Immunology (2016).

[2] Maskalenko et al., Harnessing natural killer cells for cancer immunotherapy: dispatching the first responders. Nature Reviews Drug Discovery,  (2022).

[3] Le Saux and Schvartzman Advanced Materials and Devices for the Regulation and Study of NK Cells. Int. J. Mol. Sci.,  (2019).

[4] Zhang et al.,. CAR-NK cells for cancer immunotherapy: from bench to bedside. Biomarker Research,(2022)

[5]藥明康得：https://mp.weixin.qq.com/s/D-1sqaXMZMH6InR_ckxN0Q