Nature | CAR免疫細胞：設計原理、耐藥性及下一代方向

Nature | CAR免疫細胞：設計原理、耐藥性及下一代方向

原文連結：https://www.nature.com/articles/s41586-023-05707-3

嵌合抗原受體（CAR）療法在B細胞和漿細胞腫瘤中表現出顯著的臨床活性，驗證了該療法類別在液態癌症中的使用，然而，耐藥性和應用範圍的限制仍是廣泛應用的難題。這篇綜述回顧了當前CAR的免疫生物學和設計原則，並介紹了預計將推動未來臨床進展的新興平臺。該領域正在快速擴展下一代CAR免疫細胞技術，這些技術旨在提升療效、增強安全性和可接入性。在提升免疫細胞適應性、啟動內源性免疫、武裝細胞以抵抗腫瘤微環境的抑制，以及調節抗原密度閾值的方法上已取得了實質性的進展。越來越複雜的多特異性、邏輯門控和可調節CAR顯示出克服耐藥性和提高安全性的潛力。隱蔽式、無病毒和體內基因傳遞技術的初步發展為降低細胞療法的成本和提高其廣泛應用提供了可能性。CAR T細胞在液態癌症中持續的臨床成功正在推動越來越複雜的免疫細胞療法的發展，這些療法預計在未來幾年內將轉化為用於治療實體瘤和非惡性疾病的治療方法。

引言

嵌合抗原受體（CAR）是合成模組化蛋白，可重定向免疫細胞以應對在惡性腫瘤細胞上表達的目標抗原。這種靈活的平臺在治療B細胞和漿細胞惡性腫瘤方面已經顯示出了顯著的臨床效果，因此，這種療法的應用潛力正推動著科技的快速發展以及來自學術界和生物製藥行業的大規模投資。美國食品和藥物管理局（FDA）已經批准了六種CAR T細胞產品，包括用於大B細胞淋巴瘤（LBCL）、B細胞急性淋巴細胞白血病（B-ALL）、濾泡狀淋巴瘤和其他12種病症的治療。在關鍵的臨床試驗中，CD19-CAR療法在LBCL的二線治療中表現優於標準護理療法（SOC），並且作為一線治療非常有效，為其在早期疾病階段的應用鋪平了道路。現在，針對CD19的CAR療法已經不再是唯一選擇。有兩種針對BCMA（又名TNF受體超家族成員17）的CAR T細胞療法已經獲得了美國食品藥品監督管理局（FDA）的批准，用於治療多發性骨髓瘤。此外，還有針對其他目標的CAR療法在治療其他類型的白血病和淋巴瘤中也展示了很高的效果，包括CD22、CD30、CD7、CD20和GPRC5D。為了降低CAR T細胞治療的風險，現在已經有標準的毒性評估和管理流程，使得與CAR T細胞治療相關的死亡率得以降低雖然我們在CAR-T細胞療法上取得了一些進展，但仍有很多問題需要解決。對於接受商業化CAR-T細胞治療的B細胞癌症患者來說，只有不到一半的人能得到持久的疾病控制。在實體腫瘤的治療上，CAR-T細胞療法雖然顯示出一些有效性，但是持久並且一致的高效反應的證據仍未明確。此外，從患者體內提取細胞製備CAR-T細胞的過程既耗費時間又需要大量資金，而現在的商業化生產能力還無法滿足所有的臨床需求。該綜述闡述了對CAR-T細胞免疫生物學的當前理解，強調了癌症中的耐藥機制、設計原則，以及增強療效的新興方法。我們主要關注開發用於癌症治療的CAR T細胞，但許多原則與其他用於癌症的免疫細胞療法和開發用於非惡性疾病的細胞療法的新興嘗試有關。

CAR-T免疫生物學及其耐藥機制

許多團體長期廣泛地致力於為癌症開發免疫細胞療法，這些努力對於CAR-T療法的成功至關重要（圖1）。CAR是由Eshhar和他的同事們發明的，目標是利用自然T細胞的擴張、殺傷和持久性，同時克服T細胞受體（TCR）的主要組織相容性複合體（MHC）限制，以實現更廣泛的治療適用性。經過許多集團的反復優化，一個融合了scFv作為抗原結合域、鉸鏈/跨膜域、TCRζ和CD28或4-1BB共刺激末端結構域的受體，最終成為了CAR的原型（圖2）。這種結構被FDA批准的六種藥物中的五種採用，而第六種藥物則在保持同樣的結構的基礎上，使用兩個納米抗體重鏈（Vhh）作為抗原結合區。1.5-2.2千基對（kb）的受體的抗原結合過程在很大程度上複製了自然T細胞中由TCR-CD3複合體介導的抗原特異性啟動和殺傷，然而，CAR T細胞和自然T細胞的生物學之間存在顯著差異，這為這些治療劑的應用提供了機遇和挑戰。

 

 

由於抗原調節產生的耐藥

CAR和TCR信號傳導之間的一個主要區別是，CAR需要更高的抗原密度才能完全啟動T細胞。儘管單鏈變數片段（scFvs）與TCRs相比具有更高的親和力，並且CAR的表達密度通常比TCR-CD3複合體高，但TCRs對每個抗原呈現細胞中不到100個肽就可以完全引發啟動，而CAR則需要每個目標細胞上有超過1000個目標分子。這種差異的原因包括CAR對近端激酶招募的減少，免疫突觸的發展程度較低，共受體的參與程度減少，以及對下游負調節因數的更大誘導，其中部分與強直信號有關，其中CAR的聚集，通常由scFv驅動，誘導抗原無關的啟動。CAR原型設計的修改在一定程度上可以調整抗原密度閾值，其中調節信號強度、scFv親和力、CAR表達密度、鉸鏈/跨膜結構和突觸間距的特徵都會產生重要影響（圖2）。由於更大的信號強度降低了抗原密度閾值，因此增強T細胞適應性的特徵，無論CAR設計如何，也會降低CAR抗原密度閾值。這些見解對於開發安全有效的CAR T細胞療法至關重要，因為毒性和有效性與靶向抗原的表達特性密切相關。靶向那些對生命至關重要的組織中不存在的分子的CAR，例如B細胞系列抗原，應被設計為在低抗原密度下啟動，以降低低抗原復發的風險，而靶向那些在癌症中高度表達但在重要的組織中表達低的分子的CAR，應被設計為具有更高的抗原密度閾值，以利用基於差異抗原密度的治療視窗。

抗原調節是B細胞惡性腫瘤中CAR T細胞失去作用的主要原因，而在實體瘤中，大部分可靶向的抗原都表現出顯著的異質性，這可能會帶來更大的挑戰。在兒童和青少年的B細胞急性淋巴細胞白血病(B-ALL)中，約50%的復發與CD19喪失有關，而在大B細胞淋巴瘤(LBCL)中，約30%的復發為CD19陰性，另有30%的復發在商業化CAR的抗原密度閾值以下表達CD19。多發性骨髓瘤中BCMA-CAR T療法對抗原變化的抵抗作用定義不明確。基礎的BCMA表達水準在患者中異質性大，且與臨床反應無關。BCMA喪失 — 與基因突變和缺失相關 — 是抵抗的罕見原因（不到5%的病例），然而，在BCMA-CAR治療後可觀察到抗原調節。抗原密度可以通過各種機制進行調節，包括基因突變、RNA選擇性剪接、細胞譜系轉換、表觀遺傳、轉錄後機制、胞啃作用、超糖基化以及抗原脫落。一些目標的下調可以通過小分子藥物進行治療干預，如用bryostatin來上調CD22，用 azacitidine來上調CD70，以及用γ-分泌酶抑制劑來上調BCMA，這些藥物能抑制抗原脫落。

T細胞功能低下導致耐藥

CAR T細胞抵抗的第二個主要原因與T細胞的效能、持續性、功能持久性和/或功能障礙不足有關，這通常與在沒有抗原調節的情況下疾病復發有關。功能障礙通常是由T細胞耗竭引起的，這是通過全域轉錄和表觀遺傳重程式設計引導的終末分化的結果。在T細胞收集、製造的CAR T細胞產品中，有時可以觀察到T細胞耗竭，而經過高腫瘤負荷後也會誘導耗竭。CAR結構中的內部因素也會導致耗竭，其中共刺激領域起主要作用。與4-1BB和第一代CARs相比，CD28協同刺激的CARs表現出更快更大的擴增，分泌更多的炎性細胞因數，而且由於T細胞耗竭，其存在的時間相對較短。在某些情況下，4-1BB和第一代CARs可能可以持續存在數年。在存在強直信號（tonic signalling）的CARs中，CD28協同刺激結構域對於加速T細胞耗竭的影響尤為顯著。強直信號的影響取決於信號的強度，並且與環境有關，一些CARs在存在強直信號的情況下可以表現出更好的功能和持久性。通過在CD3ζ或CD28結構域中進行突變，降低基於CD28的CARs的信號強度，可以減輕其對T細胞耗竭的傾向，從而提高其持久性。值得注意的是，最近一項長期跟蹤研究表明，長壽的CARs都是CD4陽性的，這引發了一個設想：這一亞群可能更不容易耗竭，從而展示出更高的持久性。

CD28與4-1BB協同刺激的CARs存在時間較短的臨床效應因疾病而異。在大B細胞淋巴瘤（LBCL）中，腫瘤的消除發生得非常快，CD28和4-1BB協同刺激的CAR T細胞表現出類似的療效。然而，在B細胞急性淋巴細胞白血病（B-ALL）中，CAR T細胞的存在時間超過6個月與復發率增加有關——因此，除非患者在CAR治療後接受骨髓移植以鞏固緩解狀況，否則CD28協同刺激的CAR T細胞的效果較差。在多發性骨髓瘤中，抗BCMA-CAR T細胞的功能持久性與回應時間的延長相關。目前還不清楚對於實體瘤來說，是更偏好CD28還是4-1BB的協同刺激，因為強烈的信號強度和持久性都是desirable。同時包含CD28和4-1BB協同刺激結構域的CARs並未表現出優勢，這使得研究人員開始嘗試整合新的或者合成的協同刺激結構域，目標是賦予最大的信號強度和持久性。通過CAR的合併篩選，已經用來識別最佳的CAR信號結構域和設計，並闡明CAR設計原則。全基因組CRISPR篩選已經確定CD2-CD58軸作為T細胞效能的介導者，並已證明IFNγR信號傳導在實體瘤中（而非液態瘤）對於CAR T細胞的粘附和細胞毒性是必需的。CAR T細胞的效能也受到腫瘤微環境（TME）中的免疫抑制分子（TGFβ、IL-10、IL-6和檢查點分子）的限制，目前正在進行的工作包括將CAR T細胞療法與免疫調節劑結合，旨在啟動TME內的免疫應答，並賦予免疫細胞抵抗特定的免疫抑制介質的能力（見box1）。

 

 

轉運受損與局部給藥

另外，受損的到達腫瘤部位的運輸可能也會限制CAR T細胞的效果，特別是在實體瘤中。在中樞神經系統腫瘤的預臨床模型中，腫瘤內或腦室內（ICV）給藥已經顯示出改善療效，局部劑量大約降低十倍就能達到與靜脈給藥相同的效果。幾項臨床試驗已經證明了將CAR T細胞局部區域性地輸入到中樞神經系統的安全性，對於一位多形性膠質瘤患者，ICV輸送的IL-13Rα2 CAR T細胞誘發了完全反應，而腫瘤內給藥則未見有效。在一項對彌漫性中線膠質瘤患者的研究中，ICV輸送的GD2-CAR T細胞誘發了抗腫瘤效果和臨床反應，並且重複給藥與持續的益處相關，這提出了一個可能性，即向中樞神經系統的輸送可能消除免疫敏化，這可能限制了多劑量靜脈CAR T細胞方案的有效性（ In a study of patients with diffuse midline gliomas, ICV delivery of GD2-CAR T cells induced antitumour effects and clinical responses, and repeated dosing was associated with sustained benefit, raising the prospect that delivery to the central nervous system may abrogate immune sensitization, which has probably limited the effectiveness of multidose intravenous CAR T cell regimens.）。在涉及胸膜的肺癌患者中，間皮素-CAR T細胞的區域遞送與PD-1阻斷相結合，介導穩定的疾病和代謝反應。另外，正在研究的策略是讓T細胞自身產生IL-7和CCL19，以改善它們對腫瘤微環境的定位和在其中的持久性。

下一代CAR-T細胞

本節將討論用於克服腫瘤抗性機制、增強免疫細胞活力、提高特異性、調整CAR信號、提高安全性和增加抗原敏感性的各種下一代平臺。

減少抗原逃逸

雙特異性CAR靶向可通過施用混合細胞產品、兩個受體的雙區表達、兩個scFvs併入一個受體或多個CAR的共同轉導來實現，每種方法都帶來了機遇和挑戰。共同輸注（co-infusion）在經濟、人力和細胞資源上都需要大量投入，而共同轉導（co-transduction）會生成多樣性的產物，這種情況下可能會出現某一亞群體在輸注後主導整個細胞群體，從而產生風險。雙區表達可能會導致蛋白表達降低，在一項臨床試驗中，雙區表達的CAR-T顯示出有限的持久性。已經報告了幾項針對CD19加CD20或CD22的雙特異性受體的試驗，在其中一項中，該受體對CD22的效力降低，而且腫瘤細胞變種顯示出CD19的表面表達量低或無表達。FDA近期批准的BCMA-CAR（雙特異性駱駝抗體胞外域結合部位抗原受體）cilta-cel，包含在一個受體中的兩個串聯Vhh結合物，它們可以結合到BCMA上的兩個不同的表位。cilta-cel的臨床結果顯示，83%的患者達到了嚴格完全緩解（sCR），並且在27個月的無進展生存率（PFS）為55%，這是到目前為止使用CARs治療多發性骨髓瘤報告的最高值（表1）。總的來說，多特異性CARs的臨床資料還處於初期階段，但已經展示出安全性和通過減少抗原逃逸來提高效果的潛力。

為降低抗原密度閾值而設計的新型受體也在開發中。Katsarou和他的同事已經表達了一種嵌合的共刺激受體(CCR)，它缺乏cd3ζ結構域，並報告說，CCR的參與在非常低的抗原密度下啟動了CAR-T細胞，防止了臨床前模型中的抗原低逃逸。對非CAR T細胞抗原產生抗腫瘤反應–如在一位患有橫紋肌肉瘤的患者接受CAR T細胞治療後所報導的–可能會減少由抗原調節引起的抗性。有幾種方法正在開發中，以增強先天和適應性免疫（box1），包括CAR介導的免疫刺激RNA RN7SL1的傳遞，共同表達配體或重塑TME的細胞因數，如IL-12、IL-18、CD40L或Flt3L、 設計CAR T細胞以分泌雙特異性T細胞誘導劑（BiTEs），利用CAR T細胞在腫瘤部位的積累，避免BiTE的全身毒性，或使用可能介導更有力的內源性抗腫瘤活性的非傳統免疫細胞。

增強T細胞功能

大量增強免疫細胞的適應性的研究正在進行中（見圖3和box1）。大部分的工作集中在表觀遺傳調控上，部分原因是在一項針對慢性淋巴細胞白血病的CD19-CAR臨床試驗中，有一位異常反應良好的患者，慢病毒整合破壞了TET2基因，這是DNA甲基化的介導者，導致了大量的克隆性T細胞增殖和持續的抗腫瘤反應。同樣地，DNMT3A基因的敲除在預臨床模型中增強了CAR T細胞的抗腫瘤活性。通過過表達轉錄因數來防止耗竭也顯示出了潛力，包括過表達AP-1因數JUN，這增強了T細胞的擴增和持續性，減少了末端分化，降低了抗原密度閾值，這可能是由於信號強度的增加。類似地，BATF轉錄因數的過度表達已經被報導可以增強T細胞的效力。正在開發製造策略，以優化CAR T細胞的表型，朝向幹細胞樣和中心記憶亞群，包括縮短培養時間，抑制PI3K–mTOR–AKT，BTK或酪氨酸激酶信號，以及在促進記憶的細胞因數中培養。

CRISPR介導的基因編輯首次在採用的T細胞療法中臨床應用，在這種療法中，PD-1被從工程化的細胞中刪除，這些細胞被設計來表達NY-ESO-1，一種癌症特異性的TCR轉基因。這些工程化的細胞並沒有顯示出增強的持久性或效力，但該研究證明了該方法的可行性和安全性，並加速了應用基因編輯技術以增強免疫細胞療法的努力。已經有一些基因被確定為候選基因，以增強T細胞的適應性（box1），並且CRISPR介導的T細胞標誌物如CD7和CD5的破壞使CAR T細胞療法能夠用於T細胞惡性病，同時避免了CAR T細胞的溶解（被稱為‘同類殺伐’）。我們預計將有越來越多的臨床試驗活動，將基因編輯的免疫細胞整合到採用的免疫細胞療法平臺中，以增強其效力，擴大可靶向抗原的範圍，並避免免疫敏感化。

為了增強持久性，一些研究人員已經試圖將細胞因數信號整合到CAR受體中，或者轉基因表達細胞因數，包括一個臨床試驗，其中表達CAR的自然殺傷細胞轉基因表達IL-15顯示出持久的存在。免疫排斥也可能限制CAR T細胞的持久性，因為可以在許多病人體內測量到針對小鼠、人源化或全人scFvs的抗CAR免疫反應。同樣的，臨床經驗顯示，第二次和隨後的靜脈內CAR T細胞的效用有限，可以通過使用淋巴清除方案來改善。這些發現提出了這樣的前景，即正在開發的stealth平臺，能夠通過增強持久性或啟用多次CAR T劑量方案來增強CAR T細胞的效能，從而使現成的異體產品成為可能。

當前正在進行多種努力以解決抑制性的腫瘤微環境（TME）（見Box1），包括基因消融或表達佔優勢的TBGβ、PD-1或Fas受體，以及工程化CAR T細胞分泌檢查點阻斷scFvs。一些研究者已經設計出切換受體，這是一種融合蛋白，能夠將TME中的抑制信號轉換為CAR T細胞中的啟動信號。然而，由這種受體引發的持續啟動信號是否會導致長期的CAR T細胞增強或使它們傾向於耗竭和終末分化，這仍有待確定。此外，也正在探索基於生物材料的方法來增強細胞的擴增和持久性。

 

 

CAR調控與可調節平臺

大量的研究工作正在進行，旨在通過調節或抑制CAR信號傳導來提高安全性和效力，以降低毒性和耗竭。這個概念最初是由Eyquem等人提出的，他們使用CRISPR技術將CAR受體敲入TRAC位點，並觀察到由於內源性TRAC調控元件介導的抗原誘導的CAR下調，CAR-T細胞的效力和耗竭有所改善。韋伯和他的同事們利用合成生物學或小分子技術暫時停止CAR信號，當在製造過程中使用時，這種方法能提高CAR-T細胞的效力，在移植後體內應用時，能提高抗腫瘤效果。

如iCasp9、HSV酪氨酸激酶（HSV-tk）和表位元標籤等”殺手開關”能夠在出現嚴重毒性的情況下清除工程化的細胞，而且，我們已經開發出一種使T細胞對尿苷有需求的無轉基因的安全開關。調節性平臺不僅可以作為可逆的安全開關，還可以調整CAR的信號，從而提供防止T細胞耗竭的休息期，提高T細胞的效力。我們已經開發出眾多的可調節平臺，這些平臺採用了藥物敏感的啟動子、誘導二聚化、分裂式CAR、藥物依賴的啟動劑、蛋白質降解的嵌合物（PROTACs）、化學依賴性降解領域和藥物調控的CAR蛋白質降解等技術。這些系統代表了合成生物學的重大進展，但仍然面臨著關閉狀態下有毒性風險的洩漏活動、開啟狀態下CAR表達或活性減弱以及使用免疫抑制藥物作為調節器的挑戰。

Labanieh等人最近開發了一種蛋白酶調控的Grazoprer誘導的 “藥物ON “平臺，即 signal neutralization by an inhibitable protease (SNIP)，它顯示出無洩漏的活性和完整的功能能力（圖3）。最近，Labanieh等研究者開發了一種新型的受蛋白酶調控的藥物啟動平臺，稱為“SNIP”。該平臺在未被啟動的狀態下沒有殘留活性，並且在被藥物（如Grazoprer）啟動後能全面發揮作用（如圖3所示）。和synNotch系統類似，SNIP能夠降低CAR T細胞的耗竭程度，從而提高其抗腫瘤效果。在一個特定的實驗模型中，通過降低Grazoprer的劑量，研究者能夠調節SNIP-CAR的活性，這樣就能找到一個治療的視窗，在該視窗中，健康的正常細胞可以存活，而表達ROR1的腫瘤細胞則會被消滅。同樣地，Hernandez-Lopez等人改進了synNotch平臺，使其能夠在避免攻擊正常細胞的同時，有效地對付高度表達腫瘤特異性抗原的腫瘤細胞。因此，這種可調節的CAR技術顯示出了在提高療效和減少毒性方面的潛力。

通過布林邏輯增強特異性

B細胞和漿細胞惡性腫瘤特別適合接受CAR-T細胞治療，因為這些細胞高度、均勻地表達的抗原主要在B細胞和漿細胞上共表達，而這些細胞的消耗是可以容忍的。然而，最近的一篇病例報告顯示，一名患者在接受BCMA-CAR T細胞治療後出現了帕金森病症狀，屍檢分析顯示在患者的基底節神經元和星形膠質細胞子集中表達有BCMA。在另一項研究中，單細胞RNA測序分析顯示腦壁細胞上表達有CD19，這提出了一個可能性，即CD19-CAR T細胞治療後的神經毒性可能是由於準確打擊目標細胞所致。這些結果突顯了確定不在重要組織上表達的靶標的挑戰。

到目前為止，由於實體瘤表面缺乏特異性腫瘤標誌物，CAR T細胞療法的應用在實體瘤中仍受限，針對CAIX和CEACAM5的CARs在臨床試驗中觀察到了不可接受的靶向腫瘤外毒性。然而，針對實體瘤的CAR T細胞和其他強效的抗體導向療法的幾項臨床試驗已展現出良好的安全性檔案（表1）。CAR抗原密度高的閾值可能解釋了為何能安全靶向某些已知在重要組織上有表達的抗原，如在神經組織上低表達的GD2。最近一項試驗顯示，針對claudin-18.2的CARs展示了有希望的臨床活性，並與顯著但非劑量限制性的毒性相關，這可能是由於抗原表達局限於胃粘膜中深層的分化上皮細胞，這些細胞對CAR T細胞可能較難接觸。尋找具有足夠差異性表達的可安全靶向的分子，如癌胚表面靶標（oncofetal cell-surface targets），對於將CAR T細胞療法擴展到B細胞和漿細胞惡性瘤以外是至關重要的。然而，隨著實施增強效能和持久性的策略，將需要持續重新評估特定靶標的安全性，如在最近的一項研究中，一個整合了有著優勢負性TGFβ受體的針對PSMA的CAR與致命毒性相關。

包含邏輯門的下一代受體可以通過組合抗原感應更好地區分腫瘤和健康組織，並擴大潛在抗原的範圍（圖3）。Roybal等人開發了synNotch，這是一個IF-THEN電路，包含了一個針對抗原A的受體，一旦接觸，就會觸發針對抗原B的傳統CAR的轉錄。synNotch系統還沒有經過臨床測試，但在臨床前模型中，當腫瘤和易感的重要組織不在一起時，它可以防止目標上、非腫瘤的毒性。Tousley等人開發了一個名為LINK的AND門平臺，它利用了近端TCR信號分子LAT和SLP76，每個分子都融合了一個膜結合的scFv，對一個獨特的抗原進行特異性處理。在一個針對ROR1的模型中，該模型的目標是對腫瘤進行精確定位，但可能對非腫瘤組織產生毒性。在這個模型中，LINK CAR T細胞能夠消除表達兩種抗原的腫瘤，而不會引起與ROR1相關的毒性。然而，接受synNotch T細胞治療的小鼠卻無法承受這種毒性。目前正在開發的其他用於組合抗原定位的方法包括SUPRA和co-LOCKR，它們通過蛋白質開關機制來改變CAR T細胞的靶向性。儘管通過組合抗原識別可能會擴大可供靶向的腫瘤抗原的範圍，但腫瘤因丟失其中任何一種抗原而逃脫的風險可能會增加。另一種提高特異性的方法是使用“與非”邏輯門，該方法包括將啟動性CAR與一種抑制性CAR（iCAR）同時表達，其中iCAR靶向在健康組織上但非腫瘤組織上表達的抗原。目前，“與非”邏輯門的應用尚處於初步階段，且還未在臨床上進行測試。

TCR樣的CAR

以靶向低水準表達的抗原為目標，通過對內源性TRAC基因座進行基因編輯，將內源性TCR的可變區改變為單鏈抗體的不依賴於人類白細胞抗原的TCRs(HIT)。當CD80和4-1BBL以反式形式提供時，靶向CD19的HITS顯示出比原始的CD19-CARS更高的抗原敏感性(圖3)。合成TCR和抗原受體（STARs）具有類似的設計，但沒有敲入TRAC基因座；因此，內源性TCR的特異性得到了保留。其他重定向TCR特異性的方法包括抗體-TCR（AbTCR）平臺，它用Fab片段取代TCRγδ的可變結構域，以及TCR融合構建體（TRuC），它將scFv與CD3亞單位融合。最近對TCR類嵌合受體的比較表明，STAR和HIT受體能重現TCR抗原的敏感性，而TruCs卻不能。與天然T細胞相比，CAR T細胞的一個潛在缺陷是不能靶向細胞內抗原，因為大多數導致癌症的異常蛋白都是細胞內的。Yarmarkovich等人克服了這一點，開發了一種針對MHC(PMHC)呈現的多肽的CAR。他們利用了一種能特異性識別並結合在神經母細胞瘤中過度表達的PHOX2B肽-MHC複合體的scFv結合子，這使得他們能夠針對多種HLA等位基因的pMHC進行靶向。這種策略可能大大擴展CAR T細胞治療的目標範圍，包括關鍵的癌症驅動因素。

增加可及性和效率

人們正在採用各種方式，目的是擴大細胞治療的應用範圍，降低其生產成本，研製出可以抵抗排斥的隱形免疫細胞，並充分利用其他免疫細胞的獨特特性。

分散式製造和同種異體產品

隨著工程技術的進步，自動化封閉系統的製造已經實現，這為現場製造打開了新的可能，從而減少了中心化製造模式（即行業標準）帶來的成本、延誤和物流問題。最近的一項多中心研究證實了現場製造細胞的安全性和效能。目前，確定現場製造的監管要求尤其受到關注，特別是針對罕見病，如兒童癌症的治療。

通過利用來自健康的’超級捐贈者’製造異源性CAR T細胞，我們有可能提升治療效力，避免已存在的T細胞功能障礙，同時降低生產成本和物流難題，從而提高治療的普及性。然而，異源性T細胞療法面臨著要克服TCR介導的GVHD風險以及宿主免疫系統可能對移植細胞產生的排斥反應。雖然基因編輯技術可以消除內源性TCR，從而消除GVHD的風險，但要使細胞具有避開免疫排斥的隱形特性依然是一大挑戰，因為CD8+細胞、CD4+細胞、自然殺傷細胞和巨噬細胞均有可能對異源性細胞產生排斥，每種細胞的調控機制都不同，因此需要進行多種優化措施（詳見Box 1）。例如，敲除β2-微球蛋白可以消除HLA-I類的表面表達，但這反而可能增加自然殺傷細胞的排斥風險。此外，誘導異源性耐受的策略包括敲除CIITA基因消除MHC II類表達，以及通過過表達HLA-E和CD47來減少自然殺傷細胞和巨噬細胞對細胞的排斥。

大量異源性策略都採用了CRISPR-Cas9技術，而當用單一的生產過程製造成百上千的異源產品時，基於CRISPR的突變事件的風險可能會被放大。由於它們很可能因為沒有雙鏈DNA斷裂而降低了風險，基因編輯和primer編輯等替代平臺可能會逐漸成為以核酸酶為基礎的基因編輯的更好選擇。另外，以RNA為目標的CRISPR-Cas系統也可以為多重基因敲除提供機會，與RNA介導的干擾相比，其特異性和效率更高。儘管包含多重基因編輯的異源供體細胞可能具有重大優勢，但這些技術仍處於初期階段，其毒性特性尚未明確。有些研究團隊嘗試通過增強宿主的免疫抑制來防止免疫排斥，他們使用傳統的化療或免疫抑制抗體，而這些抗體的靶點則從CAR T細胞中被編輯掉。這種策略的初期回應率令人充滿希望，但其長期安全性和有效性尚未得到證實，且對於與強烈的免疫清除方案相關的感染風險的擔憂依然存在。

可替代的免疫細胞

包括自然殺傷細胞、iNKT細胞、γδ T細胞和巨噬細胞在內的多種非T免疫細胞顯示出天然的抗腫瘤活性，並且不會誘導GVHD，這為他們可能提供一種減輕毒性、增強腫瘤遷移能力，或者通過天然識別腫瘤來針對抗原陰性變體的即用型細胞源提供了可能性。然而，異源性天然免疫細胞仍容易被排斥，如果這些細胞未經精心設計以降低被識別概率，這就引發了人們對其效果持久性的擔憂。臍帶血衍生的異體自然殺傷細胞結合異位表達的IL-15，在一期試驗中顯示出治療NHL和CLL的前景。在小鼠模型中，iNKT-CAR細胞通過部分激發宿主CD8細胞對腫瘤抗原的反應表現出活性，並且其在一項針對神經母細胞瘤的初級臨床試驗中已經顯示出安全性和可能性。此外，工程改造後能表達CD20-CAR的γδ T細胞在早期研究中也表現出了顯著的活性。儘管在巨噬細胞中表達CAR需要對載體和信號域進行大量調整，但是預實驗模型已經證明其具有增強吞噬、改變腫瘤微環境和吸引T細胞等抗腫瘤效果，其中，以CD3ζ為基礎的CAR與以Fcγ為基礎的CAR顯示出相似的吞噬活性。現在，人們也在努力研發誘導多能幹細胞（iPS）衍生的CAR T細胞、自然殺傷細胞和巨噬細胞。iPS細胞向自然殺傷細胞的分化特別成功，這些即時使用的療法的臨床測試目前正在進行。而相比之下，iPS細胞分化為具有完全功能的T細胞則更為挑戰性。鑒於iPS細胞衍生產品幾乎擁有無盡的擴張潛力，它們可以實現大規模生產具有多種增強特性的均一細胞產品，包括賦予其隱形屬性、安全開關以及有效性。因此，人們對這些新興平臺的長期安全性和有效性結果充滿了期待。

下一代基因傳遞技術

病毒載體的基因傳遞一直被認為是這個領域的黃金標準，然而病毒載體的製造和鑒定過程既花費高昂又耗時。目前，正在研發無病毒的基因傳遞平臺，雖然DNA範本對T細胞具有毒性，且這種方法的效率仍然不如病毒載體，但已經通過在人T細胞中使用基於CRISPR的基因傳遞來證明了這個原理。臨床可行性已被證實，通過將CD19-CAR特異地傳遞到PD-1位點，引發了NHL中的高CR率，儘管這個製造過程並未能滿足相當大一部分患者的劑量要求。改良DNA範本和小分子抑制劑混合液正在提高基因插入的效率和細胞產量。轉座子基因傳遞方法也已經被使用，然而有兩個病例報告使用Piggybac轉座子平臺進行高拷貝數的整合後，CAR工程T細胞發生了惡性轉化。體內基因傳遞是一種新興的方法，能提高可訪問性並降低成本。在這種方法中，DNA或RNA通過病毒載體或納米顆粒進行系統性傳遞，這些納米顆粒能優先靶向並在體內轉化免疫細胞群。但是，由於病毒載體可能引發中和抗體，其免疫原性可能限制其重複使用。已經證明，在小鼠中使用靶向CD3的脂質納米顆粒可以穩定表達CD19-CAR，而且含有優化RNA的T細胞靶向脂質納米顆粒在小鼠模型中減少了心臟纖維化。

用於非惡性疾病的CAR療法

雖然CAR T細胞平臺已經被優化用於癌症治療，但是應用於CAR T細胞的設計原則和廣泛的合成生物學工具箱為將此治療方法擴展到包括自身免疫性疾病、衰老、纖維化和傳染性疾病在內的非惡性疾病提供了可能性。在臨床前研究中，CD19-CAR T細胞已在系統性紅斑狼瘡中顯示出有益效果，且有病例研究報告了CD19-CAR療法在一個難以治療的狼瘡性腎炎患者中的持久效果。嵌合型自身抗體受體（CAARs）是原型CARs，它們中包含針對自身反應性B細胞克隆的特異性決定簇（idiotype）的scFv，或者使用自身抗原作為識別領域。臨床前研究中，CAARs已在天皰瘡治療中展示了療效，臨床測試也正在進行中。採用調節性T細胞（Treg細胞）作為替代方法來治療自身免疫性疾病，這種細胞主要發揮抑制作用，而非毒殺作用。非工程化的Treg細胞在移植物抗宿主病（GVHD）、異種移植、1型糖尿病、系統性紅斑狼瘡和多發性硬化症的小鼠模型中已經表現出了活性，早期臨床資料也顯示了這種方法的可行性和良好的安全性。與非工程化細胞相比，表達針對疾病組織上表達的抗原的CAR的Treg細胞顯現出了更強的特異性和效能。最近的研究資料顯示，無意中擴展CAR Treg細胞的數量已經限制了商業CAR T細胞的效果，這為CAR工程化Treg細胞的實用性提供了原理驗證。目前，人們正在嘗試通過工程化FOXP3表達來強化其譜系穩定性，並引入安全開關以減少相關風險。在血友病小鼠的最新預實驗資料中，研究人員發現表達了針對因數VIII的CAR和FOXP3的Treg細胞能夠阻止中和抗因數VIII抗體的產生。此外，針對尿激酶型纖溶酶原啟動物受體的衰老細胞殺傷CAR T細胞已經被證明能在體外靶向衰老細胞，並在肝纖維化模型中恢復組織的穩態。針對成纖維細胞活化蛋白（FAP）的CARs在心臟纖維化的小鼠模型中已經提高了心臟功能，並且利用裝載有mRNA的CD5導向脂質納米粒子在體內生成的FAP-CARs也顯示出有益效果。在這個模型中，mRNA的非整合特性確保了CAR表達是暫時性的，因此減輕了因廣泛清除活化成纖維細胞所帶來的毒性風險。