本方案提供一個從病毒載體設計到早期臨床試驗的完整閉環。

患者→（清淋or not）→靜脈注射靶向性LV載體→體內生成CAR-T細胞→治療評估

圖1：體內與體外CAR-T製造流程對比示意圖

研發全流程方案大綱：

一、 技術路線選擇與整體策略

二、 病毒載體工程化：靶向、高效、安全

三、 CAR結構設計與優化（針對實體瘤挑戰）

四、 產品表徵與功能驗證方案

五、 非人靈長類（NHP）研究及GLP毒理方案

六、 IIT（研究者發起的臨床試驗）方案框架

七、 POC驗證中的常見問題與解決方案

基於病毒載體的體內CAR-T療法研發全流程方案 (POC至IIT階段)

一、 技術路線選擇與整體策略

核心決策：

病毒載體平臺選擇，慢病毒載體（Lentiviral Vector, LV）是目前體內CAR-T工程化最成熟、臨床進展最快的平臺，其優勢在於：

• 高轉導效率：對分裂和非分裂細胞（如靜息T細胞）均有效，適合體內直接轉導。
• 穩定整合與長效表達：可實現CAR的長期、穩定表達。
• 成熟的改造與偽型技術：可通過改造包膜蛋白（Pseudotyping）實現細胞靶向。
• 臨床經驗豐富：已有多個產品進入臨床試驗（如INT2104, ESO-T01等）。

實操：以自失活（SIN）第三代慢病毒載體作為核心技術平臺，並重點開發靶向性改造的慢病毒（Targeted LV），以解決體內應用的脫靶和安全問題。

二、 病毒載體改造、生產與質控

1. 病毒載體改造：降低免疫原性與提高靶向性目標：消除對非靶細胞（如肝細胞）的天然嗜性，並重靶向T細胞。

• 包膜蛋白的選擇與改造（Pseudotyping & Detargeting/Retargeting）：

去靶向（Detargeting）：使用突變型VSV-G（VSV-G mutant）

VSV-G突變技術平臺小結

除了改造VSV-G，還有其他包膜工程策略：

副粘病毒來源包膜：如Nipah病毒G蛋白、Measles病毒H蛋白、Cocal病毒包膜蛋白，其蛋白（G）和融合蛋白（F）是分離的，可以單獨對G蛋白進行去靶向和重靶向改造，而F蛋白負責膜融合，以降低其通過普遍存在的LDLR對非靶細胞的廣泛感染，工程化更靈活。

Cocal糖蛋白：與VSV-G有71.5%的同源性，也結合LDLR，但一些公司（如Umoja Biopharma）正將其用於其體內CAR-T平臺（如UB-VV111）。再靶向（Retargeting）：在去靶向的包膜蛋白上融合T細胞特異性結合域。這是實現體內靶向遞送的關鍵。

• 常用靶向分子：
• 單鏈抗體（scFv）：如抗CD3 scFv (OKT3, TR66)、抗CD8 scFv (Okt8opt)、抗CD4 scFv。
• DARPin（設計錨蛋白重複蛋白）：如抗CD8 DARPin (MSE10)、抗CD4 DARPin 。其體積小、穩定性好。
• 雙特異性抗體（tandem Fab）：如抗SINV E2 × CD3 tandem Fab。
• 連接模式：可採用串聯（Tandem）或獨立表達（Independently expression）模式將靶向分子展示在病毒顆粒表面。
• 載體骨架優化：

o自失活（SIN）設計：刪除3‘LTR的啟動子區（如U3區），防止病毒啟動子啟動下游原癌基因，是必須的安全特性。

o使用強效且相對特異的啟動子：如EF1α、PGK，或使用T細胞特異性啟動子（如CD3 promoter）以進一步限制CAR在非T細胞中的表達。

o考慮非整合型慢病毒（NILV）：對於需要暫態表達或擔心插入突變的應用，可探索使用整合酶缺陷型慢病毒，但其表達持續時間較短。

2. 病毒載體生產工藝優化

目標：建立穩定、高滴度、符合GMP導向的病毒生產體系。

• 生產系統選擇：
  • 暫態轉染系統：使用HEK 293T/17細胞，通過多質粒（通常為3質粒或4質粒系統：包裝質粒、包膜質粒、轉移質粒（含CAR基因））共轉染。這是最靈活、最常用的臨床前和早期臨床方法。
  • 穩定生產細胞系：如建立基於PG13（用於γ-逆轉錄病毒）或誘導型包裝細胞系。這有利於大規模、批次間一致的生產，但構建複雜。
  • 推薦路徑：POC階段採用暫態轉染（HEK 293T），便於快速反覆運算載體設計；進入臨床申報時，需建立主細胞庫（MCB）和工作細胞庫（WCB），並考慮向穩定生產細胞系或更可控的放大工藝，如生物反應器過渡。
• 提高病毒滴度的關鍵工藝參數：

• 1. 質粒比例與轉染試劑：優化包裝質粒、包膜質粒、轉移質粒的比例（如：30μg:10μg:10μg:10μg）。比較PEI、磷酸鈣、脂質體等轉染試劑的效率。
  2. 細胞狀態與密度：轉染時細胞應處於對數生長期，融合度約60-80%。
  3. 收穫時間：通常在轉染後48-72小時多次收穫上清，以獲取最高總產量。
  4. 濃縮與純化：臨床級產品必須進行純化。採用超速離心或切向流過濾（TFF）結合層析（如離子交換、分子排阻） 進行濃縮和去雜質。注意控制流速和壓力，避免損傷病毒顆粒。
  5. 無/低血清工藝：為降低牛源性雜質風險，應開發無血清或化學成分限定（chemical defined）的培養基。

3. 病毒載體品質控制（QC）與放行

目標：建立全面的品質控制策略

關鍵放行檢測項目：

三、 CAR結構設計與優化（針對實體瘤）

目標：克服腫瘤微環境抑制、抗原異質性和靶向/脫靶毒性等挑戰。

靶點選擇與驗證：選擇在腫瘤細胞上高表達、在關鍵正常組織上低或不表達的抗原。進行嚴格的組織交叉反應（Tissue Cross-Reactivity, TCR） 分析。

scFv優化：篩選高親和力、高特異性的scFv。注意親和力與抗腫瘤活性、脫靶風險的平衡（“親和力窗口”）。鉸鏈/跨膜區優化：

1. • 鉸鏈區：長度和靈活性影響CAR的空間可及性和信號傳導。常用CD8α或IgG衍生的鉸鏈。
   • 跨膜區：常用CD8α或CD28的跨膜區，主要影響CAR的穩定性和與內源性信號分子的相互作用。
   • 共刺激信號域組合：第二代CAR（1個共刺激域）是基礎。
   • CD28域：提供強效的早期啟動信號，但可能導致T細胞耗竭。
   • 4-1BB域：提供持久的存活信號，增強體內持久性，但初始啟動可能較弱。
   • 實體瘤推薦：可考慮4-1BB以增強持久性，或開發雙共刺激域（如CD28-4-1BB） 的第三代CAR，但需注意信號強度調節。
   • 也可其他共刺激分子，從頭篩選與改造

應對實體瘤微環境的策略（“裝甲化”CAR）：

1. • 分泌細胞因數：設計CAR-T細胞共表達IL-12、IL-15、IL-7等，以抵抗微環境抑制、促進增殖。
   • 表達趨化因數受體：如CXCR2、CCR4等，幫助CAR-T細胞浸潤至腫瘤部位。
   • 敲除抑制性受體：在載體中整合CRISPR元件，或使用雙載體策略，同時敲除PD-1、TIGIT等抑制性受體。

邏輯門控（Logic-gated）CAR：AND,OR,NOR等邏輯門控；如通過“及閘”（AND-gate）設計，要求兩個腫瘤相關抗原同時存在才啟動，極大提高安全性。

邏輯門控策略

• 可調控開關：整合藥物（如雷帕黴素）或小分子誘導的基因開關，實現CAR活性的可控開啟/關閉。

針對on target, off-tumor的策略：

四、 體內外功能驗證方案

1. 體外驗證

• CAR表達驗證：用靶向性LV轉導原代人T細胞（或PBMC），通過流式細胞術檢測CAR陽性率、平均螢光強度（MFI）和表型（CD4/CD8比例，記憶亞群）。
• 抗原特異性啟動：與表達靶抗原的腫瘤細胞共培養，檢測：
  • 細胞因數釋放：ELISA檢測IFN-γ,IL-2, TNF-α。
  • 脫顆粒：流式檢測CD107a等。
  • 增殖能力：CFSE或Cell Trace Violet染色。
• 體外殺傷實驗：
  • 即時細胞分析（RTCA）：即時監測腫瘤細胞裂解（Incucyte等）。
  • 標準鉻釋放實驗（目前基本淘汰）：在不同效靶比（E:T）下，評估特異性殺傷效率和動力學。
• 耗竭模型：與腫瘤細胞長期反復共培養，評估CAR-T細胞的持久性和功能耗竭情況。

2. 體內驗證（小鼠模型）

• 模型建立：
  • 血液瘤模型：NSG或NOG小鼠，尾靜脈注射人源化腫瘤細胞系（如Raji, Nalm6）建立白血病/淋巴瘤模型。
  • 實體瘤模型：NSG小鼠，皮下或原位接種表達人靶抗原的腫瘤細胞系。
  • 人源化小鼠模型：向NSG小鼠移植人CD34+造血幹細胞或PBMC，建立更接近人體免疫環境的模型，用於評估體內CAR-T生成、擴增和抗腫瘤活性。
• 給藥與評估：
  • 給藥：尾靜脈注射靶向性LV載體（劑量參考，如2×10^6 – 4×10^10 TU/只）。
  • 監測：
    • 腫瘤生長：卡尺測量（實體瘤）或活體成像。
    • 體內CAR-T生成：定期采血，流式檢測人CD3+CAR+細胞的比例和絕對數量。
    • 細胞因數風暴（CRS）模擬：監測血清中人源細胞因數（如IL-6, IFN-γ）水準。
    • 生物分佈：實驗終點取各器官（脾、肝、肺、骨髓、腫瘤），分析CAR-T細胞的浸潤和脫靶情況。
    • 長期安全性：觀察小鼠體重、活動狀態，實驗終點進行全面的組織病理學檢查。

五、 非人靈長類（NHP）實驗與GLP毒理方案

1. NHP藥效/藥代動力學（PK/PD）研究

• 目的：在更接近人類的生理和免疫系統中，驗證載體的靶向性、CAR-T生成效率、持久性、抗腫瘤活性（若建立NHP腫瘤模型）和初步安全性。
• 動物：食蟹猴或恒河猴。
• 方案：
  1. 劑量探索：設置低、中、高三個劑量組（基於小鼠資料換算），每組n≥3。
  2. 給藥：單次或多次靜脈輸注靶向性LV。
  3. 監測：
     • PK：定期采血，用qPCR定量載體基因組（VCN）在血液和各組織中的分佈與清除動力學。
     • PD：流式監測CAR-T細胞（CD3+CAR+）在血液中的生成、擴增峰、表型變化和持久性（至少3-6個月）。
     • 免疫原性：檢測抗載體中和抗體（NAb）的產生及其對再次給藥的潛在影響。
     • 靶向/脫靶分析：分析CAR-T細胞在淋巴組織（淋巴結、脾臟）、骨髓及可能脫靶器官（如肝臟）中的分佈。
     • 安全性：全程監測臨床體征、體重、體溫、血液學、臨床生化、凝血功能、細胞因數（CRS相關）。

2. GLP毒理學研究

• 目的：為首次人體試驗（IIT）提供正式的安全性支援資料。
• 核心原則：遵循ICH指導原則，在GLP認證的機構進行。
• 設計：
  • 動物種屬：選擇與人體生物學反應最相關的種屬，通常為食蟹猴。
  • 劑量設計：設置一個無毒性反應劑量（NOAEL）、一個預計臨床等效劑量和一個明顯毒性劑量。
  • 給藥途徑與週期：與臨床計畫一致（靜脈輸注）。通常包括單次給藥毒性研究和/或重複給藥毒性研究（如每週一次，連續4周）。
  • 對照組：載體緩衝液對照組。
  • 終點與分析：
    • 全面毒代動力學（TK）。
    • 全面的臨床病理學（血液學、血清生化、凝血、尿檢）。
    • 免疫毒性評估：淋巴細胞亞群分析、免疫球蛋白水準、抗藥抗體（ADA）檢測。
    • 組織病理學：對全部主要器官和組織進行詳細的宏觀和微觀檢查，特別關注淋巴組織、生殖腺（評估生殖細胞轉導風險）、肝臟和可能脫靶的器官。
    • 生殖毒性：通常I期臨床不要求，但需評估載體在生殖腺的分佈。
    • 致瘤性：長期研究（如6-12個月）觀察有無克隆性增殖或腫瘤發生跡象。

六、 IIT（研究者發起的臨床試驗）方案框架

1. 試驗題目：評估XXXX，一種靶向YY的體內CAR-T細胞療法，在復發/難治性ZZZ患者中的安全性、耐受性、藥代動力學和初步療效的I期臨床研究。
2. 研究設計：開放標籤、單臂、劑量遞增研究（如3+3設計）。
3. 患者人群：標準治療失敗、經病理確診的ZZZ成年患者。
4. 給藥方案：

預處理：根據載體特性，決定是否需要進行淋巴清除化療（如氟達拉濱/環磷醯胺）。體內CAR-T的優勢之一是可能無需強淋巴清除。

研究藥物：單次靜脈輸注XXXX（靶向性LV載體）。

劑量組：設置3-4個劑量遞增組別。

5. 終點：

主要終點：安全性（不良事件AE、嚴重不良事件SAE發生率，特別關注CRS、ICANS、HLH、載體相關毒性）。

 

次要終點：

 

PK：血液中載體基因組拷貝數動態變化。

 

PD：外周血中CAR-T細胞比例、數量、表型及持久性。
免疫原性：抗載體中和抗體（NAb）產生。
初步療效：客觀緩解率（ORR）、緩解持續時間（DOR）、無進展生存期（PFS）。

 

6. 關鍵監測：

CRS/ICANS管理：制定詳細的托珠單抗和糖皮質激素使用預案。

 

長期隨訪：根據FDA指南，對使用整合型載體的患者進行長期隨訪（至少15年），監測遲發性不良反應，特別是繼發性腫瘤。

七、 POC驗證中的常見問題與Troubleshooting

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

一、傷口癒合的“攔路虎”

正常傷口癒合分4個階段：

止血期：血管收縮，血小板形成血凝塊封堵傷口；

炎症期：免疫細胞清除病原體與壞死組織，啟動修復；

增殖期：各類細胞活化，促進血管生成與上皮再生；

重塑期：膠原纖維重排，形成成熟疤痕。

流程“卡殼”會導致兩類問題：一是慢性傷口，即3個月未愈的潰瘍，如糖尿病潰瘍（高血糖引發氧化應激）、壓力性潰瘍（骨突受壓致壞死），核心特徵是“炎症不消、再生無力”；二是病理性疤痕，由成纖維細胞異常增殖導致，與免疫失調、機械張力、缺氧相關。

遺憾的是，現有治療存在瓶頸：細胞治療有免疫排斥與倫理爭議；天然藥物靶向性差、易降解。而外泌體的出現，恰好填補了空白。

二、外泌體：從“細胞信使”到治療“潛力股”

外泌體是細胞分泌的30-150nm脂質囊泡，包裹蛋白質、mRNA等活性物質，相當於細胞間的“納米快遞”。與其他療法相比，天然外泌體有三大優勢：

安全性高：無免疫原性、致瘤性，規避幹細胞治療風險；

穩定性強：脂質膜保護內容物不被降解，更耐儲存；

靶向性初顯：表面蛋白可初步識別靶組織。

其作用機制有三種：“表面對接”啟動信號、“內部投遞”釋放內容物、“直接融合”傳遞物質。但天然外泌體存在靶向性差、有效成分少、產量低等問題。為此，科學家開發了工程化外泌體（eExo），通過改造實現按需定制，增強靶向性與“4種促進”、“5種抵抗”效應。

“4種促進”效應是工程化外泌體促進傷口再生的核心能力，包含：

促血管生成：通過攜帶VEGF（血管內皮生長因數）相關miRNA（如miR-31-5p），啟動內皮細胞增殖與遷移，在慢性傷口缺氧區域形成新血管，為修復提供氧氣與營養；促細胞增殖：調控成纖維細胞、角質形成細胞活性，加速肉芽組織生長與上皮細胞覆蓋，縮短傷口閉合時間，尤其對糖尿病患者因高糖抑制的細胞增殖有顯著恢復作用；促ECM（細胞外基質）沉積：引導成纖維細胞合成膠原蛋白、彈性蛋白等ECM成分，並減少異常沉積，避免疤痕過度形成；促神經再生：攜帶神經營養因數相關信號分子，修復傷口區域受損神經末梢，緩解慢性傷口伴隨的疼痛、麻木，同時改善皮膚感知功能。

“5種抵抗”效應則為傷口癒合掃清障礙，包含：

抗炎：抑制NF-κB等炎症通路，減少TNF-α、IL-6等促炎因數釋放，將慢性傷口的“持續炎症”轉為“可控炎症”，為修復階段鋪路；抗纖維化：下調TGF-β1等促纖維化因數，抑制成纖維細胞過度活化，防止膠原蛋白無序堆積，減少增生性疤痕形成；抗凋亡：通過啟動PI3K/AKT通路，保護傷口區域的上皮細胞、內皮細胞免受氧化應激損傷，降低細胞凋亡率，維持修復細胞數量；抗衰：清除傷口局部衰老細胞（如衰老成纖維細胞），減少衰老相關分泌表型（SASP）對修復的干擾，恢復細胞修復活力；抗氧化：攜帶SOD（超氧化物歧化酶）、谷胱甘肽等抗氧化物質，中和慢性傷口中過量的活性氧（ROS），打破“氧化應激-細胞損傷”的惡性循環。

三、從實驗室到臨床的進展與挑戰

臨床前研究：動物模型顯效

96.6%研究集中在齧齒類動物。糖尿病小鼠模型中，iPSC來源外泌體減少炎症、縮小傷口；兔耳疤痕模型中，載miR-141-3p外泌體減少疤痕厚度[1]。但小鼠皮膚與人類差異大，需大動物模型進一步驗證。

臨床研究：初現安全與有效

截至2025年，多項臨床研究啟動。韓國一項前瞻性、雙盲、隨機、半臉對照研究中，“脂肪幹細胞外泌體+鐳射”改善痤瘡疤痕，紅腫輕恢復快；美國IIa期研究（NCT06319287）評估外泌體產品治糖尿病足潰瘍效果；中國也有多項研究開展，例如半臉對照研究（NCT06279039）評估含外泌體的液體敷料對鐳射治療後患者康復的影響，人脂肪組織來源外泌體促進傷口癒合的初步研究（NCT05475418）。但需大規模研究驗證長期療效。

研究編號/PMID	疾病/症狀	治療	研究階段	研究指標
NCT04134676	慢性潰瘍	條件培養基	Phase 1	2周時潰瘍大小、肉芽組織、水腫和紅斑
ACTRN12620000944932	傷口	血小板衍生EV	Phase 1	不良事件和傷口癒合時間
NCT02565264	潰瘍	血漿來源的外泌體	Phase 1	28天時潰瘍大小和疼痛
33073298	痤瘡疤痕	ASC衍生外泌體	Phase 1	3周時瘢痕改善和副作用的評價
NCT04326959	疤痕	UCSC-CM	Phase 1 & 2	3個月時瘢痕疙瘩的免疫組織化學、組織病理學和影像學
NCT06319287	糖尿病足潰瘍	PEP/TISSEEL	Phase 2	12周時傷口面積減少百分比
NCT05887804	疤痕	UCSC-CM	Phase 4	15周時瘢痕疙瘩體積減少，17周時POSAS評分降低
NCT06253975	傷口癒合	AT-EV	n/a	10周時傷口癒合率
NCT05475418	創傷和損傷	AT-exo	n/a	4周時傷口癒合率

ASC，脂肪源性幹細胞；EV，細胞外囊泡；AT-exo，脂肪組織來源的外泌體；UCS-CM，臍帶間充質幹細胞衍生條件培養基；PEP，純化的外泌體產物；POSAS，患者和觀察者瘢痕評估量表

核心挑戰：規模化、安全與監管

規模化生產難：實驗室產量低，臨床需標準化流程保證批次品質；

免疫原性風險：異體外泌體或引發反應，自體外泌體成本高、週期長；

監管缺失：全球無統一指南，延緩轉化。

結語：未來展望

工程化外泌體兼具生物相容性與精准治療能力，未來研究將聚焦三方面：優化改造技術，提升cargo載入效率；改進遞送系統，延長體內滯留時間；明確作用機制，找到關鍵療效分子。從“納米碎片”到“治療工具”，外泌體發展僅數十年。隨著技術與監管完善，未來它或將走進臨床，讓慢性傷口不再“難愈”，疤痕不再“難纏”。

參考資料

1.Kwon, Hyuck Hoon, et al. “Combination treatment with human adipose tissue stem cell-derived exosomes and fractional CO2 laser for acne scars: a 12-week prospective, double-blind, randomized, split-face study.” Acta dermato-venereologica 100.18 (2020): 5913.

2.Liu, Chuanqi, et al. “Precision exosome engineering for enhanced wound healing and scar revision.” Journal of Translational Medicine 23.1 (2025): 578.

3.Dandoulakis, MD, E. . “Exosomes As A Revolutionary Tool In Wound Healing And Skin Regeneration: Current Evidence And Therapeutic Potential”. Journal of Neonatal Surgery, vol. 14, no. 32S, July 2025, pp. 5817-29

最大規模單細胞擾動測序資料集，AI支持虛擬細胞研究

2024 年 4 月，一家名為 Xaira Therapeutics 的人工智慧（AI）藥物研發公司成立，並同時宣佈獲得了令人瞠目結舌的 10 億美元種子輪融資。該公司致力於通過新興 AI 技術的端到端應用，幫助重新設計藥物的發現和開發之旅。
該公司擁有一個星光熠熠的創始和領導團隊，包括 AI 蛋白質設計先驅、2024 年諾貝爾化學獎得主 David Baker 教授，以及 2022 年諾貝爾化學獎得主 Carolyn Bertozzi 教授、美國 FDA 前局長 Scott Gottlieb、強生公司前 CEO Alex Gorsky，以及斯坦福大學前校長 Marc Tessier-Lavigne 等。因此，整個 AI 藥物研發領域都在熱切期待著該公司取得令人矚目的科學成果。
現在，這家 AI 獨角獸企業不負眾望，在其成立的第一年就為虛擬細胞（Virtual Cell）研究領域送上了一份厚禮——發佈了目前最大的公開可用的 Perturb-seq 資料集，名為 X-Atlas/Orion，為虛擬細胞研究提供支援，該資料集可用於 AI 模型訓練，並能檢測劑量依賴性遺傳效應，從而增強藥物發現的預測能力。
該資料集於 2025 年 6 月 16 日發表在預印本平臺 bioRxiv，論文題為：X-Atlas/Orion: Genome-wide Perturb-seq Datasets via a Scalable Fix-Cryopreserve Platform for Training Dose-Dependent Biological Foundation Models。

根據論文中的介紹，X-Atlas/Orion 包含了 8000000 個細胞，涵蓋了人類所有編碼蛋白質的基因，單細胞的深度測序超過 16000 個獨特分子識別字（UMI）。

Perturb-seq 是基於單細胞轉錄組測序（scRNA-seq）、以彙集的形式同時讀出單細胞的 CRISPR sgRNA 遺傳擾動和轉錄組的方法。過去，研究人員一直將 Perturb-seq 基因敲低視為一種“開”或“關”的開關，而 X-Atlas/Orion 通過檢測劑量依賴性遺傳效應取得了進步，從而揭示了基因活性如何隨著特定干預措施的強度而變化，例如，可應用於確定對藥物靶點的抑制百分比達到多少時會產生預期治療效果。

大規模平行測序技術的迅猛發展催生了基礎模型開發生態，這類模型可通過解析海量生物資料揭示全新生物學發現。然而，儘管 AI 驅動的虛擬細胞模型具備加速科學發現的革命性潛力，其發展始終受限於高品質擾動資料的規模性短缺——這一困境源于資料生成過程的可擴展性瓶頸與實驗方法變異性的雙重制約。

該研究推出了創新性的“固定–凍存–單細胞測序”（Fix-Cryopreserve-scRNAseq, FiCS）Perturb-seq 平臺，該工業化解決方案實現了擾動測序數據的規模生產。

實驗驗證表明，FiCS 平臺展現出卓越的檢測靈敏度與微弱的批次效應，能精准捕捉基因擾動引發的轉錄組變化，準確重現經典生物學通路與蛋白複合體特徵。作為技術示範，Xaira Therapeutics 正式發佈當前全球最大規模的公共擾動資料庫——X-Atlas/Orion。該資料集源自兩項針對人類全部蛋白質編碼基因的全基因組 FiCS Perturb-seq 實驗，包含 8000000 個深度測序細胞，單細胞獨特分子識別字（UMI）超 16000 個，為領域研究樹立新標杆。

該研究還揭示，sgRNA 豐度可作為基因敲低效能的有效表徵。通過深度測序與每次擾動條件下充足細胞量的技術優勢，證實基於 sgRNA 表達的劑量分層可解析遺傳效應的濃度依賴性特徵。

工業化 Perturb-seq 平臺工作流

綜合來看，FiCS Perturb-seq 成功打造了高效、可擴展的高通量擾動測序平臺。通過 X-Atlas/Orion 資料集的發佈，不僅為解決資料生成中的規模化和標準化難題提供關鍵方案，更將推動融合基因劑量效應的新一代基礎模型開發，為加速生命科學發現注入強勁動力。

為促進虛擬細胞研究領域的開放協作，X-Atlas/Orion 資料集將以非商業使用許可向生物技術界開放共用。對於有意開展商業合作的公司，Xaira Therapeutics 表示願意就資料授權與應用開發等合作模式進行商談。

對於傳統的早期藥物研發，通常僅限於從文獻中挑選少數幾個基因進行嘗試，但高性能的虛擬細胞（Virtual Cell）模型卻有可能在研發流程中不良生物學效應出現之前就將其排除。

許多虛擬細胞模型是基於觀察資料訓練的，例如 CZ CELLxGENE，其單細胞資料主要來自健康的人類捐贈者，雖然觀察資料對於某些生物學研究任務（例如細胞類型注釋）非常有用，但在預測細胞對擾動（例如藥物治療）的回應方面卻存在不足。

在 Perturb-seq 中，由於單細胞資料集的隨機性和稀疏性，測量基因敲低效率一直頗具挑戰性。為解決這一難題，Xaira Therapeutics 的研究人員證明，sgRNA 的豐度在每個細胞中能被檢測到並表達數百個拷貝，這在單細胞檢測中極為罕見，並且為基因被抑制的程度提供了一個可靠的替代指標。

除了 Xaira Therapeutics，還有多個機構致力於構建虛擬細胞，例如，陳-紮克伯格倡議（CZI）在今年 4 月份發佈了 Transcript Former，這是一種生成式 AI 模型，能夠跨物種探究細胞生物學，並具有治療應用。與此同時，Arc 研究所宣佈與 10x Genomics 和 Ultima Genomics 建立合作夥伴關係，共同構建 Arc 虛擬細胞圖譜。

像 X-Atlas/Orion 這樣大規模全基因組實驗可能極其耗時。僅對細胞進行分類以富集高品質細胞就可能需要超過 10 個小時。通過發佈 X-Atlas/Orion 的方法，Xaira Therapeutics 旨在讓更多的實驗室能夠以大規模、高品質和標準化的規模生成 Perturb-seq 資料，讓各個實驗室有能力利用大規模資料來檢驗特定假設。

今日分享一則胎盤間充質幹細胞治療膝骨關節炎相關的臨床文獻。這項臨床試驗的原材料是冷凍保存的人胎盤間充質幹細胞，共納入26名II-III期膝骨關節炎患者。結果顯示，三次關節內注射低溫保存的胎盤間充質幹細胞聯合透明質酸治療膝骨關節炎是安全有效的，患者關節疼痛、僵硬及功能障礙得到顯著改善，並在1年隨訪中提供持續的臨床改善。

在醫學領域，膝骨關節炎（Knee Osteoarthritis, KOA）作為一種常見的退行性關節疾病，長期困擾著數以億計的患者。

隨著人口老齡化的加劇和肥胖率的上升，KOA的發病率逐年攀升，傳統治療方法如藥物治療、物理治療及手術治療雖能在一定程度上緩解症狀，但往往難以根治，且存在副作用大、療效有限等問題。

近年來，幹細胞療法作為一種新興的治療手段，為KOA患者帶來了新的希望。

最近，發表在“ BMC Musculoskeletal Disorders”上的一篇名為“Effectiveness and safety of multiple injections of human placenta-derived MSCs for knee osteoarthritis: a nonrandomized phase I trial”的臨床試驗表明，三次關節內注射低溫保存的胎盤間充質幹細胞聯合透明質酸治療膝骨關節炎是安全有效的，並在1年隨訪中提供持續的臨床改善 [1]。

26名患者臨床實踐：

冷凍保存的胎盤間充質幹細胞，顯著改善膝骨關節炎

這項臨床試驗的原材料是冷凍保存的人胎盤間充質幹細胞（hP-MSCs）。

該研究採用非隨機化、開放標籤設計，共納入26名II-III期KOA患者，分為對照組（僅接受透明質酸治療）和MSC組（接受透明質酸聯合hP-MSCs治療）。

經過三次關節腔內注射（每次間隔4周），並對患者進行為期1年的隨訪觀察。

研究結果顯示：

1.安全性良好：首先是安全性問題，在治療過程中實驗組並未觀察到嚴重不良反應，僅部分患者出現輕度疼痛、腫脹等短暫不適，且均在數日內自行緩解。

2.療效顯著：其次是治療效果，與對照組相比，MSC組患者在6個月和1年時的WOMAC評分和VAS評分顯著降低，表明關節疼痛、僵硬及功能障礙得到顯著改善。

（圖片來自參考文獻1）

3.    機制探索：再者是相關的機制學探索，如下圖所示，血清學分析顯示，MSC組患者血清中IL-2水準顯著降低，提示胎盤間充質幹細胞具有顯著的抗炎作用。

（圖片來自參考文獻1）

然而，MRI分析未發現兩組患者在軟骨厚度和光學密度指數上的顯著差異，這可能與治療時間較短或樣本量較小有關。

多項臨床證實：幹細胞治療骨關節炎具有多重益處

無獨有偶，此前，發表在“Journal of Experimental Orthopaedics”上的一篇名為“Stem cells for the treatment of early to moderate osteoarthritis of the knee: a systematic review”的綜述就也總結了近些年來幹細胞療法在OA上的臨床益處。

（圖片來源於參考文獻3）

1. 疼痛緩解方面

大多數研究中研究者們都使用VAS評分進行疼痛緩解的評估，另外有六項臨床研究使用了骨關節炎指數(WOMAC)進行疼痛緩解的評分。

（圖片來源於參考文獻3）

由以上的結果我們不難看出，經過3個月~5年時間不等的隨訪，經由幹細胞注射後患者的疼痛評分大部分都有著顯著下降，改善幅度在0.9至5.2分之間，這意味著患者的疼痛得到了顯著的緩解。

2.功能改善方面

在評判臨床治療OA療效方面，除了對於疼痛的緩解之外，機體功能的改善也是很重要的一點，膝關節功能的改善是衡量治療效果的重要指標。

研究者匯總了近6年來的研究資料，主要結果如下圖所示，研究者主要採用了膝關節損傷和骨關節炎結局評分（K.O.O.S.）、膝關節臨床功能評分（K.S.S.）、EQ-5D-5L問卷和影像學分析等資料來對膝關節功能改善做出較為客觀的分析。

（圖片來源於參考文獻3）

結果顯示，經過幹細胞治療後，患者的膝關節功能評分顯著提升，膝關節的內翻機械軸從1.5°提高到1.8°，骨髓病變大小從123.5 mm^2減小到90.3 mm^2，而用於檢查軟骨修復的MOCART評分也從46.5提高到57.1，以上證據都表明幹細胞療法治療後患者膝關節的靈活性和活動能力都得到了不同程度的改善。

3.安全性良好

研究者匯總了12篇文獻，共統計了539名OA患者，其中有4例患者注射完幹細胞之後出現注射部位周圍疼痛，抽吸部位輕微出血的症狀，僅有2例患者出現了注射部位周圍輕微發紅或腫脹的症狀。從以上結果可以看出，幹細胞治療的安全性較高，且沒有發現嚴重的不良反應。

間充質幹細胞改善膝骨關節炎的優勢

膝骨關節炎是一種以關節軟骨退化、軟骨下骨異常為特徵的慢性疾病，主要表現為關節疼痛、僵硬、腫脹及活動受限。

據統計，全球約有5.28億人受此病困擾，且隨著年齡的增長，患病率還在顯著上升。傳統治療方法如非甾體抗炎藥、糖皮質激素注射及關節置換術等，雖能暫時緩解症狀，但長期效果有限，且可能帶來一系列副作用，如胃腸道不適、感染風險增加等。

幹細胞療法，特別是間充質幹細胞的應用，為KOA的治療開闢了新的途徑。

（圖片可見參考文獻2）

如上圖所示，MSCs具有多向分化潛能，能夠分化為軟骨細胞、成骨細胞等，可以直接參與受損關節組織的修復與再生。此外，MSCs還具有免疫調節和抗炎作用，能夠減輕關節炎症，改善關節微環境，從而促進軟骨修復。

與傳統治療方法相比，幹細胞療法具有以下顯著優勢：

1.精准修復：MSCs能夠定向遷移至受損部位，通過分化為軟骨細胞直接參與軟骨修復，提高治療效果。

2.抗炎作用：MSCs通過分泌多種抗炎因數，減輕關節炎症，緩解疼痛，改善關節功能。

3.安全性高：幹細胞療法採用自體或異體幹細胞，來源廣泛，且經過嚴格篩選與培養，確保治療的安全性。

小結

近年來，幹細胞為膝骨關節炎帶來了全新的選擇。未來，仍需開展更多的研究來推動其更為廣泛的臨床應用，比如，幹細胞來源、製備工藝及品質控制需進一步優化，以確保治療的安全性和有效性。其次，仍需大規模、多中心、隨機對照試驗進行長期療效的進一步探討。

隨著科學技術的不斷進步和臨床研究的深入，幹細胞改善膝骨關節炎更多高品質的研究成果有望湧現，為膝骨關節炎帶來更加安全、有效的改善方案。

参考文献：

[1]Holiuk, Y., Birsa, R., Bukreieva, T. et al. Effectiveness and safety of multiple injections of human placenta-derived MSCs for knee osteoarthritis: a nonrandomized phase I trial. BMC Musculoskelet Disord 26, 418 (2025).

https://link.springer.com/article/10.1186/s12891-025-08664-2#Abs1

[2]Chen Y, Cheng RJ, Wu Y, Huang D, Li Y, Liu Y. Advances in Stem Cell-Based Therapies in the Treatment of Osteoarthritis. Int J Mol Sci. 2023 Dec 28;25(1):394. doi: 10.3390/ijms25010394. PMID: 38203565; PMCID: PMC10779279.