精準生技產品PB101 (CIK)細胞對於癌細胞/標的細胞之毒殺機轉

CIK細胞(Cytokine induced killer cell (CIK))是將人體外周血單個核細胞在體外用多種細胞因數共同培養後而獲得的一群異質細胞,它具有強大的抗瘤活性和非限制性殺瘤的優點,可用於任何一期的癌症患者。 該細胞對腫瘤細胞的識別能力很強,尤其對手術後或放化療後的患者治療效果顯著,能消除殘留微小的轉移病灶,防止癌細胞擴散和復發,提高機體免疫力。

人類經過演化出的免疫系統多元而複雜,其中主要撲殺不正常細胞的有先天性免疫系統之自然殺手細胞(簡稱NK細胞)與適應性免疫系統之T細胞。正常的細胞在人體中會表現主要組織相容性複合體(major histocompatibility complex,簡稱MHC),並且因基因多變性,每個人所表現的MHC不同,人體的免疫系統皆會藉由MHC的基因表現來區分正常與不正常之細胞;其中NK細胞測到細胞沒有相合的第一型MHC或是消失(有些細胞不表現來躲避T細胞辨認)就會啟動撲殺不正常細胞,其機制主要透過分泌細胞激素調節免疫功能或者利用先天性辨認不正常細胞(如被病毒感染的細胞或癌細胞)上膜蛋白直接執行毒殺變性細胞抑或啟動了變性細胞的細胞凋亡(apoptosis),除此之外,NK細胞上也有免疫球蛋白G的受體(Fc gamma receptor),配合免疫球蛋白(俗稱抗體)能更有效率精準地辨認和撲殺標的細胞;而在T細胞上的接受器(T cell receptor; TCR)辨認到不相合之第一型MHC則會啟動撲殺機制;比較特殊的另一群細胞同時具有NK和T細胞特性的為自然殺手T細胞(簡稱NKT細胞),NKT細胞除了具有先天性和適應性免疫反應之外,如同上游總司令可以同時調控NK和T細胞以及辨認特殊的癌細胞醣抗原(a-GalCer:Alpha galactosylceramide)活化樹突細胞等多種功能。如下圖(圖一):

精準生技之PB101產品歸類於細胞因子誘導的殺傷細胞(Cytokine induced killer; CIK)一類(圖二),一般認為CIK細胞以活化T細胞為主要成分,精準生技PB101含上述的三大元素,先天性免疫系統NK細胞以及適應性免疫系統T細胞和雙種特性的NKT細胞,精準生技的專利製程不需透過磁珠篩選或其他方式單一選擇NK細胞,則可以將NK/NKT(CD56陽性)細胞由原本週邊血淋巴球占比不到10%,在體外擴增實驗(預製程)之數據顯示PB101主要成份為以NK和NKT為主,其CD56+ 細胞純度可達平均73.55%,因此與其他線上自體CIK或是T細胞產品更具有療效功能,其中NKT細胞在其中可以扮演活化免疫系統的關鍵角色,協助NK細胞於第一線撲殺腫瘤細胞。

(圖二)CIK細胞同時具有T細胞和NK細胞雙重特性。CIK具有先天性和後天免疫特性辨認不正常細胞,藉由限制型和非MHC限制型之辨認機制來毒殺標的細胞(如腫瘤細胞),T細胞主要由TCR來辨認MHC表現不正常的細胞,NKG2D/NKp30則為非專一性之毒殺不正常細胞(J Autoimmun. 2017 Dec;85:32-44.)

 

NKT細胞的生物特性及其在抗腫瘤免疫中的作用

NKT細胞是一類特殊的 T淋巴細胞亞群,既表達 NK細胞受體,也表達 T細胞的相關受體NKT細胞在多種免疫應答的調節中發揮重要作用,包括感染、自身免疫性疾病、代謝性疾病和癌症,其通過連接固有免疫系統和適應性免疫系統顯示出強大的抗腫瘤活性

前言

NKT細胞不僅能殺傷腫瘤細胞,也可啟動其他抗腫瘤免疫細胞間接地發揮抗腫瘤作用,還能在腫瘤微環境中啟動衰竭的免疫細胞,在抗腫瘤免疫中發揮重要的作用。自然殺傷性 T細胞(natural killer T cell,NKT cell)是一類特殊的 T淋巴細胞亞群,既表達自然殺傷細胞(NKcell)受體也表達 T細胞的相關受體(Tcell receptor,TCR)。NKT細胞受體一般由恒定的 TCR α鏈和半恒定的 TCRβ鏈組成,識別由非經典 MHCI類分子 CD1d提呈的脂質抗原。CD1d是一種結合自身和外來糖脂類的抗原提呈分子,在單核細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞和 B細胞等多種免疫細胞上均有表達。NKT細胞殺傷腫瘤的活性高,並且 NKT細胞的啟動還可以使衰竭的 CD8+T細胞和 NK細胞重新活化。

1 NKT細胞的生物學特性  NKT細胞在多種免疫應答的調節中發揮重要作用,包括感染、自身免疫性疾病、代謝性疾病和癌症。即使在穩定狀態下,NKT細胞產生的細胞因數也可影響其他免疫細胞的基礎狀態和功能,如樹突細胞和 CD8+T細胞。與常規 T細胞一樣,NKT細胞經歷胸腺發育和選擇,具有 T細胞受體(TCR)以識別抗原。然而,與常規 T細胞不同,NKT細胞表達的 TCR識別由非經典 MHCⅠ類分子 CD1d提呈的糖脂類抗原。除 TCR外,NKT細胞還具有細胞因數受體,如 IL-12R、IL-18R、IL-25R和 IL-23R。

1.1Ⅰ NKT細胞Ⅰ型 NKT細胞是最常見的 NKT細胞類型,表達恒定的 TCR鏈(在人體中為 Vα24-Jα18和 Vβ11,在小鼠中為 Vα14-Jα18和為 Vβ2、Vβ7或 Vβ8.2),NKT細胞的原型抗原是 α-半乳糖神經醯胺(α-galactosylce­ramide,α-GalCer或稱 KRN7000)。α-GalCer是從海洋生物海綿提取物中得到的糖脂類物質,是Ⅰ型 NKT細胞的強效啟動劑,誘導Ⅰ型 NKT細胞釋放大量 IFN-γ,有助於 CD8+T細胞和 APC細胞的啟動。 CD1d缺陷小鼠(缺乏Ⅰ型和Ⅱ型 NKT)或 Jα18缺陷小鼠(僅缺乏Ⅰ型 NKT)模型是研究Ⅰ型 NKT細胞的功能的有效工具。Ⅰ型 NKT細胞在小鼠和人類的不同組織中都存在,但在小鼠中的比例更高。 NKT細胞在功能上與傳統 T細胞的 Th1、Th2、 Th17和 TFH亞群相似,這些亞群表達傳統 T細胞相關的細胞因數、轉錄因數和表面標誌物。多種轉錄因數調控Ⅰ型 NKT細胞的的生長,如早幼粒細胞白血病鋅指蛋白 (promyelocytic leukemiazinc finger, PLZF)是Ⅰ型 NKT細胞發育和啟動記憶表型的關鍵調節因數之一。研究顯示,PLZF缺陷型小鼠模型中嚴重缺乏 I型 NKT細胞,細胞因數產生減少。其他已知影響Ⅰ型 NKT細胞分化的轉錄因數包括 c-Myc、 RORγt、c-Myb、Elf-1和 Runx1。除了轉錄因數, SLAM-相關蛋白(SLAM-associated protein,SAP)信號通路也可以選擇性地控制Ⅰ型 NKT細胞的擴增和分化。Ⅰ型 NKT細胞對自身和外源 α和 β連接的鞘糖脂(glycosphingolipid,GSL)、神經醯胺和磷脂均有反應,主要增強對腫瘤的有效免疫反應。

1.2 Ⅱ NKT細胞與Ⅰ型 NKT細胞相反,Ⅱ型 NKT細胞表達不同的 TCR,被稱為非經典 NKT(non-classical NKT)細胞。儘管 TCR鏈的重組形式多種多樣, Ⅱ型 NKT細胞也以 CD1d依賴的方式識別抗原,但是不識別 α­GalCer。Ⅱ型 NKT細胞是人體中的主要亞群,其比例高於Ⅰ型 NKT細胞。雖然整個Ⅱ型 NKT細胞群體在不同器官中的分佈比例尚不清楚,但是 Ⅱ型 NKT細胞在小鼠和人類肝臟中含量豐富。 Ⅱ型 NKT細胞不僅可以識別脂類抗原,也能識別 CD1d上的疏水結構。在腫瘤和自身免疫性疾病模型中, Ⅱ型 NKT細胞通常與免疫抑制有關。

1.3Ⅲ NKT細胞 Ⅲ型 NKT細胞即 NKT樣細胞,是一組不依賴 CD1d方式識別抗原且對糖脂類抗原無反應的 T細胞亞群,表達不同類型的 TCR和 NK相關受體。由於相關研究較少,目前其特徵和功能尚不明確。在 3種 NKT細胞中,目前研究較多的是Ⅰ型 NKT細胞,其抗腫瘤活性高於其他類型的 NKT細胞。通常所說的 NKT細胞多指Ⅰ型 NKT細胞,本文將重點介紹其生物學特性及其在抗腫瘤免疫中的作用。

2 NKT細胞的抗腫瘤免疫作用

Ⅰ型 NKT細胞在介導抗腫瘤保護性免疫反應中起著重要作用。不同類型癌症患者外周血中Ⅰ型 NKT細胞比例減少和功能受損,提示其在有效抗腫瘤免疫中作用的降低;癌症患者外周血中Ⅰ型 NKT細胞比例增高預示著良好的治療效果。此外,研究發現,腫瘤浸潤 NKT的數量增加與更好的臨床療效有關聯。Ⅰ型 NKT細胞可通過以下機制獲得有效的抗腫瘤免疫: (1)直接溶解腫瘤細胞,作為抗腫瘤效應細胞直接發揮抗腫瘤作用; (2)通過啟動 Th1細胞因數級聯反應來招募和啟動其他固有和適應性免疫細胞,間接發揮抗腫瘤作用。

2.1 NKT細胞的直接抗腫瘤作用

NKT細胞具有強大抗腫瘤活性,可通過 Fas/FasL途徑、釋放穿孔素、顆粒酶 B和腫瘤壞死因數 α相關的凋亡誘導配體等途徑直接殺傷表達 CD1d表達的腫瘤細胞,表達 CD1d的腫瘤細胞主要來源於髓鞘細胞和 B細胞系。隨著 CD1d表達的升高,腫瘤細胞裂解率增加、轉移率降低;而 CD1d在腫瘤中的表達缺乏則導致腫瘤細胞逃避 NKT細胞的識別及腫瘤的進展,推測 CD1d在腫瘤表面的表達與 NKT細胞介導的細胞毒性直接相關。研究假設 CD1d表達的缺失或下調有利於腫瘤細胞的存活,並允許腫瘤細胞從 NKT細胞介導的免疫監視中逃逸。研究發現,乳腺癌和多發性骨髓瘤中 CD1d的下調與轉移潛能的增加以及疾病的進展有關,進一步強化了這一概念。同樣,人乳頭瘤病毒對感染宮頸上皮細胞表面 CD1d的下調與其進展為宮頸癌有關。

2.2 NKT細胞的間接抗腫瘤作用

除了直接殺傷腫瘤外, NKT細胞啟動後可分泌多種細胞因數,如 IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、 IL-13、IL-17、IL-21、IL-22、TNF-α、TGF-β和 GM­CSF,啟動大量的免疫細胞,包括樹突狀細胞、巨噬細胞、中性粒細胞、 NK細胞以及 T和 B細胞間接發揮抗腫瘤免疫作用。此外,活化的 NKT細胞表達 CD40L,並通過 CD40-CD40L相互作用誘導樹突狀細胞的成熟。成熟的樹突狀細胞表達更高的共刺激分子,如 CD40、CD8,產生更多的 IL-12和 IL-18,進而啟動 NKT細胞、 NK細胞和 CD8+T細胞分泌 IFN-γ,並加速這種正回饋。樹突狀細胞上調 NKG2D配體和 CD27的配體 CD70的表達,促進 NK細胞的活化。此外 ,NKT細胞和樹突狀細胞共同啟動 CD8+T細胞,分泌趨化因數 CCL17促進抗腫瘤免疫。B細胞也在 NKT細胞抗腫瘤免疫中發揮作用,通過上調 IgG的產生介導抗體依賴性細胞毒性 (ADCC)作用。因此,增強 NKT細胞的抗腫瘤機制具有較大的研究意義。然而 NKT細胞在抗腫瘤免疫中具有兩面性,一方面,許多腫瘤模型中,在 a-Gal­Cer和 IL-12的共同刺激下, NKT細胞上調抗腫瘤免疫應答,從而抑制腫瘤的發生和轉移;另一方面, NKT細胞下調機體的免疫監視功能,從而導致腫瘤的發生。因此,增強 NKT細胞的抗腫瘤免疫應答以及抑制 NKT細胞下調機體的免疫監視功能是未來利用 NKT細胞進行抗腫瘤治療時需要解決的問題。

2.3通過啟動 NKT細胞恢復腫瘤微環境中的免疫衰竭

在腫瘤微環境中,往往由於 T細胞和 NK細胞功能低下而處於免疫衰竭狀態,其特點是 T細胞和 NK細胞表面共抑制受體 PD-1、Tim-3、LAG3等高表達,這些 T細胞和 NK細胞在增殖和免疫效應功能方面存在缺陷。然而 ,最近發現 α-GalCer介導啟動的 NKT細胞可以有效逆轉衰竭的免疫細胞的功能。進一步的研究表明 ,α-GalCer介導啟動的 NKT細胞不僅重新啟動了 NK細胞,也啟動了 CD8+T細胞。 α-GalCer具有強大的抗腫瘤活性,但重複注射 α-GalCer也可能誘導 NKT細胞功能喪失。此外, PD-1可由 α-GalCer高度刺激誘導,理論上抗 PD-1藥物與 α-GalCer聯合治療晚期腫瘤可能是一種有效的郭偉春,等 .NKT細胞的生物特性及其在抗腫瘤免疫中的作用方法。這些結果表明, NKT細胞的啟動在克服免疫衰竭中起著至關重要的作用,提示使用 NKT細胞啟動劑在腫瘤免疫治療中具有極大的應用價值。

3 NKT細胞在臨床抗腫瘤治療中的應用

利用 NKT細胞的臨床試驗正在進行。其中一個代表性的臨床試驗是將 NKT細胞配體 α-GalCer用於啟動癌症患者中 NKT細胞的抗腫瘤作用,其Ⅰ期臨床研究中,向實體瘤患者慢速靜脈內注射不同劑量的 α-GalCer,24名患者中的 7名表現出穩定的疾病進展並且沒有嚴重的副作用。 NAGATO等還使用荷載 α-GalCer的 APC細胞進行了臨床研究,結果顯示腫瘤浸潤淋巴細胞中 NKT細胞數量顯著增加,腫瘤浸潤淋巴細胞中 IFN-γ產生增加。癌症患者中 iNKT細胞數量顯著減少。為了補充腫瘤患者體內的 NKT細胞,對晚期非小細胞肺癌患者進行了體外擴增 NKT細胞的臨床試驗。 EXLEY等用來源於外周血單個核細胞以及 IL-2和 CD3單抗擴增的自體 NKT細胞回輸到晚期黑色素瘤患者體內,結果顯示患者體內癌組織中 IFN-γ產生增加。 YAMASAKI等在頭頸部鱗狀細胞癌患者中,使用體外擴增的 NKT細胞,用 IL-2和 α-GalCer以及用 APCs脈衝的 α-GalCer進行了 Ⅱ期臨床研究, 50%的患者表現出穩定的疾病進展。這些研究表明 NKT細胞療法具有應用於臨床治療腫瘤的潛力。

4結語

腫瘤免疫治療是目前治療腫瘤最有效的手段之一。 NKT細胞的啟動不僅可以直接發揮抗腫瘤免疫作用、間接啟動多種免疫細胞,還可以啟動衰竭的 CD8+T細胞和 NK細胞,從而快速而持久地增強抗腫瘤活性。因此, NKT細胞免疫治療是目前對免疫治療耐藥癌症患者的一個良好的選擇。在體外擴增 I型 NKT細胞再回輸到患者體內的治療方式則展現出了一定的臨床療效。然而 NKT細胞療法在臨床試驗仍處於研究的初級階段,原因在於國內外開展的臨床試驗規模較小、受試者較少。臨床效果取決於多重因素,包括體外擴增數量以及在注射劑量、頻率、時相,諸多因素的干擾使得到的可行性資料較為局限,因此尚不能大規模應用於臨床。 NKT細胞可以調節其他免疫效應細胞發揮抗腫瘤作用,相信以 NKT細胞為基礎的免疫治療將為腫瘤免疫治療臨床應用開闢新途徑。